مقالة منهجية

قياس ديناميكيات ترجمة mRNA في الخلايا الحية باستخدام الوسم اللامع المنقسم في خلايا HEK293

DOI:

10.3791/70840

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا طريقة مرنة ومتوافقة مع الإنتاجية العالية لقياس ديناميكيات ترجمة mRNA الحي في الخلايا (in cellulo) في خلايا HEK293s، وذلك باستخدام الوسم اللامع المنقسم. يميز هذا المقاييس متعدد الاستخدامات التأثيرات الهيكلية، ويدعم تحسين النسخ في المختبر (in vitro)، ويسهل تطوير العلاجات القائمة على mRNA.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهر التطوير السريع للقاحات لمكافحة COVID-19 إمكانات علاجات الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) في إحداث نقلة نوعية في تطوير الأدوية. ومثل mRNA الناضج، يمتلك mRNA المنسوخ in vitro العناصر نفسها، بما في ذلك القبعة 5’، والمناطق غير المترجمة (UTRs)، والتسلسل المشفر، وذيل poly(A). وقد اعتمدت الدراسات السابقة التي بحثت في تأثيرات هذه المكونات على ترجمة mRNA بشكل أساسي على بروتينات مراسلة مهندسة للغاية تظهر كفاءة في الترجمة واستقراراً بروتينياً. ونظراً لأن العناصر الهيكلية لكل mRNA تؤثر بشكل متفاوت على ترجمتها، فمن الضروري تحديد التصميم الأمثل المرتبط بالبروتين المستهدف (POI) العلاجي. ولتمكين توصيف ترجمة البروتين المستهدف، تم استخدام نظام تكامل لوسيفيراز منقسم. حيث يرتبط وسم ببتيدي قصير (HiBiT)، والذي يمكن دمجه في أي من طرفي البروتين المستهدف، مع heterodimer المكمل له (LgBiT) لاستعادة النشاط الإنزيمي في وجود ركيزة نفاذة للخلايا. وحتى الآن، استُخدم الوسم المضيء المنقسم بشكل أساسي في دراسات معدل دوران البروتين ذات الإنتاجية العالية. وقد سبق لنا أن أثبتنا كيف يمكن توظيف الوسم المضيء المنقسم لتمكين القياس الكمي عالي الإنتاجية لترجمة mRNA زمنياً in cellulo في خلايا HEK293 التي تعبر بشكل بنيوي عن heterodimer المكمل. وهنا، نوضح بشكل أكبر تعدد استخدامات هذا المقايسة ونفصل كيف يمكن توظيفها لتحسين النسخ in vitro لخفض التكاليف. ويمكن لنظام المقايسة هذا التمييز بشكل فريد بين التغيرات في المكونات الهيكلية مع تسليط الضوء على تأثيرات تحسين التسلسل المشفر باستخدام جينات غير مهندسة. بالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن خفض تركيز القبعة 5’ بمقدار 4 أضعاف في النسخ in vitro يؤدي إلى ترجمة مكافئة in cellulo. وتوضح هذه النتائج كيف يمكن دمج الوسم المضيء المنقسم بسهولة في سير عمل علاجات mRNA، مما يسمح بمراقبة ديناميكيات التعبير البروتيني المدفوع بـ mRNA في الوقت الفعلي in cellulo، وبالتالي توفير طريقة متعددة الاستخدامات للنهوض بالعلاجات القائمة على mRNA.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توسعت العلاجات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) وتطبيقاته البحثية بشكل سريع في السنوات الأخيرة، مدفوعة بنجاح لقاحات mRNA1,2 والاعتراف المتزايد بتعدد استخدامات RNA كجزيء حيوي قابل للبرمجة. ويتمثل التحدي المركزي في هذا المجال في القدرة على تقييم كفاءة ترجمة mRNA كمياً وديناميكياً في سياقات متنوعة. وتوفر الطريقة الموضحة هنا -والتي تعتمد على نظام وسم لومينيسنتي منقسم- منصة مرنة وقابلة للتوسع لدراسة ترجمة mRNA الحية in cellulo3. والهدف العام من هذه الطريقة هو تمكين الباحثين من قياس كيفية تأثير ميزات التسلسل، والتعديلات الكيميائية، والعناصر الهيكلية على حركية الترجمة ومعدل دوران البروتين اللاحق، مما يوفر أداة قوية لتحسين تركيبات mRNA للتطبيقات العلاجية والعلوم الأساسية.

In vitro يحاكي الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) المنسوخ مخبرياً البنية الأساسية للنواتج النسخية الناضجة، حيث يشتمل على غطاء 5′، ومناطق غير مترجمة (UTRs)، وتسلسل مشفر، وذيل poly(A)، بينما يتضمن غالباً نيوكليوتيدات معدلة لتقليل الاستمناع4,5. وقد أظهرت أعمال مكثفة أن كل عنصر من هذه العناصر -سواء بمفرده أو مجتمعاً مع غيره- يمكن هندسته للتأثير بقوة على كفاءة الترجمة وإنتاج البروتين6,7. ومع ذلك، اعتمدت معظم الدراسات السابقة على بروتينات مراسلة محسنة للغاية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)7، أو NanoLuc8، أو بروتين spike الخاص بفيروس SARS-CoV-28,9، والتي تمت هندستها لتُترجم بكفاءة عالية ولتنتج بروتينات مستقرة جداً، وبالتالي فهي لا تعكس التحديات التي تواجه السياقات العلاجية. ونظراً لأن جزيئات mRNA العلاجية تشفر بروتينات اهتمام (POIs) متنوعة، يخضع كل منها لقيود هيكلية فريدة وتنظيم خاص بنوع الخلية، فإن مبادئ التصميم التي تزيد من الترجمة لبنية معينة قد لا تعمم على بنية أخرى، كما تم الإبلاغ عنه سابقاً3. لذا، فإن تحديد التكوين الأمثل لبروتين اهتمام علاجي معين يعد أمراً ضرورياً، ويتطلب طرقاً يمكنها تقييم مدى مساهمة السمات الفردية للناتج النسخي في إنتاج البروتين بشكل حساس ومنهجي.

تُميز الطرق التي تركز على الريبوسومات، مثل تحليل تعدد الريبوسومات (polysome profiling)، أجزاء الترجمة من خلال الطرد المركزي المتدرج10، بينما يوفر تحليل الريبوسومات (Ribo-seq) دقة على مستوى النيوكليوتيدات لشغل الريبوسومات ومواقع البدء والتوقف11. وعلى غرار Ribo-seq، تعمل نهج أخرى قائمة على التسلسل مثل التسلسل عالي الإنتاجية للحمض النووي الريبوزي المعزول عن طريق الترسيب المناعي للروابط المتقاطعة (HITS-CLIP) وتنقية تقارب الريبوسومات المترجمة (TRAP) على توصيف ترجمة الحمض النووي الريبوزي المرتبط بالبروتينات الرابطة للحمض النووي الريبوزي أو المرتبطة بالريبوسومات12. ورغم قوتها، تتطلب هذه التقنيات تحضيراً معقداً ومعدات متخصصة وخبرة حاسوبية، مما يجعلها غير مناسبة لتطوير الـ mRNA العلاجي عالي الإنتاجية. ويقوم الترسيب المناعي للسلسلة الناشئة13 بقياس كفاءة الترجمة باستخدام بروتينات موسومة بـ FLAG يتم ترسيبها مناعياً من الريبوسومات وتقدير كميتها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR). ومع إمكانية تكييف هذا المقايسة مع الـ mRNAs العلاجية، إلا أنها تتطلب مجهوداً عضلياً كثيفاً، وتفتقر إلى الدقة الزمنية، وغير مناسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية. ويوفر نظام SunTag14 قياسات حية داخل الخلايا لمخرجات تخليق البروتين والتنظيم الترجمي من جزيئات mRNA مفردة، ويعمل من خلال تفاعل شظية متغيرة أحادية السلسلة (scFv) مدمجة مع GFP مع تكرارات ترادفيّة للحاتمة الببتيدية. يتيح هذا النظام قياسات ديناميكية للترجمة والتوطين بدقة جزيء mRNA واحد، وبالتالي فقد تم استغلاله لتطوير العديد من أنظمة تتبع السلاسل الناشئة15,16. ومع ذلك، فإن هذا النهج منخفض الإنتاجية ويتطلب استخدام مجاهر عالية القوة.

