مقالة منهجية

منصة رقمية للمسامية الكهربائية الميكروفلويدية لتحرير جينوم كريسبر منخفض الإدخال ونقل mRNA في الخلايا التائية المعلقة ونماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد

DOI:

10.3791/70573

⸱

يوليو 17, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1DropGenie, 2Fida Biosystems

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تعديل الجينوم المصغر لمستقبل TCRα/β بواسطة CRISPR–Cas9 في خلايا T البشرية الأولية باستخدام 'DMF-ection'، وهو منصة إلكترونية للتحميص الكهربائي الميكروفلويدية الرقمية (DMF). تمكن الطريقة من تحرير الجينات المتوازي منخفض الإدخال مع صلاحية عالية، وهي قابلة للتكيف أكثر لتوصيل mRNA إلى الكرويدات ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح التوزيع الكهربائي للميكروفلويديك الرقمي (DMF) التلاعب الجيني الدقيق ومنخفض الحجم في الخلايا الثديية، مع تقليل مدخلات الخلايا بما يصل إلى 100 ضعف والحفاظ على البقاء. تقدم هذه الدراسة سير عمل نقل عالي الإنتاجية قائم على DMF لإزالة موقع TRAC بوساطة CRISPR في خلايا T المعلقة البشرية الأولية، وللنقل الريبي الريبي لكرويدات HEK293T ثلاثية الأبعاد. باستخدام RNA دليل كريسبر الموزعة مكانيا وتجميع الريبونوكليوبروتين (RNP) على الخراطش، تم تحقيق اضطراب فعال في مواقع TRAC في كل من مجموعات خلايا T من CD4⁺ وCD8⁺ باستخدام 10,000 خلية فقط لكل حالة، مع تجاوزت صلاحيات ما بعد التحرير 85٪. كشفت التوصيف الفيزيائي الحيوي باستخدام تحليلات التشتت المحفز بالتدفق وتايلور أن إضافات البوليمرات تستقر مركبات Cas9–sgRNA تحت ظروف مخزن التقشير الكهربائي، مما يدعم التحرير القابل للتكرار عند أحجام أقل من ميكرولتر. تم تعديل سير العمل أكثر للتطبيقات ثلاثية الأبعاد من خلال توصيل mRNA من EGFP إلى كرويدات HEK293T سليمة، مما أدى إلى فلورة قوية وموحدة مكانيا دون التأثير على نمو أو شكل الكرويد. تظهر هذه النتائج معا أن التسامح الكهربائي في DMF يمكن من تحرير الجينوم بكفاءة وتوصيل mRNA عبر كل من الخلايا المناعية المعلقة والكرويدات متعددة الخلايا. توفر هذه المنصة حلا قابلا للتوسع ومنخفض الإدخال لتطبيقات علاج خلايا CAR-T، وعلم الجينوم الوظيفي، والنماذج الخلوية ثلاثية الأبعاد المتقدمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تحرير الجينات في الخلايا البشرية الأولية مركزيا بشكل متزايد لكل من تطوير العلاج والبحث الأساسي، بما في ذلك التطبيقات في الهندسة المناعية، ونمذجة الأمراض النادرة، والجينوم الوظيفي1. على الرغم من أن التوزيع الكهربائي يتيح تحرير جينوم عالي الكفاءة، إلا أن الأنظمة التقليدية المعتمدة على الكوفيت تتطلب عادة ما يصل إلى ملايين الخلايا في كل حالة، مما يحد من استخدامها للعينات المستمدة من المرضى ومجموعات المناعة النادرة2. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأنظمة غير مناسبة للفحص واسع النطاق بسبب محدودية في النقل والأتمتة واستهلاك الكواشف3.