بينما لا يمكن تجنب وسم البروتين الناشئ، فقد تم تحديد الاستخدام المحتمل لوسم ببتيدي صغير، مشتق من لوسيفيراز NanoLuc، للإبلاغ عن ترجمة mRNA في الخلايا الحية. تم هندسة NanoLuciferase لتقسيمه إلى وحدة فرعية صغيرة مكونة من 11 حمضاً أمينياً (HiBiT) ووحدة فرعية أكبر مكونة من 158 حمضاً أمينياً (LgBiT)، واللتان يمكنهما التماثر بسرعة، وبوجود الركيزة، إعادة تكوين لوسيفيراز وظيفي17,18. هناك عدة مزايا رئيسية لنظام الوسم المضيء المقسم لدراسات ديناميكيات mRNA. أولاً، يسمح الحجم الضئيل للوحدة الفرعية الصغيرة المدمجة مع البروتين المستهدف (POI) ببقاء البنية المشفرة أقرب ما يمكن إلى البروتين الأصلي المستهدف. وبما أن طول التسلسل المشفر يمكن أن يؤثر بشكل مباشر على نسب الترجمة19، فإن تقليل طول الوسم يحسن من توقعاتنا لديناميكيات ترجمة mRNAs الاصطناعية. ومن الأهمية بمكان أن استراتيجية الوسم الضئيلة هذه تمكن من اكتشاف الاختلافات في الترجمة الناتجة عن تباين التسلسلات المشفرة المترادفة، مما يسمح باستقصاء كفاءة الترجمة بشكل مستقل عن تسلسل البروتين أو استقراره3. لهذا السبب، يعتبر استخدام الأوسمة الأكبر، مثل البروتينات الفلورية أو اللوسيفيرازات كاملة الطول، غير مثالي. ثانياً، يتيح نظام الوسم المضيء المقسم المستخدم هنا توليد إشارة فورية. حيث أن تفاعل التكملة السريع والفعال in cellulo يتمتع بتقارب عالٍ مسجل (KD = 700 pM) وقد استُخدم لقياس تعديل turnover البروتين بقراءات قصيرة تصل إلى كل 30 s18. وبينما تم قياس نظام الوسم المضيء المقسم الأصلي بشكل أساسي مقارنة بأنظمة لوسيفيراز مقسمة أخرى17,18، فإن الميزة الرئيسية في هذا السياق هي أن توليد الإشارة لا يتقيد بنضوج البروتين. وفي المقابل، تتطلب البروتينات الفلورية نضوجاً للكروموفور، والذي قد يستغرق من دقائق إلى ساعات20، مما يحد من الدقة الزمنية. أخيراً، يتجاوز نظام الوسم المضيء المقسم المعتمد والمستخدم هنا قيود أنظمة البروتين الفلوري المقسمة، والتي تتطلب عادةً تكوين الكروموفور بعد التكملة21، مما يتسبب في تأخير إضافي ويحد من ملاءمتها لالتقاط العمليات الديناميكية السريعة. وقد أثبتت الدراسات السابقة فائدة الوسم المضيء المقسم في مقايسات turnover البروتين ودراسات التحلل22,23,24. ويمثل توسيع هذه التكنولوجيا المعتمدة لتشمل حركية الترجمة تقدماً منهجياً كبيراً. على سبيل المثال، بينما يمكن أن يكشف تحديد مواقع الريبوسومات (ribosome profiling) عن كثافة الريبوسومات على طول النسخ، إلا أنه لا يمكنه بسهولة التقاط التغيرات الديناميكية في معدلات بدء أو استطالة الترجمة تحت ظروف مختلفة. وكما تم توضيحه سابقاً3، يمكن لنظام الوسم المضيء المقسم هذا اكتشاف الاختلافات عند تغيير بنية الغطاء (cap structure)، وتكوين المنطقة غير المترجمة 5′ (UTR)، وتحسين الكودونات، وتعديلات النيوكليوتيدات، وطول ذيل poly(A)، وكلها محددات حرجة لكفاءة الترجمة. وهذا النطاق من القابلية للتطبيق يجعل هذه الطريقة قوية بشكل فريد لتشريح مساهمات الميزات الفردية لـ mRNA في إنتاج البروتين الإجمالي. ومن الجدير بالذكر أنه، اعتماداً على الجهاز المستخدم، يمكن التقاط بيانات الخلية الواحدة والبيانات الخاصة بالبئر الكاملة باستخدام هذه التكنولوجيا. كما أن منصات التصوير القادرة على الحصول على صور قائمة على الإضاءة الحيوية يمكن أن تمكن من استخدام هذه التكنولوجيا لدراسة ديناميكيات ترجمة الخلية الواحدة. وهنا، نركز على تطبيق قائم على الآبار باستخدام قارئ الأطباق، نظراً لطبيعته ذات الإنتاجية المتوسطة إلى العالية ومتطلباته الدنيا لتحليل البيانات.

ينبغي للباحثين الذين يفكرون في استخدام هذه الطريقة تقييم مدى ملاءمتها في ضوء أهدافهم التجريبية المحددة. وتكتسب هذه المقايسة قيمة خاصة في السياقات التي تتطلب فحصاً عالي الإنتاجية لبنى mRNA الاصطناعية، كما هو الحال في مسارات تصميم العلاجات القائمة على mRNA. وهي مناسبة تماماً للتحليلات المقارنة لخصائص تتابعات mRNA الاصطناعية - بما في ذلك المناطق غير المترجمة، أو استخدام الكودونات، أو تعديلات النيوكليوتيدات - حيث يمكن اكتشاف الاختلافات الطفيفة في كفاءة الترجمة3. وبما أن النظام يتوافق مع منصات الترجمة الخالية من الخلايا، ومقاييس الخلايا الحية، ومقاييس التحلل الخاصة بنقاط زمنية محددة، فإنه يوفر مرونة للباحثين الذين يرغبون في تفصيل تصميمهم التجريبي سواء للدراسات الميكانيكية أو البحوث التطبيقية. وفي الوقت ذاته، من المهم إدراك حدود هذه التقنية؛ فمن الناحية النقدية، لا توفر مقايسة الوسم المضيء المنقسم دقة في تحديد إشغال الريبوسوم، وهي قدرة تظل فريدة في مناهج بصمة الريبوسوم، كما أنها لا تقيس استقرار RNA أو تحلله بشكل مباشر، وهو ما قد يتطلب تقييمه باستخدام طرق تكميلية. ومع ذلك، ونظراً لمحدودية التقنيات الحالية المرتكزة على الريبوسوم، يعتمد الباحثون على المقاييس القائمة على الوسوم مثل نظام الإضاءة المنقسم لاستقصاء تعبير البروتين المدفوع بـ mRNA والمحدد زمنياً كبديل لديناميكيات الترجمة. وبناءً على ذلك، فبينما يعد هذا النظام أداة قوية لمراقبة تعبير البروتين المدفوع بـ mRNA الاصطناعي، فإن ملاءمته تعتمد على ما إذا كان سؤال البحث يركز على مخرجات البروتين الديناميكية بدلاً من تحديد موضع الريبوسوم الدقيق أو تحلل RNA.

باختصار، يمثل نظام الوسم المضيء المنقسم طريقة قوية ومتعددة الاستخدامات لدراسة ترجمة mRNA. ويتمثل هدفه العام في تزويد الباحثين بأداة مرنة، وقابلة للتوسع، وعالية الإنتاجية، وقادرة على اكتشاف الاختلافات في إنتاج البروتين الناتجة عن mRNA اصطناعي يحتوي على عناصر هيكلية وتسلسلية متنوعة3. وتكمن الغاية من تطويره في التغلب على قيود التقنيات الحالية، مما يوفر مزايا من حيث الحساسية، وقابلية التوسع، والدقة الزمنية. وبموضعه ضمن الأدبيات الأوسع حول بيولوجيا RNA والعلاجات الجينية، يشكل هذا الأسلوب إضافة قيمة للمجموعة التجريبية، مما يتيح تحقيق رؤى أساسية وتقدمات ترجمية. ومن خلال النظر بعناية في نقاط القوة والقيود الخاصة بهذا المقايسة، يمكن للباحثين تحديد مدى ملاءمتها لتطبيقاتهم المحددة، وبذلك يتم تعظيم تأثيرها في مجال علوم RNA سريع التطور.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر تمثيل رسومي للبروتوكول كاملاً في الشكل 1.