برز التساميح الكهربائي الميكروفلويدي كنهج واعد لتحرير الجينوم منخفض المدخلات4. ومع ذلك، تعتمد معظم المنصات الحالية على هياكل تدفق مستمر تتضمن معالجة سوائل معقدة، ومرونة محدودة في خلط الكواشف، ومتطلبات عالية نسبيا لكل حالة لكل حالة. على النقيض من ذلك، تتيح الميكروفلويدية الرقمية (DMF) التلاعب النشط بقطرات بحجم النانولتر المنفصلة على مصفوفة أقطاب مستوية، مما يسمح بالتحكم الدقيق في تركيب التفاعل والتوقيت وتحديد الموقع المكاني. هذا التنسيق القائم على القطرات القابل للتوصيل والتشغيل مناسب جيدا لسير العمل منخفض الحجم وعالي الإنتاجية حيث يكون الحفاظ على الخلايا الأولية والكواشف أمرا ضروريا.5.

أظهرت الأعمال الحديثة جدوى التوصيل داخل الخلايا المعتمد على DMF باستخدام هياكل التقشير الكهربائي ثلاثية القطرات التي تولد مجالات كهربائية محلية منخفضة التيار لتوصيل RNP وmRNA بكفاءة مع تقليل الإجهاد الحراري والكهروكيميائي 6,7,8. استنادا إلى هذا الأساس، تم تطوير منصة الحفر الكهربائية من الجيل التالي DMF، تسمى 'DMF-ection'، والتي تضم 48 موقع تفاعل قابل للعناونة بشكل مستقل، وتوافق كامل للأتمتة، وتصنيع خرطوشات قابلة للتوسع9 (الشكل 1). تتكون خرطوشة DMF من لوحة PCB سفلية ولوحة علوية بلاستيكية مفصولة بحشية، يتم تجميعها عبر مشابك محاذاة في اتجاه صحيح واحد (الشكل 1A). يتم تنظيم تخطيط 48 ضلاعا في ثماني عائلات متطابقة (الشكل 1A–H)، كل منها يحتوي على ستة مواقع كهرباء قابلة للعناونة بشكل مستقل، تدعم حتى 48 حالة تحرير متوازية لكل خرطوشة (الشكل 1B). يتم وضع مكتبات RNA التوجيهية على سطح الركيزة باستخدام موزع صوتي قبل تجميع الخرطوشة. تم تأكيد دقة الترسيب الموضعية عبر جميع المواقع ال 48، مع تجمع مواقع الإسقاط ضمن انحراف أقل من المليمتر عن منتصف القطب (الشكل 1C)، مما يدعم تجميع RNP موثوق على الخرطوشة. بعد التحميل، يتم تشغيل الخلايا وقطرات الأقطاب السائلة على الخرطوشة لتشكيل هندسة التقميم الكهربائي ثلاثي القطرات (الشكل 1D). بعد التسامح الكهربائي، يتم تفريغ الخلايا في ألواح الزراعة للاسترجاع والتحليل في المراحل النهائية، بما في ذلك قياس خلوية التدفق، والتتابع، والمجهر (الشكل 1E). يتيح هذا النظام تحرير الجينوم عالي الكفاءة باستخدام خلية أقل بحوالي 100 ضعف مقارنة بالطرق التقليدية المعتمدة على الكوفيت، مما يوسع بشكل كبير الوصول إلى هندسة الجينوم في التطبيقات منخفضة الإدخال وعالية الإنتاجية.