1. تحضير القالب لعملية النسخ in vitro (IVT)

ملاحظة: لإعداد قالب DNA لعملية IVT، تأكد من أن DNA البلازميد يحتوي على محفز RNA polymerase (عادةً T7 أو SP6)، والمناطق غير المترجمة (UTRs) عند الطرفين '5 و '3، وإطار القراءة المفتوح للبروتين المراد دراسته POI (الشكل 1).

  1. قم بعملية خطية للحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) باستخدام إنزيم قطع يحتوي على موقع قطع واحد يقع بعد المنطقة غير المترجمة 3’ UTR، وجهز التفاعل وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد الحضانة، قم بتنقية تفاعل الهضم الإنزيمي باستخدام طقم تنقية الحمض النووي المعتمد على أعمدة الدوران (spin column). قم بقياس كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  2. لتأكيد عملية الخطية، جهز هلام أغاروز TAE بتركيز 1% يحتوي على صبغة الحمض النووي بروميد الإيثيديوم (Ethidium Bromide) بتركيز 0.1 µg/mL. امزج 150 ng من الحمض النووي المهضوم مع الماء وصبغة التحميل. قم بتحميل هلام الأغاروز بالعينة، والبلازميد غير المقطوع، وسلم الحمض النووي (DNA ladder)، ثم قم بتشغيل هلام الأغاروز عند 100 V لمدة 40 min في محلول منظم 1× Tris-acetic acid-EDTA (TAE). قم بالتصوير باستخدام جهاز تصوير الهلام.
    تنبيه: محلول بروميد الإيثيديوم مادة مطفرة قوية وتتطلب مناولة حذرة باستخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE) المناسبة.
  3. إذا كان الحمض النووي البلازميدي لا يحتوي على ذيل poly(A) مباشرة بعد المنطقة 3’ UTR، قم بإدخاله باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسلة (PCR). أكمل تفاعل PCR وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام بوليميراز عالي الدقة مع بادئات مصممة بشكل مناسب. تأكد من أن الناتج التضخيمي (amplicon) يتضمن محفز T7، وإطار القراءة المفتوح (open reading frame)، وذيل poly(A).
    ملاحظة: قد تتطلب تقنيات وضع الغطاء (Capping technologies) تسلسلات محددة عند محفز T7؛ لذا يمكن تلبية هذه المتطلبات من خلال التصميم المناسب للبادئ الأمامي. يرتبط البادئ العكسي بنهاية المنطقة 3’ UTR ويقوم بإدخال ذيل poly(A) (الطول الموصى به 80 T على الأقل). بالنسبة للمركبات التي تحتوي على نسبة عالية من GC، يوصى باستخدام PCR تدريجي (step-up PCR) و/أو 3% DMSO.
  4. لتأكيد نجاح تفاعل PCR، جهز هلام أغاروز TAE يحتوي على بروميد الإيثيديوم (راجع الخطوة 1.2). إذا كان طول المركب ≥1 kb أو <1 kb، جهز هلاماً بتركيز 1% أو 2% على التوالي. امزج 5 µL من تفاعل PCR مع الماء وصبغة التحميل. قم بتحميل هلام الأغاروز بكل من العينة وسلم الحمض النووي، وقم بتشغيله عند 100 V لمدة 40 min في محلول TAE المنظم. قم بالتصوير باستخدام جهاز تصوير الهلام.
  5. بعد تأكيد حجم ناتج PCR، قم بتنقية تفاعل PCR باستخدام طقم تنقية الحمض النووي المعتمد على أعمدة الدوران. قم باستخلاص الناتج في 15–20 µL من محلول الاستخلاص (الذي غالباً ما يتوفر مع طقم تنقية الحمض النووي) أو ماء خالٍ من النيوكلياز لتركيز قالب الحمض النووي لاستخدامه في النسخ في المختبر (IVT). قم بقياس كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

2. النسخ In vitro

  1. قبل البدء، قم برش ومسح منضدة العمل والقفازات والماصات بمحلول لإزالة تلوث RNase. ولتحسين الإنتاجية والجودة، قم بإجراء هذا الإجراء في بيئة غطاء معقمة.
  2. قم بإذابة وتجميع مكونات مجموعة نسخ RNA في المختبر (IVT) المعتمدة على T7 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يوصي بعض المصنعين باستخدام dithiothreitol (DTT, 0.1 M) للحد من أكسدة التفاعل وتحسين الكفاءة. يوصى بهذه الخطوة عندما تكون متوافقة مع المجموعة المستخدمة. في حالة استخدام dNTPs معدلة، استبدل النوكليوتيد غير المعدل المكافئ بنفس الكمية من النوكليوتيد المعدل. قم بتقييم الإنتاجية من نصف تفاعل، حيث لم يُلاحظ أي تحسن كبير في الإنتاجية من تفاعل كامل. عند تخليق أكثر من جزيء mRNA واحد، يوصى بإنشاء مزيج رئيسي (master mix) لتقليل أخطاء الماصات والتباين.
  3. استخدم الماصة للتحميل ثم امزج العينة جيداً ولفترة وجيزة، ثم حضنها عند 37 °C لمدة 5 h مع غطاء مسخن لتجنب التكثيف. يمكن تمديد فترة التحضين لليلة كاملة إذا لزم الأمر، حيث أن لهذا تأثير ضئيل على إنتاجية mRNA أو سلامته.
  4. أضف 1 µL من DNase I وامزج جيداً بالماصة. حضن العينة عند 37 °C لمدة 30 min.
  5. تنقية RNA المنسوخ في المختبر (in vitro)
    1. قم بتنقية تفاعل IVT باستخدام مجموعة تنظيف RNA تعتمد على الأعمدة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة (قد تؤدي المجموعات المختلفة إلى مستويات استرداد مختلفة وسعات ارتباط متفاوتة). ولعملية الاستخلاص، أضف 60 µL من ماء خالٍ من النوكلياز وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min قبل إجراء الطرد المركزي.
    2. بدلاً من ذلك، استخدم الترسيب باستخدام كلوريد الليثيوم كمنهج أقل تكلفة وأكثر مرونة.
      1. أضف حجماً مساوياً من كلوريد الليثيوم بتركيز 7.5 M إلى التفاعل، ثم امزجه وحضنه عند -20 °C لليلة كاملة.
      2. قم بإجراء الطرد المركزي عند 18,300 × g لمدة 20 min عند 4 °C، ثم قم بإزالة السائل الطافي بعناية دون تعريض كتلة RNA للاختلال.
      3. اغسل باستخدام 950 µL من الإيثانول بتركيز 70% وقم بإجراء الطرد المركزي عند 18,300 × g لمدة 5 min عند 4 °C. أزل السائل الطافي، واترك الكتلة تجف لمدة 5 min تقريباً في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليقها في ماء خالٍ من النوكلياز (60 µL هو الحجم القياسي؛ قم بتقليل الحجم حسب حجم الكتلة لزيادة التركيز).
        تنبيه: قد يسبب كلوريد الليثيوم تهيجاً للجلد أو العين في حال عدم استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. ارتدِ القفازات وواقي العين عند التعامل معه. كما أن الإيثانول سائل شديد الاشتعال ويمكن أن يسبب تهيجاً للعين. ابقِه بعيداً عن اللهب المكشوف، وارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك واقي العين.
  6. قم بقياس كمية mRNA باستخدام جهاز قياس الطيف الضوئي. تأكد من أن نسبة A260/A280 لـ mRNA تبلغ حوالي 2.0، وتأكد من أن نسبة A260/A230 تقع بين 1.8 و 2.2.
  7. لتأكيد نجاح عملية IVT، قم بتحضير هلام أغاروز بنسبة 1% في منظم TAE (غير مفكك) يحتوي على بروميد الإيثيديوم. امزج 500 ng من mRNA مع الماء وصبغة التحميل، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحضير سلم RNA وتعليمات التفكيك. قم بتحميل هلام الأغاروز وشغله عند 80 V لمدة 40 min في منظم TAE. قم بالتصوير باستخدام جهاز تصوير الهلام.
  8. لمزيد من التأكيد على الحجم الصحيح لـ mRNA، قم بتشغيل العينات على جهاز Bioanalyser.
  9. لتجنب تكرار التجميد والإذابة، قم بتقسيم mRNA إلى حصص بالحجم المطلوب للتجربة. على سبيل المثال، استخدم 1.2 pmol من mRNA لكل بئر في طبق يحتوي على 96 بئراً. بناءً على ذلك، قم بتقسيم الحجم المناسب لـ 1.2 pmol × n من المكررات، ثم خزنها عند -80 °C.

3. عملية ترانسفكشن عكسية لخلايا HEK293

ملاحظة: لإجراء قياسات زمنية، يلزم استخدام خط خلوي يعبر باستمرار عن جزء اللوسيفرير (luciferase) المكمل. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إنشاء خط خلوي مستقر من خلال ترنسفكشن (transfection) بلازميد يعبر عن جزء اللوسيفرير المطلوب، يليه اختيار نسيلة (clonal selection). وهذا يتيح للمستخدم قياس ديناميكيات ترجمة mRNA بدقة زمنية في أي خلفية خلوية مختارة. وبدلاً من ذلك، يمكن شراء خطوط خلوية تعبر عن جزء اللوسيفرير المطلوب. وقد أجريت هذه التجارب باستخدام خلايا HEK293 التي تعبر باستمرار عن heterodimer المكمل.

  1. قبل البدء، قم بإذابة mRNA على الثلج لتجنب التحلل.
  2. قم بتحضير معقدات عفن الخلايا (transfection complexes). بالنسبة لصفيحة ذات 96 بئراً، يلزم وجود 1.2 pmol من mRNA لكل بئر. في حال التشغيل بنسخ مكررة، قم بتحضير كمية تكفي لـ 2.5 نسخة مكررة للسماح بهامش خطأ في عملية السحب بالممصات. وبناءً عليه، امزج 3 pmol من mRNA مع وسط Opti-MEM Reduced Serum Medium ليصل الحجم النهائي إلى 50 µL (بواقع 20 µL/بئر).
  3. أضف 0.5 µL من كاشف عفن الخلايا القائم على الليبيد الموجب (cationic lipid-based transfection reagent) (بواقع 0.2 µL/بئر)، وامزج عن طريق السحب والضخ بالمصّة، ثم حضنه في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين لمدة 5 min، امزج عن طريق السحب والضخ بالمصّة، ثم أضف 20 µL لكل بئر في صفيحة ميكروية بيضاء ذات قاع مسطح و96 بئراً. ويُقترح وضع آبار عفن الخلايا في مركز الصفيحة، مع ترك الآبار الطرفية فارغة.
  4. قم بتحضير خلايا HEK293 عن طريق إزالة الوسط وغسلها بـ 2 mL من محلول الفوسفات المنظم للملحي (PBS) الخالي من Ca2+ و Mg2+. أزل سائل الغسيل وأضف 500 µL من Trypsin-EDTA، ثم حضنه عند 37 °C لمدة 3 min.
  5. أثناء تفكيك الخلايا، املأ الآبار الطرفية للصفيحة ذات 96 بئراً بـ PBS لتقليل تبخر الوسط أثناء زراعة الخلايا. وإذا كانت جميع الآبار مطلوبة، يمكن غمر الصفيحة بـ PBS بين الآبار.
  6. أضف 4.5 mL من وسط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) المكمل بـ 1× L-glutamine و 10% من مصل الجنين البقري (FBS) لجمع الخلايا. قم بإجراء عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) أو عداد خلايا أوتوماتيكي.
  7. انقل الكمية المطلوبة من الخلايا (ما يكفي لزرع 1 x 105 خلية لكل بئر) بالإضافة إلى 3 آبار إضافية (لهامش خطأ السحب بالمصّة) إلى أنبوب جديد وقم بالطرد المركزي عند 500 × g لمدة 2 min.
  8. أزل السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في الحجم المطلوب من وسط Leibovitz’s L-15 (الخالي من الفينول) المكمل بـ 10% FBS وركيزة Endurazine Live Cell Substrate (بنسبة 1:200) لضمان تركيز نهائي قدره 1 × 106 cells/mL. امزج باستخدام مصّة سيرولوجية لضمان المزج التام لـ Endurazine. اسحب 100 µL (بواقع 1 × 105 cells) من الخلايا المعلقة لكل بئر.
    ملاحظة: في حال إجراء تجارب السلسلة الزمنية التي تستمر لمدة 72 h، قم بزيادة الحجم إلى 200 µL لتجنب التبخر.
  9. مباشرة بعد عفن الخلايا، ضع الخلايا في قارئ الصفائح (luminometer) مضبوط على 37 °C. قم بأخذ القراءات على فترات منتظمة بزمن تكامل قدره 1 s. ونظراً للتكامل الفعال للنظام، تكون الإشارة قابلة للكشف في غضون دقائق. ولذلك، وللحصول على قراءة أساسية دقيقة، يجب تنفيذ هذه الخطوة فوراً. تعتمد هذه الفترات على التجربة والجهاز؛ ومع ذلك، في هذه التجارب، وجد أن القياس كل 12 min في تجارب السلسلة الزمنية لمدة 18 h، وكل 48 min فقط في تجارب 72 h، هو الأمر الأمثل. لا يتطلب قياس التألق الحيوي (Luminescence) مرشحاً؛ وقد لوحظت نسبة إشارة إلى ضجيج أفضل عند استخدام مرشح 530–540 nm.
    ملاحظة: يتم إنتاج إشارة نقل طاقة الرنين للتألق الحيوي (BRET) من eGFP الموّسم بـ split-luciferase، وبالتالي فإن المرشح عند 530–540 nm سيلتقط كلاً من الإشارة التألقية والفلورية. لتجنب التقاط BRET، استخدم مرشحاً عند 460–480 nm أو بدلاً من ذلك، استخدم بروتيناً غير فلوري مثل MYL3 كمرجع.