تقيم هذه الدراسة أداء المنصة من خلال توصيل عدة شحنات حيوية جزيئية، بما في ذلك مجمعات mRNA وCRISPR–Cas9 (RNP)، مما يحقق عملية نقل فعالة وتعطيل جيني. بالإضافة إلى الخلايا التائية الأولية، يوفر DMF-ection إطارا قابلا للتعميم لتوصيل الأحماض النووية إلى هياكل متعددة الخلايا المعقدة. تفرض الكرويدات ثلاثية الأبعاد (3D) ونماذج النوع العضوي حواجز كبيرة أمام اختراق الكواشف بسبب بنيتها وهشاشتها، وغالبا ما تؤدي طرق التحليل الكهربائي التقليدية إلى تعطيل الشكل أو تولد توصيلا غير متجانس. لتقييم ما إذا كانت نفس مبادئ التقميم الكهربائي المصغرة المستخدمة في تحرير الخلايا التائية تمتد إلى الأنسجة المنظمة، تم تطبيق سير عمل DMF على الكرويدات ثلاثية الأبعاد HEK293T. أظهرت هذه التجارب أن الترطيب الكهربائي القائم على DMF يمكنه تموضع الكريات السليمة بلطف ضمن هندسة القطرات الثلاثية ودعم توصيل mRNA بشكل منتظم مع الحفاظ على البنية والنمو. على الرغم من أن هذه النتائج خارج بروتوكول الخلايا التائية الأساسي الموضح هنا، إلا أنها توضح التطبيق الأوسع للتعرض الكهربائي للديناميكية القابلة للبرمجة في أنظمة الخلايا ثلاثية الأبعاد الناشئة ذات الصلة باكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على الخلايا التائية البشرية الأولية المستخدمة في هذا البروتوكول من موردين تجاريين بموافقة متبرع مستنيرة ووفقا للإرشادات المؤسسية والأخلاقية والتنظيمية المعمول بها. تم إجراء جميع عمليات التعامل مع المواد البيولوجية المشتقة من الإنسان وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية. الباحثون الذين ينفذون هذا البروتوكول مسؤولون عن ضمان أن استخدامهم للخلايا البشرية الأولية يتوافق مع متطلبات لجنة المراجعة المؤسسية المحلية (IRB) أو لجنة الأخلاقيات، واللوائح المعمول بها للسلامة البيولوجية، وأي تشريعات وطنية أو إقليمية ذات صلة تحكم استخدام المواد البيولوجية البشرية. لم تكن هناك معلومات يمكن التعرف عليها من قبل المريض مرتبطة بالمادة الخلوية المستخدمة في هذه الدراسة.

1. تحضير وتنشيط الخلايا التائية البشرية الأولية

  1. إذابة الخلايا التائية البشرية الأولية CD3⁺ بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل الخلايا إلى وسط خلايا T الأساسية المسخن مسبقا وجهاز الطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبرناتينت وأعد تعليق الحبيبات في وسط جديد.
  2. تحديد تركيز الخلايا وقابليتها للبقاء باستخدام عداد الخلايا الآلي.
  3. أعد تعليق الخلايا عند 1 ×10 خلايا /مل في وسط زراعة الخلايا التائية مع محفز محفز لتنشيط خلايا T من الجسم المضاد رباعي الذوبان CD3/CD28 (وفقا لتعليمات البائع) و200 وحدة دولية/مل IL-2. احتضن الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: حافظ على كثافة الخلايا بين 0.5–2 × 106 خلايا/مل أثناء التفعيل. قم بتنفيذ التفعيل في صفائح U-bottom 96 لتحسين الاتصال بين الخلية والمنشط وكفاءة التفعيل.

2. تحضير بقع RNA إرشادية على ركيزة DMF (رصد موزع صوتي)

  1. إعادة تكوين sgRNA المحمول بالليوفيل في مياه خالية من النوكلياز إلى تركيز مخزوني يبلغ 100 ميكرومو. في أنبوب منفصل، حضر مخزونا بسعة 100 ملغ/مل من حمض البولي-إل-جلوتاميك (PGA، ملح الصوديوم، ميغاواط 15,000–50,000 دالتون) في ماء خال من النوكليز. اجمع بين sgRNA ومخزون PGA بنسبة حجم 5:4 (sgRNA: PGA) مما ينتج تركيزا نهائيا ل sgRNA يبلغ 55.6 pmol/μL وتركيز نهائي PGA يبلغ 44.4 mg/mL في مياه خالية من النوكليز. يتم استخدام دوامة لفترة وجيزة ويقوم بالطرد المركزي عند 1,000 × جرام لمدة 30 ثانية ثم ينقل إلى أحجام للاستخدام الواحد ويخزن الأليكوات غير المستخدمة عند −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    ملاحظة: تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.
  2. أضف خليط الدليل-PGA إلى لوحة مصدر صوتية منخفضة الحجم الميت في الآبار التي تتوافق مع تخطيط موقع التفاعل المطلوب.
  3. انقل 40 نانولتر (ما يعادل 2.2 pmol sgRNA) من خليط الدليل وPGA إلى كل منطقة رصد مستهدف في ركيزة DMF باستخدام موزع صوتي معاير.
    ملاحظة: عند 55.6 بيمول / ميكرولتر، 40 نانولتر يولد 2.2 بيمول sgRNA لكل موقع (55.6 × 0.040 = 2.22 بيمول لكل مكتر). يتم إعادة تشكيل الأدلة المجففة أثناء اندماج القطرات على الخرطوشة؛ يتم تأكيد إعادة التعليق الكامل من خلال كفاءة التحرير المتسقة عبر المواقع.
  4. في خزانة السلامة البيولوجية، دع القطرات المنقطة تجف تماما في الهواء عند درجة حرارة الغرفة حتى لا يبقى سائل مرئي (حوالي 5 دقائق).
    ملاحظة: لا تستخدم تدفق الهواء القسري أو الحرارة، لأن ذلك قد يؤدي إلى تحريك أو تدهور الحمض النووي الريبي الدليل.
  5. قم بتجميع خرطوشة DMF.
    1. في خزانة الأمان البيولوجي، قم بمحاذاة اللوحة العلوية فوق الركيزة المرقطة عن طريق مطابقة ميزات التثبيت البلاستيكية غير المتماثلة من اللوحة العلوية مع الشقوق الموجودة في اللوح السفلي. طبق ضغطا متساو ومتزامنا على الحواف القصيرة حتى يتم الشعور بحدوث انكسار ميكانيكي واضح، مما يؤكد التفاعل الكامل لميزات القفل.
      ملاحظة: تم تصميم الخرطوشة باتجاه صحيح واحد؛ التجميع الخاطئ لن ينتج عنه الانقطاع. ثبت الركائز من الحواف دائما لتجنب التلوث أو تلف الأسطح الوظيفية وتجنب انزلاق الركائز على بعضها البعض لأن ذلك قد يخدش الطلاءات السطحية.
    2. نقطة التفتيش: تأكد من التجميع الصحيح بواسطة المفتاح الميكانيكي.
      ملاحظة: لا يوجد مؤشر كهربائي قبل التشغيل على سلامة الطلاء؛ يتم اكتشاف أي أعطال وظيفية ناتجة عن التجميع غير السليم تلقائيا والإبلاغ عنها في تقرير مراقبة الجودة بعد التشغيل.
      نقطة التوقف: خزن الخراطيش المجمعة غير المستخدمة في عبوة محكمة الإغلاق مع مجفف (عبوات جل السيليكا) في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 48 ساعة.

3. تحضير الخلايا

  1. تحضير 1 مل من مخزن النقل الكامل حديثا قبل كل استخدام عن طريق دمج مخزن التعرض الكهربائي المتوافق مع DMF مع المادة الفعالة غير الأيونية المتوافقة حيويا مع المادة الفعالة غير الأيونية المتوافقة حيويا بنسبة 20:1 (v/v) (مخزن التعرض الكهربائي: مادة فعالة للتوتر السطحي)، مما ينتج تركيزا نهائيا للمادة الفعالة السطحية 0.05٪ (v/v). اخلط بلطف وحافظ على الثلج.
    ملاحظة: مخزن النقل المتوافق مع DMF المستخدم هنا هو عازل متساوي التوتر منخفض التوصيل (التوصيلية: 3.5 مللي سيث/سم، الأسمولالية: 305 موسيلم/لتر). يجب على الباحثين الذين يستخدمون المخازن البديلة التحقق من التوافق مع تفعيل DMF وإمكانية بقاء الخلية. المادة الفعالة غير الأيونية المتوافقة حيويا تعمل على تقليل تثبيت القطرات؛ إذا لم يستخدم المادة الفعالة المقدمة، فهناك بديل مناسب.
  2. اغسل الخلايا التائية المنشطة مرة واحدة باستخدام محلول النقل (الذي لا يحتوي على مادة خافضة للتوتر السطحي). يتم الطرد المركزي عند 180 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم استنشاق الفائق الفائق، وإعادة تعليق الحبيبات الخلوية في مخزن النقل الكامل (يحتوي على مادة خافضة التوتر) عند 1.0 × 107 خلايا/مل بحجم إجمالي 100 ميكرولتر لكل خرطوشة. ابق على الجليد.
  3. قبل التحميل مباشرة على الخرطوشة، أضف نوكلياز Cas9 مباشرة إلى 100 ميكرولتر من تعليق خلية T وامزجه بعمل عمل مزج لطيف؛ ابق على البرد.
    ملاحظة: بالنسبة لخلايا T الأساسية، يتم تحميل Cas9 بقوة 42 pmol لكل حجم خرطوشة 100 ميكرولتر (0.42 بيومول/ميكرولتر). كل موقع للتسامية الكهربائية يعالج حوالي 1 ميكرولتر من تعليق الخلية، مما يوفر 0.42 ميكرومول Cas9 لكل تعديل. قم بتحسين هذه الجرعة عند التكيف مع أنواع الخلايا المناعية الأخرى (انظر الجدول 1).
المكونالتركيز النهائي لكل تعديل
Cas90.42 pmol في قطرة ~1 ميكرولتر
sgRNA2.1 pmol (من نقطة 40 نانوتاترول)
PGAمخزون 44.4 ملغ/مل في خليط البقع
المادة السطحية0.05٪ (صوت/ضج)
مدخلات الخلايا~10,000 خلية