4. تحليل البيانات

  1. احسب التغيرات في طيات وحدات التألق النسبية (RLUs)، وذلك عن طريق تسوية إشارة كل حالة إلى نقطتها الزمنية الأولى (t0، التي تمت تسويتها وفقاً لمتوسط المكررات التقنية)، بما أن الإشارة في بداية المقايسة تمثل مستوى الخلفية.
  2. قلل التباين بين المكررات البيولوجية عن طريق التسوية وفقاً لحالة ضابطة.
  3. اختر التحليل الإحصائي للمقايسة، إما لنقطة زمنية واحدة أو للمساحة تحت المنحنى (AUC) — وذلك اعتماداً على السؤال المطروح.
    1. بالنسبة لنقطة زمنية واحدة، استخدم النقاط الزمنية التي يحدث عندها ذروة التعبير (والتي تعتمد على POI) جنباً إلى جنب مع نقطة النهاية الزمنية. قم بتمثيل RLU المحسوبة في الخطوة 4.1 عند النقطة الزمنية المحددة (على سبيل المثال 240 min) وحللها باستخدام اختبار إحصائي مناسب.
    2. قس ديناميكيات ترجمة البروتين وتحلله عن طريق حساب AUC إما لإطار زمني محدد (أي من t0 إلى 240 min) أو لطول المقايسة (أي من t0 إلى نقطة النهاية). قم بتسوية قيمة AUC لكل مكرر بيولوجي إلى متوسط mRNA المرجعي، وبذلك يتم الحصول على مقياس للتغير في طيات AUC والذي يمكن تحليله باستخدام اختبارات إحصائية مناسبة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك عدة طرق يمكن من خلالها تحسين الفعالية من حيث التكلفة لهذا البروتوكول. على سبيل المثال، تم تصغير حجم تفاعل النسخ المختبري (IVT) إلى نصف الحجم الموصى به من قبل الشركة المصنعة، ووُجد أن الحصيلة الناتجة استوفت الكمية المطلوبة لـ داخل الخلية تجارب. وتجدر الإشارة إلى أن طول التسلسل وتعقيده يؤثران على حصيلة النسخ المختبري في المختبر (IVT)، لذا يجب أن يؤدي تحسين البروتوكول الناجح إلى إنتاج 50 ميكروجرام على الأقل من الرنا المرسال (mRNA) لكل تفاعل IVT. وكما هو الحال مع أطقم تفاعل IVT، غالباً ما تكون كواشف التغطية (capping reagents) باهظة الثمن. وبما أن جزيء تغطية واحد فقط مطلوب لكل جزيء mRNA، فإننا نفترض أن تفاعل IVT يحتوي على فائض من جزيئات التغطية مقارنة بعدد جزيئات mRNA الناتجة. وبناءً على ذلك، تم بحث ما إذا كان يمكن تحسين البروتوكول بشكل أكبر عن طريق معايرة كمية كاشف التغطية المضاف إلى تفاعل IVT، وتظهر النتائج في الشكل 2أُضيف كاشف التغطية (capping reagent) بتركيزات 100% (تركيز نهائي للقبعة 10 ميلي مولار)، أو 50%، أو 25%، أو 0% (غير مغطى) إلى تفاعلات النسخ في المختبر (IVT) بحجم 10 ميكرولتر، ثم نُقل الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) الناتج لبروتين eGFP إلى خلايا HEK293 التي تعبر باستمرار عن heterodimer المتمم. وكعنصر تحكم للمعايرة، تم أيضاً نقل MYL3 (مغطى بنسبة 100%)، حيث أن هذا الجين الداخلي، الذي يشفر بروتيناً بنيوياً غنياً في العضلات، يظهر ديناميكيات ترجمة مشابهة لبروتين eGFP، ولكن بإشارة أقرب إلى إشارات الجينات الداخلية الأخرى.3بما يتفق مع البيانات السابقة3أدى استخدام حمض mRNA الخاص ببروتين eGFP غير المغلّف (uncapped) إلى غياب الترجمة بشكل مماثل للمجموعة الضابطة الوهمية (mock control)الشكل 2-أأظهرت حمض mRNA الخاص بـ eGFP، والذي تم تخليقه باستخدام 25% أو 50% من كاشف التغطية (capping reagent) الموصى به، مستويات تعبير مماثلة لتلك التي تم تخليقها بنسبة 100% (الشكل 2أ)، مما أدى إلى عدم وجود فروق في قيم المساحة تحت المنحنى (AUC) على مدار النطاق الزمني البالغ 18 ساعة (الشكل 2ب). وتشير هذه النتائج إلى أنه، في ظل هذه الظروف، يتوفر كاشف التغطية (capping reagent) بتركيز زائد، وأن تقليل تركيزه لا يؤثر سلبًا على الناتج الترجمي، وهو ما يتفق مع دمج غطاء كافٍ. أما النتائج المعروضة في الشكل 2 تعتمد هذه الخطوات على العلامة التجارية لكاشف السد (capping reagent) المستخدم، ويجب تحسينها بما يتناسب مع الكواشف المختلفة.

بينما أدت التطورات في تقنية القبعات (cap technology) ودمج النيوكليوتيدات المعدلة إلى تعزيز تعبير mRNA، ساهم تطوير خوارزميات تصميم mRNA في تحسين التعبير بشكل أكبر. تركز هذه الخوارزميات على تحسين استقرار mRNA واستخدام الكودونات من خلال تحسين الطاقة الحرة الدنيا (MFE) ومؤشر تكيّف الكودون (CAI)، على التوالي. لاختبار تأثير التحسين على تعبير mRNA، تم استخدام LinearDesign9. تعتمد هذه الخوارزمية على إدخال قيمة lambda، وهي معامل قياس مستخدم في صيغ التحسين يحدد مدى تفضيل الخوارزمية لـ MFE أو CAI. تم تطبيق إعدادات التحسين نفسها (أي قيمة lambda نفسها) على أربعة عوامل نسخ وهي: HAND2 وGATA4 وMEF2C وTBX5. يستعرض الشكل 3 تأثيرات التحسين على معدلات الترجمة. أدى التحسين إلى تحسين قيم كل من MFE وCAI لجميع عوامل النسخ، حيث أظهر MEF2C أكبر التغييرات في كلا المعاملين (الشكل 3A). تم دمج علامة مضيئة منقسمة (split luminescent tag) في النهاية الكربوكسيلية (C-terminus) لكل بناء، تسبقها وصلة GS، وتم تخليق mRNA لجميع عوامل النسخ الأربعة لكل من الصيغ غير المحسنة والمحسنة. ولضمان إمكانية ترجمة كل mRNA وإنتاج بروتين بالوزن الجزيئي المتوقع، تم استخدام نظام الترجمة الخالية من الخلايا باستخدام مستخلص الخلايا الشبكية للأرانب (rabbit reticulocyte lysate cell-free translation system)3. تم فصل البروتينات الناتجة بواسطة لطخة ويسترن (western blot) باستخدام الوحدة الفرعية الإنزيمية لبروتين لوسيفيراز المنقسم والركيزة المناسبة للكشف عن العلامة المضيئة المنقسمة. أظهرت لطخة ويسترن أن التحسين لا يزال ينتج بروتينات تطابق وزنها الجزيئي المتوقع (الشكل 3B). تم نقل الصيغ غير المحسنة أو المحسنة لكل عامل نسخ إلى خلايا HEK293، وأخذت تسجيلات للخلايا الحية لمدة 18 h. وبالنسبة لجميع تجارب الـ 18 h، تم أخذ قياسات من ثلاث مكررات بيولوجية، واستُخدمت ثلاث مكررات تقنية لكل عينة في كل تجربة مكررة. لم يكن لتحسين HAND2 (الشكل 3C) وGATA4 (الشكل 3D) أي تأثير على التعبير (كما تم تحديده بواسطة اختبار t لعينتين غير مقترنتين)، مع زيادة بمقدار 1.07 ضعف ونقص بمقدار 1.25 ضعف، على التوالي، عند مقارنتهما بنظيراتهما غير المحسنة. وفي الوقت ذات적으로، أدى تحسين MEF2C (الشكل 3E) وTBX5 (الشكل 3F) إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في التعبير مع ارتفاع في AUC بمقدار 2.25 ضعف (P = 0.0486, n = 3, unpaired two-sample t-test) و1.72 ضعف (P = 0.0379, n = 3, unpaired two-sample t-test) مقارنة بنسخهما غير المحسنة. وتماشياً مع ذلك، لوحظت الاختلافات ليس فقط في التعبير النهائي ولكن أيضاً في شكل ومعدل منحنيات التعبير، مما يشير إلى أن المقايسة تميز التغيرات في ديناميكيات الترجمة بمرور الوقت. لتحديد ما إذا كانت هذه الزيادة في التعبير مستمرة لفترة أطول، تم نقل mRNA الخاص بـ MEF2C إلى خلايا HEK293، وأخذت التسجيلات لمدة 72 h (الشكل 3G). وكما هو الحال في تجارب الـ 18 h، تم أخذ قياسات من ثلاث مكررات بيولوجية، واستُخدمت ثلاث مكررات تقنية لكل عينة في كل تجربة مكررة. وبشكل مشابه لما لوحظ بعد 18 h، زاد MEF2C المحسن التعبير بشكل كبير مع تحسن في AUC بمقدار 2.5 ضعف (P = 0.0061, n = 3, unpaired two-sample t-test) مقارنة بالنسخة غير المحسنة. وعلى الرغم من وجود زيادة كبيرة في التعبير مع التحسين، إلا أن هذه النتائج تثبت أن التحسين لا يمنع، في هذه الحالة، التحلل على مدار 72 h، حيث أظهرت كلتا صيغتي MEF2C ميولاً متشابهة بدءاً من 24 h فصاعداً. ومن المرجح أن يكون هذا التحلل ناتجاً عن التحلل الخطي لـ mRNA و/أو انقسام الخلايا. مجتمعة، تثبت هذه النتائج قدرة خوارزميات تصميم mRNA على تحسين تعبير mRNA؛ ومع ذلك، فإنها تسلط الضوء على أن التحسين يجب أن يتم بطريقة تعتمد على البروتين المستهدف (POI-dependent manner).