الجدول 1: جدول ملخص للتركيزات النهائية في كل قطرة تحويل.

4. النقل على منصة DMF-ection

  1. باستخدام ماصة متعددة القنوات، يتم توزيع 10 ميكرولتر من خليط خلية T/Cas9 في كل من منافذ تحميل الخلايا الثمانية، و10 ميكرولتر من مخزن النقل الكامل إلى 16 منفذ تحميل للأقطاب السائلة (كما هو موضح في الشكل 1).
  2. اضبط الجهد إلى 500 فولت، مدة النبضة إلى 3 مللي ثانية، وعدد النبضات إلى 2. ابدأ تسلسل التربية الكهربائية وفقا لتعليمات المنصة.
    1. نقطة التفتيش: راجع تقرير مراقبة الجودة بعد الجولة مباشرة بعد التشغيل. الأعطال المتقطعة (<10٪ من المواقع) لا تتطلب تدخلا. إذا كانت الأعطال منهجية، استبدل الخرطوشة بلوحة مراقبة الجودة المرفقة، وقم بإجراء فحص صحة النظام (~2 دقيقة)، وتواصل مع الدعم الفني إذا استمرت المشاكل.

5. تفريغ واستعادة الخلايا التائية المعدلة

  1. باستخدام معالج سائل، نقل الخلايا الكهربائية من كل موقع تفاعل إلى صفيحة U-bottom بسعة 96 بئر تحتوي على 150 ميكرولتر من وسط خلايا T القاعدية المسخن مسبقا مع 200 IU/mL IL-2.
  2. احتضن الخلايا لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO₂ للسماح بتغير تغير البروتين وتعبير المستقبلات السطحية.

6. تحليل قياس التدفق الخلوي لضربة TRAC

  1. نقل الخلايا إلى صفيحة سفلية مخروطية معقمة بسعة 96 بئر لتقليل فقدان الخلايا بين الغسلات. غسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن تدفق الخلايا الخلوي (1× PBS، 2٪ FBS، 2 mM EDTA) عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الفائقة عن طريق عكس الصفيحة المخروطية القاعية بلطف. ستبقى الخلايا متجمعة في اللوحة.
  2. حضر خليط رئيسي لصبغ السطح يحتوي على أجسام مضادة ل CD4 ومضاد CD8 ومضاد TCRα/β في مخزن تدفق الخلايا بتركيزات موصى بها من الشركة المصنعة. أضف 25 ميكرولتر من الخليط الرئيسي لكل بئر واحتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء. اغسل مرتين ب 1× PBS (بدون FBS) عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1× PBS يحتوي على صبغة قابلة للحياة عند 1:1,000 (v/v) وحضن الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
    ملاحظة: الصفائح القاعية المخروطية فعالة في تكوين الخلايا الحبيبية؛ تأكد من أن الخلايا معلقة بشكل جيد في جميع الخطوات.
  3. غسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن تدفق الخلايا وإعادة تعليقها في 150–200 ميكرولتر لكل عينة للجمع.
  4. قم بتكوين جهاز قياس الخلايا باستخدام خطوط الليزر المناسبة ومجموعات المرشحات للفلوروكروم المستخدمة (مثل الإثارة 488 نانومتر لصبغة القابلية للحياة؛ 405 نانومتر أو 488 نانومتر لعلامات السطح حسب الحاجة). اضبط الفولتية باستخدام ضوابط تعويض الصبغة الواحدة وعينة غير مصبوغة. اجمع ما لا يقل عن 5,000 حدث سينغلت حي لكل عينة. البوابة متسلسلة: الخلايا المنفردة → الخلايا الحية (صبغة العيش سالبة) → CD4⁺ أو CD8⁺ → تعبير TCRα/β.
    ملاحظة: في الظروف القياسية، يمكن أن يتراوح إجمالي الأحداث الحية المكتسبة من 5,000 إلى أكثر من 10,000 لكل عينة بعد فقدان أثناء الغسل والتلوين، نظرا لأن الخلايا قد أتيحت لها وقت للتكاثر.
  5. تحديد اضطراب جينات TRAC بقياس تكرار خلايا TCRα/β-سالبة داخل مجموعات CD4⁺ وCD8⁺. أبلغ عن كفاءة الإقصاء كنسبة من خلايا TCRα/β سالبة بالنسبة لبوابة المفردة الحية لكل مجموعة فرعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النتائج المتوقعة
عادة ما يؤدي التثقيف الكهربائي ل 10,000 خلية T منشطة في كل حالة إلى كفاءة >85٪ من TRAC مع صلاحية >95٪ بعد 72 ساعة من النقل. تكشف قياس التدفق الخلوي عن فقدان واضح لتلوين TCRα/β في حالة استهداف TRAC مقارنة بضوابط sgRNA غير المستهدفة (NTC) والتحكم غير المتعرض لأي مجالات كهربائية. ما لم يذكر خلاف ذلك، يمثل n عمليات DMF-ection مستقلة تجرى في أيام منفصلة. تم حساب التكرارات التقنية من نفس الشريط قبل التحليل الإحصائي ولا تساهم بشكل مستقل في n. جميع ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول سير عمل إلكتروني رقمي مصغر للتسخين الميكروفلويدكي يتيح التوصيل الفعال داخل الخلايا إلى الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام قطرات بحجم النانولتر. ميزة مركزية لهذه الطريقة هي القدرة على إجراء تحرير الجينوم باستخدام 10,000 خلية فقط في كل تفاعل، مما يقلل بشكل كبير من متطلبات المواد مقارنة بالتقميم الكهربائي التقليدي. تدعم بنية القطرات الأتمتة، مما يضمن معالجة الكواشف القابلة لإعادة الإنتاج وتجميع التفاعل عبر مواقع متوازية متعددة.

في دراسات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.A.P، H.S، P.Q.N.V، A.B.C، A.E، M.W، وA.H هم إما موظفون حاليون أو سابقون، أو مساهمون في DropGenie. إم إس إما موظف حالي أو سابق أو مساهم في شركة FIDA Biosciences. المؤلفون الآخرون ليس لديهم مصالح متنافسة ليعلنوا عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جون فولر، مورغان، وبيكمان كولتر لايف ساينسز (BCLS) على الدعم اللوجستي وتطوير البروتوكولات مع موزع ECHO الصوتي. نشكر ميتشل كوزاكوف في منشأة الفحص ICCB-لونغوود بكلية الطب بجامعة هارفارد على البنية التحتية والموارد التقنية. منشأة KNMRC في جامعة نورث إيسترن لخدمات الغرف النظيفة. يرغب المؤلفون في شكر لورا شومات من كيتك، وكذلك مجموعة شاكوتيس المحدودة. تم توفير تمويل التدريب العملي للطلاب بسخاء من قبل مركز ماساتشوستس لعلوم الحياة (علوم الحياة الجماعية). وقد دعم هذا العمل جزئيا أيضا من قبل MEDTEQ+، الذي ساهم في تطوير المنصة والتحقق من صحتها. ونشكر أيضا الدكتور ستيف إس. شي من جامعة كونكورديا