مخطط نسخ البلازميد؛ PCR، ترانسفكشن HEK293-LB، حضانة قارئ الصفائح، تحليل البيانات.
الشكل 1: سير العمل لتخليق mRNA ومقايسة وسم التألق المقسم في خلايا HEK293. لإجراء النسخ المختبري (IVT) لمقايسة وسم التألق المقسم، تأكد من أن البلازميد يحتوي على محفز RNA polymerase (T7 أو SP6)، ومناطق 5’ و 3’ UTRs، والتسلسلات المشفرة للبروتين المستهدف المدمج مع وحدة فرعية قصيرة من لوسيفيريز HB (HiBiT). يتم خطّ البلازميد باستخدام إنزيم قطع تقييدي يقطع في موقع واحد، مما يوفر القالب لعملية Poly T PCR، والتي تُستخدم لاحقاً كقالب لعملية IVT. يتم تخليق mRNA، ودمجه مع الليبوزومات، ثم نقله عكسياً (reverse-transfected) إلى خلايا HEK293 التي تعبر بنيوياً عن الوحدة الفرعية الأكبر من اللوسيفيريز (LB)، والتي يمكن وضعها فوراً في قارئ الصفائح حيث يتم قياس التسجيلات الحية. بعد اكتمال التجربة، يتم إجراء تحليل البيانات من أجل المعايرة والتحليل الإحصائي اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نتائج مقايسة الفلورة؛ رسم بياني ومخطط شريطي يوضحان مستويات تعبير البروتين بمرور الوقت والمقارنة.
الشكل 2: يؤدي خفض تركيز كاشف القبعة بمقدار أربعة أضعاف إلى إنتاج تعبير لبروتين eGFP مماثل للتعبير الناتج عن التركيز الكامل. (A) مقايسة حركية خلوية حية في خلايا HEK293 تم تحويلها باستخدام eGFP mRNA بتركيزات متفاوتة من كاشف القبعة، أو MYL3، أو عينة وهمية (Mock)، وتمت معايرة البيانات بالنسبة لـ t0؛ وتمثل النقاط متوسط ثلاث مكررات بيولوجية على الأقل لكل نقطة زمنية. (B) تم الحصول على مقدار التغير في AUC للمنحنيات خلال مسار زمني مدته 18 h لثلاث مكررات بيولوجية على الأقل عن طريق المعايرة بالنسبة للعينة المرجعية MYL3، وتمت المقارنة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) مع اختبار توكي للمقارنات المتعددة (Tukey’s multiple comparisons test). تظهر البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)، حيث تمثل كل نقطة متوسط مكرر بيولوجي واحد. ***P < 0.001. (eGFP – البروتين الفلوري الأخضر المعزز؛ AUC – المساحة تحت المنحنى؛ RLU – وحدات اللمعان النسبية) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل التعبير الجيني؛ الرسوم البيانية لتحسين البروتين، وWB وRLU؛ لـ HAND2 وGATA4 وMEF2C وTBX5.
الشكل 3: تحسين التسلسل يعزز ترجمة mRNA بطريقة تعتمد على البروتين المستهدف (POI). (A) أدى تحسين تسلسل mRNA باستخدام LinearDesign إلى خفض قيم الطاقة الحرة الدنيا (MFE) وزيادة قيم مؤشر تكيف الكودونات (CAI) لكل عامل نسخ. (B) أُجريت تفاعلات RRL لمدة 120 min باستخدام mRNA يشفر HAND2 أو GATA4 أو MEF2C أو TBX5 غير المحسنة أو المحسنة، أو بدون RNA. تمت معالجة البروتينات الناتجة لإجراء تحليل Western blotting واكتشافها عن طريق التلألؤ الكيميائي عبر تحضين الغشاء مع الوحدة الفرعية الإنزيمية في نظام لوسيفيريز المنقسم والركيزة المناسبة. مقايسة حركية خلوية حية في خلايا HEK293 المنقولة بـ HAND2 (C)، أو GATA4 (D)، أو MEF2C (E)، أو TBX5 (F)، سواء كانت غير محسنة أو محسنة، جنباً إلى جنب مع MYL3 وMock. تم تطبيع البيانات بالنسبة لـ t0، وتمثل النقاط متوسط ثلاثة مكررات بيولوجية لكل نقطة زمنية. تم الحصول على التغير في طي (Fold change) في AUC للمنحنيات لمسار زمني مدته 18 h لثلاثة مكررات بيولوجية عن طريق التطبيع بالنسبة لعينة المرجع MYL3 ومقارنتها باستخدام اختبار t غير مقترن مع تصحيح Welch. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM، حيث تمثل كل نقطة متوسط مكرر بيولوجي واحد. *P < 0.05. (G) مقايسة حركية خلوية حية في خلايا HEK293 المنقولة بـ MEF2C غير المحسن أو المحسن، وMYL3، وبيانات Mock مطبّعة بالنسبة لـ t0، وتمثل النقاط متوسط ثلاثة مكررات بيولوجية لكل نقطة زمنية. تم الحصول على التغير في طي في AUC للمنحنيات لمسار زمني مدته 72 h لثلاثة مكررات بيولوجية عن طريق التطبيع بالنسبة لعينة المرجع MYL3 ومقارنتها باستخدام اختبار t غير مقترن مع تصحيح Welch. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM مع تمثيل كل نقطة لمتوسط مكرر بيولوجي واحد. **P < 0.01. (MFE – الطاقة الحرة الدنيا؛ CAI – مؤشر تكيف الكودونات؛ RRL – محلل الشبكية للأرنب؛ AUC – المساحة تحت المنحنى، RLU – وحدات التلألؤ النسبية) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توسع مجال العلاجات القائمة على mRNA بشكل سريع في السنوات الأخيرة، مما أكد على أهمية تصميم التسلسل وتحسينه كمرحلة حاسمة في مسار التطوير. وقد ركزت جهود كبيرة على بناء أدوات حوسبية للتنبؤ ببنى وتكوينات RNA الأكثر فعالية، مع إيلاء اهتمام خاص لتحسين التسلسل8,9. ورغم قوة هذه الأدوات، لا يزال التحقق التجريبي من هذه التصاميم جزءاً أساسياً من مسار العمل. ومع ذلك، اعتمد هذا التحقق إلى حد كبير على البروتينات المراسلة، بما في ذلك GFP7 وNanoLuc8 وبروتين spike الخاص بـ SARS-CoV-29 والتي تُعد بالفعل بروتينات مستقرة للغاية وقابلة للترجمة بكفاءة عالية. وللتغلب على هذا القصور، تم دمج نظام لوسيفيراز منقسم (split luciferase system) في مسار دراسة ديناميكيات ترجمة mRNA المنسوخ in vitro في خلايا HEK293، مما أتاح تحقيق دقة زمنية3، وأظهر محدودية استخدام البروتينات المراسلة في الكشف عن التغيرات في الترجمة عند هندسة mRNA. يوضح مقال هذه الطريقة الخطوات المطلوبة لإجراء هذا المقايسة، ويبين إمكانية تصغير حجم تفاعل IVT، وخفض تركيز القبعة 5’ (5’ cap) دون التأثير على عملية الترجمة، مما يؤدي إلى تقليل التكاليف. وبناءً على ملاحظاتنا السابقة، نؤكد أن نهج تحسين تسلسل mRNA المعتمد على البروتين المستهدف (POI-dependent approach) ضروري لتحقيق زيادة في مستوى التعبير.

كما هو موصوف هنا، يعتبر مقايسة الوسم المضيء المنقسم مسار عمل بسيط نسبيًا يتيح قياس ترجمة mRNA بإنتاجية متوسطة، مما يسمح للمستخدمين بدراسة التعبير الزمني لبروتين الاهتمام (POI) في الوقت الفعلي. ومع ذلك، هناك عدة خطوات واعتبارات حرجة مطلوبة لتحقيق نتائج قوية. أولاً، تعتمد جميع النتائج اللاحقة على جودة mRNA، والتي تبدأ من عملية النسخ في المختبر (IVT) وتطهير المعدات المستخدمة في ذلك. بعد التصنيع، يعد تخزين mRNA أمرًا أساسيًا، حيث يُحفظ على الثلج بعد الاسترداد (elution)، وبعد التأكد من حجم mRNA، يتم تقسيم mRNA إلى أحجام عمل لمنع دورات التجميد والإذابة، ويظل mRNA مخزنًا عند -80°C. ثانيًا، تعد لوحة 96 بئر المستخدمة ذات أهمية قصوى ويجب أن تكون متسقة بين التجارب. بالنسبة لهذا البروتوكول، تأكد من استخدام لوحة 96 بئر بيضاء بالكامل. يمكن استخدام الأطباق ذات القاع الشفاف والجدران البيضاء إذا كانت مراقبة مورفولوجيا الخلايا مطلوبة؛ إلا أن هذه الأطباق تؤدي إلى إشارة أقل بكثير، لذا لا يمكن استخدام نوعي الأطباق هذه بالتبادل. وقد لوحظ أنه عند قياس ترجمة نفس أنواع mRNA في طبق ذو قاع شفاف وجدران بيضاء، كانت إشارة اللمعان الناتجة أقل بـ 5 أضعاف من تلك الناتجة في طبق موازٍ ذو جدران بيضاء بالكامل. يمكن أن تكون هذه الملحوظة الفنية مؤثرة عند تقييم الجينات ذات ديناميكيات الترجمة غير الفعالة. فبالإضافة إلى إدخال عدم الاتساق في البيانات، قد يمنع انخفاض الإشارة اكتشاف الاختلافات الطفيفة الناجمة عن تتابع mRNA أو الاضطرابات الهيكلية. ثالثًا، يعد استخدام وسط L-15 أمرًا أساسيًا في هذه المقايسة لأنه يسمح ببقاء الخلايا حية في بيئة خالية من مكملات CO225، مما يوفر مرونة في جهاز قياس اللمعان المستخدم. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام وسط L-15 الخالي من الفينول يقلل من إشارة الخلفية أثناء قياس اللمعان. وأخيرًا، يتم استزراع الخلايا وقياس اللمعان عند 37°C (أو وفقًا لظروف استزراع نوع الخلايا المستهدفة). إن إجراء هذه التجربة في درجة حرارة الغرفة سيغير النتائج بشكل كبير، حيث ينخفض معدل استطالة الترجمة26، مما يعني أن الحركية الطبيعية لن تكون ملحوظة.

يمكن نقل تعدد استخدامات تصميم الـ mRNA المنسوخ in vitro إلى عملية التخليق، مما يسمح بإجراء تعديلات عديدة. وكما لوحظ، يمكن تقليل تركيز غطاء 5’ بمقدار 4 أضعاف، ومع ذلك لا يزال من الممكن تحقيق تعبير مماثل، مما يُمكّن الباحثين من خفض التكاليف. وبالرغم من أن كفاءة وضع الغطاء لم تُقس مباشرة بعد عملية IVT، فإن زيادة نسبة الـ mRNA غير المغلّف ضمن مجموعة IVT ستؤدي إلى انخفاض الإشارة، كما هو موضح في حالة الـ mRNA غير المغلّف؛ وهذا لم يُلاحظ هنا. بالإضافة إلى ذلك، ونظرًا لأن eGFP هو بروتين صغير نسبيًا بكتلة 27 kDa فقط، فإن هذا التعديل في تركيز الغطاء يجب أن ينتقل بسهولة إلى الجينات الأكبر، حيث سيكون هناك عدد أقل من النسخ التي تحتاج إلى تغليف بعد عملية IVT. هناك العديد من نظائر الغطاء التي تمتلك تعديلات ميثيلة مختلفة، مما يؤثر على الاستجابة المناعية3 والتعبير البروتيني27. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء عملية وضع الغطاء بالتزامن مع النسخ (كما تم توضيحه هنا) أو بعد النسخ باستخدام فيروس Vaccinia، مما يؤدي إلى كفاءة تغليف بنسبة 100%28 ولكن يتطلب خطوات تنقية إضافية. ولإنتاج mRNA على نطاق مختبري، تُستخدم أعمدة التنقية بشكل شائع لأنها سريعة وفعالة، ولكنها مكلفة. وهناك نهج أرخص وأكثر تعددية وهو الترسيب باستخدام كلوريد الليثيوم، والذي بالرغم من كونه يستهلك وقتًا أطول، إلا أنه يسمح للمستخدم بتركيز الـ mRNA ولا يقيد الحصيلة بسعة ربط العمود؛ لذا فهو مناسب لزيادة نطاق الإنتاج. ومثل أعمدة التنقية، لا يزيل هذا النهج تمامًا الـ RNA مزدوج السلسلة وشظايا الـ RNA المبتورة، والتي تسبب استجابة مناعية29. وبشكل مشابه لغطاء 5’، يمكن تحقيق دمج ذيل poly(A) بطرق بديلة عن تلك الموصوفة هنا. وعلى غرار إدخال الذيل عبر PCR، يمكن هندسة الـ DNA البلازميدي ليحتوي على ذيل poly(A)؛ ومع ذلك، يمكن أن تخضع هذه السلاسل الطويلة لإعادة التركيب، مما يؤدي إلى تتابعات poly(A) غير متجانسة وقصيرة. ومع ذلك، فإن تقسيم poly(A) – إدخال فواصل من نيوكليوتيدات مختلفة – قد قلل من هذه التأثيرات30,31. وبدلاً من ذلك، يمكن توليد ذيل poly(A) باستخدام إنزيم poly(A) polymerase المستقل عن القالب، مما يسمح بتوليد ذيول poly(A) أطول32 ولكن على مخاطرة أن يؤثر عدم التجانس على المتطلبات التنظيمية33.

بينما يعد مقايسة الوسم المضيء المنقسم الموصوفة فعالة للغاية في قياس التعبير البروتيني لـ mRNA الذي يتم إدخاله خارجيًا، إلا أن هناك بعض القيود التي يجب مراعاتها اعتمادًا على سؤال البحث. أولاً، هناك حاجة لإنشاء خط خلوي يعبر بشكل تأسيسي عن نصف واحد من لوسيفيراز المنقسم. وعلى الرغم من إمكانية شراء ذلك جاهزاً، إلا أنه مقتصر حالياً على خلايا HEK293 فقط. وإذا كان إنشاء خط مستقر في نوع الخلايا المطلوب يمثل تحدياً، فهناك مقايسة تحللية وجدنا أنها توضح النتيجة ذاتها بين خلايا HEK293، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية، والخلايا العضلية القلبية المتمايزة3. ومع ذلك، فإن النقطة الزمنية المختارة للمقايسة التحليلية من هذه الدراسة المنشورة سابقاً3 قد استندت إلى بيانات خلايا HEK293 الحية. ثانياً، توفر المقايسة دقة زمنية في الخلايا الحية ولكنها غير قادرة على توفير دقة مكانية في الخلايا الحية، وهو أمر قد يهم بعض الباحثين. ومع ذلك، يتوفر جسم مضاد أولي يعمل بشكل جيد في الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية ضد وسم الببتيد القصير للوسيفيراز المستخدم في هذه التجارب، مما يسمح بالاستقصاء المكاني لبروتين الاهتمام (POI) المترجم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمجهر القادر على التصوير المضيء أن يوفر بيانات بدقة الخلية الواحدة. وهناك نهج يوفر معلومات مكانية وزمنية وهو SunTag، الذي يقيس الترجمة النشطة والتوطين باستخدام تصوير الخلايا الحية من خلال التفاعلات بين scFv الموسوم بـ GFP الذي يرتبط بحواتم الببتيد14,34. ومع ذلك، يتطلب الأمر 24 تكراراً ترادفياً لهذه الحواتم، مما قد يؤدي إلى تشويه عملية الترجمة، في حين أن سير العمل منخفض الإنتاجية نسبياً. ثالثاً، يتيح الوسم المضيء المنقسم قياس وفرة mRNA، ولكن ليس في الخلايا الحية. في عملنا السابق3، تم إجراء qRT-PCR على RNA المستخلص باستخدام بادئات محددة للنسخة المدخلة خارجياً، مما أكد مستويات mRNA لكفاءة عفن التعداء بين البنيات والتحلل بين النقاط الزمنية. وقد شهد نهج آخر استخدام لطريقة Northern blotting لقياس استقرار mRNA35. ومع ذلك، فإن كلا النهجين يستهلكان الكثير من الجهد وغير قادرين على توفير قياسات مستمرة. حالياً، لا توجد طريقة تتيح قياسات متزامنة لترجمة mRNA ووفرته في الخلايا الحية، مما يفتح مساراً محتملاً لتطوير المقايسات في هذا المجال.

طُبِّق نظام لوسيفيراز المنقسم في البداية لدراسة ديناميكيات البروتين، ومع ذلك يتضح هنا أن لهذا المقايسة تداعيات رئيسية في مجالات بحثية أخرى. ومع تصدر العلاجات القائمة على mRNA لمقاربات العلاج الجيني الجديدة، فإن هذه المقايسة مناسبة تماماً للسماح للباحثين بتوصيف تعبير علاجهم المحتمل وتحسينه لتحقيق تعبير معزز. وكما ذُكر سابقاً، أصبح تحسين الكودونات أداة قوية جديدة في تصميم mRNA مع تطوير أدوات متعددة8,9,36. وعندما طُبِّق نهج تحسين تسلسل موحد على أربعة عوامل نسخ، فقد أدى ذلك إلى تحسين كل من MFE و CAI لجميع الجينات، ومع ذلك أظهر MEF2C و TBX5 فقط زيادة في التعبير. ومن الجدير بالذكر أنه من خلال تمكين الكشف عن اختلافات التعبير الناجمة فقط عن تباين تسلسل الترميز المترادف، يوفر هذا النهج منصة فريدة لاستقصاء كفاءة الترجمة في الخلايا الحية بدقة زمنية عالية. وتوضح هذه النتائج أن تحسين التسلسل يجب أن يأخذ في الاعتبار محتوى GC الأولي، واستخدام الكودونات، والبنية الثانوية لـ RNA بطريقة تعتمد على POI لتحقيق تعبير معزز. وبينما قد يتطلب الأمر اختبار المزيد من البنى، فإن مقايسة وسم التلألؤ المنقسم تمتلك القدرة على التحليل عالي الإنتاجية لتحديد المرشح الأمثل لـ POI. بالإضافة إلى ذلك، وكما تم إظهاره سابقاً3، يمكن لهذه المقايسة قياس آثار اضطراب أي مكون تسلسلي أو هيكلي لـ mRNA، مما يبرز تطبيقاتها بشكل أكبر. وإلى جانب استقصاء التعديلات على mRNA، يمكن أيضاً استخدام مقايسة وسم التلألؤ المنقسم في أبحاث التوصيل والصياغة. فحتى مع التحسينات في نهايات 5’ caps واستخدام النوكليوتيدات المعدلة، يتطلب mRNA الذي يتم توصيله خارجياً نظام تعبئة لمنع التحلل وضمان الامتصاص الخلوي37. وبينما تتصدر الجسيمات النانوية الدهنية38، والحويصلات خارج الخلوية39، والمحاكيات الحيوية40 عملية توصيل mRNA، لا يزال هناك حاجة إلى مزيد من التطوير. ومن شأن تغليف mRNA الموسوم بتلألؤ منقسم في أي من هذه الناقلات أن يسمح بتوصيف كفاءة توصيلها ويمكّن الباحثين من اختبار الناقلات المعدلة بطريقة متوسطة إلى عالية الإنتاجية. وخارج نطاق الأبحاث التي تركز على الترجمة، يمكن استخدام مقايسة وسم التلألؤ المنقسم بسهولة في البيولوجيا الأساسية. وسواء كان ذلك لتقييم آثار اضطرابات التسلسل والعناصر الهيكلية على ترجمة mRNA، أو التدخل في وظيفة آلية الترجمة، أو سبر أغوار البروتيزوم، فإن نظام وسم التلألؤ المنقسم يوفر خياراً جذاباً.

بشكل عام، يوفر نظام الوسم المضيء المنقسم الموصوف هنا مقايسة مرنة وقوية لمراقبة تعبير البروتين المدفوع بـ mRNA الاصطناعي زمنياً كقراءة لديناميكيات الترجمة. إن تطبيق مقايسة الخلايا الحية يتغلب على العديد من القيود السابقة في مجال ترجمة mRNA ويكشف عن معلومات حاسمة حول ديناميكيات تخليق البروتين وتحلل POI. ونظراً لأن النسخ تمتلك ملفات تنظيمية وتعبيرية مختلفة، فمن الضروري توصيف POI العلاجي، مما سيسمح لعلاجات mRNA بالاستمرار في التطور والانتقال إلى التطبيق السريري.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتوجه المؤلفون بالشكر لـ Laura Itzhaki لتوفير خط خلايا HEK293 LgBiT. وقد حظي هذا العمل بدعم من منحة مشروع وجائزة ترجمية من مؤسسة القلب البريطانية (British Heart Foundation) (G114642 و G919651 لـ CHW) ومنحة أبحاث GenScript Life Science (CAPB).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الأسيتيكSigma-AldrichA6283مكون من محلول TAE المنظم
أجاروزSigma-AldrichA9539الترحيل الكهربائي للهلام
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939Bجهاز تحليل حيوي يستخدم لمراقبة جودة mRNA
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-Fقارئ أطباق/مقياس لومينومتر يستخدم لقياس التلألؤ الحيوي
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113غطاء 5' يستخدم في النسخ المختبري IVT
DMEM، جلوكوز عالٍ، بيروفاتThermo Fisher Scientific41966029وسط مستنبت يستخدم لزراعة خلايا HEK293-LgBiT
DNase INew England BiolabsM0303يعمل على تفكيك قالب DNA بعد تفاعل IVT
محلول دالبكو الفسفاتي المنظم (PBS)Sigma-AldrichD8537لغسل الخلايا وللإضافة إلى الطبق لمنع التبخر
EDTA، pH 8.0، خالٍ من RNaseThermo Fisher ScientificAM9260مكون من محلول TAE المنظم
بروميد الإيثيديومSigma-AldrichE1510صبغة للترحيل الكهربائي للهلام
مصل جنين البقر (FBS)Sigma-AldrichF7524مكمل يضاف إلى DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040طقم النسخ المختبري (IVT)
وسط Leibovitz's L-15، بدون فينول ريدThermo Fisher Scientific21083027وسط مستنبت لزراعة HEK293-LgBiT أثناء قياسات التلألؤ الحيوي
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-024مكمل يضاف إلى DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150كاشف عفن Lipid-based للتحول الجيني
محلول تريبس كلوريد الليثيوم للترسيبThermo Fisher ScientificAM9480نهج بديل لتنقية mRNA بعد IVT
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130طقم تنقية بعد خطيّة البلازميد
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-Wمقياس طيف ضوئي يستخدم لتقدير تركيز DNA و mRNA
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570ركيزة مطلوبة للتلألؤ الحيوي تضاف إلى وسط L-15 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612ينقي mRNA بعد تفاعل IVT
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Fisher Scientific136101طبق يستخدم لزراعة HEK293-LgBiT والقياسات اللاحقة
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062وسط مستنبت يستخدم لتفاعل التحول الجيني
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553طقم PCR
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993سلم RNA للترحيل الكهربائي للهلام
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020بخاخ لتطهير RNase
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066مكون من محلول TAE المنظم
محلول Trypsin-EDTASigma-AldrichT4174كاشف لتفكيك الخلايا
UltraPure DNase/RNase free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977035يستخدم لتحضير القوالب ولـ IVT

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

mRNA 5 mRNA

مقالات ذات صلة