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

```html

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing PipetteIntegra4732Instrumentation
1x PBSGibcoFlow Buffer 
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment SurfaceThermo Fisher174927Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate Sarstedt82.1583.001Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 AntibodyBiolegend3574211 in 200, Clone A161A1
Attune Flow CytometerThermoFisherInstrumentation
DMEM MediaGibco10564011Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible bufferDropGenieTransfection
DropGenie Transfection SystemDropGenieInstrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 SeriesBeckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead VolumeBeckman Coulter Life Scienes
EDTAInvitrogenFlow Buffer
EGFP mRNATrilinkL-7201
EVOS Fluorescent MicroscopeThermoFisherInstrumentation
Fetal Bovine SerumGibco16000044Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detectorFida Biosystems ApSInstrumentation
Ghost Dye Violet 510Cytek Biosciences13-0870
HEK293T CellsATCCSpheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,Peprotech200-02 50ugT cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T CellsAll CellsPeripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 ActivatorStemCell Technologies10970T Cell Activation media
Immunocult Expansion MediaStemCell Technologies10981T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis SystemSartoriusInstrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robotIntegra4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521), Instrumentation
non targeting synthetic guide RNASynthego5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant AntibodyBiolegend3808051 in 200, Clone QA20B12 
PE-Cy 7 Anti-Human CD8BD Pharmingen5577501 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)Sigma AldrichP4761-100MGUse a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0GraphPad Software, Inc.Software
sNLS-SpCas9-sNLS NucleaseIDT10017687
Spheroid MicroplateCorning3830Spheroid protocol
Surfactant FDropGenieTransfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNASynthego5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25-300-062Spheroid protocol
```

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roth, T. L., Puig-Saus, C., Yu, R., Shifrut, E., Carnevale, J., et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nat Biotechnol. 36 (4), 285-297 (2018).
  2. Li, L. H., McCarthy, P., Hui, S. W. High-efficiency electrotransfection of human primary hematopoietic stem cells. FASEB J. 15 (1), 159-167 (2001).
  3. Parnas, O., Jovanovic, M., Eisenhaure, T. M., Herbst, R. H., Dixit, A., et al. A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell. 162 (3), 675-686 (2015).
  4. Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
  5. Pollack, M. G., Fair, R. B., Shenderov, A. D. Electrowetting-based actuation of liquid droplets for microfluidic applications. Appl Phys Lett. 77 (11), 1725-1726 (2000).
  6. Sinha, H., Quach, A. B. V., Vo, P. Q. N., Shih, S. C. C. An automated microfluidic gene-editing platform for deciphering cancer genes. Lab Chip. 18 (21), 3291-3301 (2018).
  7. Little, S. R., Rizzetto, S., Sherwood, C. A., Quach, A. B. V., Shih, S. C. C. A tri-droplet liquid structure for highly efficient intracellular delivery in primary mammalian cells using digital microfluidics. Adv Mater Technol. 8 (11), 2300719 (2023).
  8. Little, S. R., Vo, P. Q. N., Sinha, H., Shih, S. C. C. A digital microfluidic platform for the microscale production of functional immune cell therapies. Anal Chem. 97 (21), 11026-11034 (2025).
  9. Patel, M. A., Boribong, B. P., Sinha, H., Xiao, B., Xie, K., et al. Miniaturized scalable arrayed CRISPR screening in primary cells enables discovery at the single donor resolution. Sci Rep. 15, 29350 (2025).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Nguyen, D. N., Roth, T. L., Li, P. J., Chen, P. A., Apathy, R., et al. Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency. Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233 JoVE
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة