مقالة منهجية

عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية في لب الأسنان عبر ممرات الخلايا

DOI:

10.3791/70977

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول سير عمل موحد لعزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية للب الأسنان (DPSC) عبر الممراح، مما يمكن من تقييم جودة الإكسوسوم والنشاط الوظيفي القابل للتكرار في التطبيقات التجديدية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل الخلايا الجذعية للب الأسنان (DPSCs) مصدرا متاحا وذو صلة سريريا للخلايا الجذعية الميزنشيمية، وقد برزت الإكسوسومات المشتقة منها كحويصلات نشطة حيويا واعدة لتطبيقات خالية من الخلايا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي. ومع ذلك، لا تزال الطرق القابلة للتكرار والموحدة لعزل والتحقق الوظيفي من الإكسوسومات المشتقة من DPSC محدودة، خاصة فيما يتعلق بالتباين الذي يدخل أثناء توسع الخلايا عبر الممرات. هنا، نصف سير عمل شامل وموحى قائم على المجموعات لعزل وتنقية الإكسوسومات من وسط مكيف ب DPSC، متوافقا مع الممارسات المخبرية الروتينية. تمكن هذه الطريقة من استعادة الحصيلات السليمة بشكل متسق المناسبة للتوصيف الشكلي والجزيئي والوظيفي باستخدام تقنيات شائعة. يتم تقييم هوية الإكسوسومات بناء على الشكل الشكلي وتوزيع الحجم وتعبير العلامات، بينما يتم تقييم النشاط البيولوجي باستخدام اختبار مضاد للالتهاب محدد في المختبر. لفحص التأثيرات المتعلقة بالمقطع، تتم مقارنة الإكسوسومات المستخرجة من مقاطع DPSC المختلفة باستخدام هذا القراءة الوظيفية، مما يوفر إطارا عمليا لتقييم الاتساق أثناء توسع الخلية. من خلال دمج العزل والتنقية والتوصيف والتحقق الوظيفي في سير عمل واحد، يقدم هذا البروتوكول نهجا قابلا للتكرار والتوسع لتوليد إكسوسومات مشتقة من DPSC مثبتة وظيفيا لأبحاث المواد الحيوية والتطبيقات التجديدية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية الميزنشيمية وسطاء أساسيين في التواصل بين الخلايا وتظهر إمكانات علاجية كبيرة في مجالات هندسة الأنسجة والطب التجديدي. الإكسوسومات هي حويصلات يبلغ قطرها بين 30 و150 نانومتر، قادرة على توصيل جزيئات نشطة حيويا وتنظيم وظائف مختلفة في الخلايا المستقبلة، مثل التكاثر، والتمايز، والاستجابة المناعية 1,2. من بين مصادر الخلايا الجذعية المتوسطة الكيميائية المختلفة (MSC)، تحظى الخلايا الجذعية للب الأسنان (DPSCs) باهتمام خاص بسبب سهولة وصولها، وقدرتها القوية على التكاثر، وانخفاض خطر الإصابة بالأورام، وأقل المخاوف الأخلاقية3،4،5. تحتوي الإكسوسومات المشتقة من DPSCs (DPSC-Exos) على مجموعة متنوعة من الحمولة الوظيفية، بما في ذلك البروتينات، والmRNAs، والميكروRNAs، مما يمكنها من الاحتفاظ بالعديد من الخصائص البيولوجية لخلاياها الأبوية. أظهرت دراسات سابقة أن DPSC-Exos يمكن أن يعزز تكوين الأوعية، وإصلاح الأعصاب، وتجديد العظام، والاستجابات المضادة للالتهابات. بعيدا عن أدوارها في هندسة الأنسجة، تعتبر الإكسوسومات بشكل متزايد منظمات مهمة في تكوين الأورام وعلاج السرطان، حيث تساهم في إعادة تشكيل بيئة الأورام الدقيقة، ومقاومة الأدوية، والتهرب المناعي6. الإكسوسومات المشتقة من MSC، بما في ذلك تلك المستخرجة من DPSCs، تمتلك قدرات فطرية في توجيه الأورام وخصائص مناعية، مما يضعها كوسائل واعدة للجيل القادم لتوصيل أدوية مضادة للسرطان بشكل مستهدف أو كعوامل مناعية علاجية خالية من الخلايا. من خلال تجاوز عدة قيود مرتبطة بالعلاجات المعتمدة على الخلايا، برز DPSC-Exos كمكون حيوي واعد غير خلوي للتطبيقات التجديدية 7,8,9,10,11,12.

على الرغم من هذه المزايا، لا يزال تحويل أبحاث DPSC-Exo إلى الاستخدام التجريبي أو السريري القابل للتكرار أمرا صعبا. أحد القيود الرئيسية هو غياب البروتوكولات الموحدة والموحدة لعزل وتنقية الإكسوسومات. تشمل الطرق المستخدمة حاليا الطرد المركزيالفائق 13، والترشيح الفائق، والترسيب، والكروماتوغرافيا بتحديد الحجم، والتقاط الموابين المناعي14,15. من بين هذه الطرق، يوفر الترسيبيات القائمة على البوليمر مزايا عملية، بما في ذلك إنتاجية عالية، وتوافق مع مجموعة واسعة من أحجام العينات، وبساطة تشغيلية، مما يجعله مناسبا للدراسات التي تتضمن أعدادا كبيرة من العينات أو متطلبات التوسع 16,17,18. وقد تم توثيق تحليلات مقارنة لطرق العزل المختلفة، خاصة فيما يتعلق بإنتاج البروتين ونسبة الجسيمات إلى البروتين، على نطاق واسع في الأدبيات19. ومع ذلك، لم يتم معالجة تأثير رقم مرور DPSC على خصائص ونشاط الإكسوسومات المستخلصة بشكل كاف، مما يمثل فجوة مهمة في توحيد ومراقبة جودة إنتاج DPSC-Exo.

لمعالجة هذه القيود التقنية، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا موحدا قائما على المجموعات لعزل وتنقية الإكسوسومات من وسط مشروط ب DPSC. بالإضافة إلى التوصيف الفيزيائي والجزيئي، يتضمن البروتوكول اختبارا وظيفيا لتقييم النشاط المضاد للالتهابات في الإكسوسومات المستمدة من مقاطع DPSC المختلفة، مما يمكن من تقييم مقارن لثبات الممرات المعتمدة في جودة ووظيفة الإكسوسومات. تم تصميم سير العمل ليكون سهل التنفيذ في مختبرات مجهزة بمرافق قياسية لزراعة الخلايا وعلم الأحياء الجزيئي. يعتمد على مجموعات تجارية متاحة لتقليل التنوع بين التجارب، ويمكن بسهولة توزيعه لتلبية احتياجات تجريبية مختلفة. لتقليل التباين بين المتبرعين، يتم عزل DPSCs من الأسنان الفردية وتوسيعها بشكل مستقل بدلا من تجميعها من عدة متبرعين. يعد هذا البروتوكول مفيدا بشكل خاص للباحثين الذين يسعون لتوليد إكسوسومات مشتقة من DPSC تم التحقق منها وظيفيا للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك شفاء الجروح، وهندسة أنسجة العظام، ودراسات التضمين المناعي، حيث يكون الاتساق من دفعة إلى دفعة أمرا ضروريا. بشكل عام، يوفر إطارا عمليا وموحدا لإنتاج الإكسوسومات المشتقة من DPSC لاستخدامها في هندسة الأنسجة وأبحاث الطب التجديدي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل لجان الأخلاقيات المؤسسية. تم الحصول على أنسجة لب الأسنان البشرية من أضراس ثالثة مهملة أو ضواصك تقويمية تقويمية تم جمعها في مستشفى نينغبو لطب الأسنان وفقا للإرشادات الأخلاقية المؤسسية (البروتوكول رقم NBKQYY2025LS-04؛ تاريخ الموافقة: 30 مايو 2025). تم الحصول على أنسجة جلدية بشرية من عينات قلفة تم جمعها خلال إجراءات الختان الروتينية في قسم المسالك البولية بمستشفى الشعب التابع بجامعة نينغبو، وفقا للإرشادات الأخلاقية المؤسسية (البروتوكول رقم 2024104؛ تاريخ الموافقة: 30 أكتوبر 2024). تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المتبرعين أو أوصيائهم القانونيين قبل جمع العينات.

1. عزل الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية للب السن

  1. العزلة، والثقافة، والتعرف على مراكز التصوير الدائم
    1. جمع العينات ونقلها
      1. جمع الأضراس الثالثة البشرية السليمة من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 18 و25 سنة أو من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 12 و16 عاما بعد خلع التقويم.
      2. ضع الأسنان المختزعة فورا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات مبرد مسبقا (PBS) مع 100 U/ml بنسلين-G و100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين.
      3. نقل العينات إلى المختبر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ومعالجة خلال 6 ساعات من الاستخلاص.
    2. تعرض لب الأسنان وتفكك الأنسجة
      1. اغمر في 70٪ إيثانول لمدة 30 ثانية؛ اغسله ثلاث مرات باستخدام 1× PBS يحتوي على 3٪ P/S (30 ثانية لكل منها). قم بإزالة الأنسجة اللثية واللثوية المتبقية من سطح السن بعناية باستخدام مقص معقم أو مشرط.
      2. لف السن بشاش معقم، ثم كسر التاج بحذر باستخدام مطرقة معقمة لكشف غرفة اللب.
      3. افصل نسيج اللب عن العاج بلطف وقم بتقطيعه إلى شظايا صغيرة (<1 مم3) باستخدام شفرات جراحية معقمة.
      4. انقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل يحتوي على محلول هضم بسعة 2.5 ملغ/مل ديسباز II و2.5 ملغ/مل كولاجناز النوع الأول.
      5. حضن الخليط عند الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30–45 دقيقة مع تحريك لطيف.
        ملاحظة: تم تحديد مدة الهضم الإنزيمي بناء على حجم ودرجة تجانس نسيج لب السن.
    3. إنهاء الهضم وزراعة الخلايا الأولية
      1. أوقف الهضم الإنزيمي بإضافة حجم مماثل من وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS).
      2. قم بعمل جهاز الطرد المركزي في تعليق الخلية عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا وقطع الأنسجة.
      3. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 1 مل من وسط الزراعة الكامل (α-MEM مع 20٪ FBS، 100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين).
      4. قم بزرع الخلايا المعلقة والبصيلات الخارجية في طبق زراعة بحجم 60 مم وإضافة وسط زراعة كامل إلى حجم نهائي يبلغ 5 مل.
      5. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO₂.
    4. صيانة الخلايا والزراعة الفرعية
      1. قم بتحديث وسيط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة.
      2. راقب الخلايا يوميا.
        ملاحظة: عادة ما تهاجر DPSCs الأولية من إزالة الأنسجة وتصل إلى التقاء بنسبة 80–90٪ خلال 7–14 يوما.
      3. في الزراعة الفرعية، يتم فصل الخلايا باستخدام حمض التربسين-إيثيلين إيثيلين أمين تترا أسيتيك بنسبة 0.05٪ (EDTA) عند وصولها إلى 80–90٪ التقاء البعض.
        تحذير: التربسين مهيج. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة.
      4. الخلايا الممررة بنسبة 1:3 باستخدام وسط الزراعة الكامل (مع 20٪ FBS).
      5. استخدم أجهزة DPSC في المقاطع 2 و4 و6 لجميع العزل اللاحق للأجهزة الخارجية والاختبارات الوظيفية.
    5. توصيف DPSCs بواسطة قياس خلوي التدفق
      1. فصل DPSCs عند الممر المطلوب باستخدام 0.05٪ تريبسين-EDTA، وتم تحييده باستخدام وسط زراعة كامل، وجمع تعليق الخلية.
      2. الطرد المركزي عند حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في PBS وعد الخلايا. اضبط كثافة الخلايا إلى حوالي 1 ×10 6 خلايا/مل.
      3. أليكوت 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل أنبوب قياس خلوي تدفق. حضن الخلايا بالأجسام المضادة المتقاربة بالفلوروكروم ضد CD44، CD90، CD105، CD45، CD19، وCD14 بتخفيفة 1:100 في PBS لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      4. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من PBS لكل أنبوب، ثم قم بالطرد المركزي بحرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق. تخلص بعناية من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة الخلوية في 300–500 ميكرولتر من PBS للتحليل.
      5. تضمين الأجسام المضادة المناسبة للتحكم في النظائر بتركيزات مطابقة لكل فلوروكروم لتمكين تصحيح الخلفية والتجيد.
      6. تحليل العينات باستخدام مقياس تدفق وتركيب مجهول بالليزر والمرشحات المناسبة للفلوروكروم المختارة. احصل على ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة.
      7. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج قياس تدفق الخلوية. أولا، بوابات الخلايا الصالحة للحياة بناء على التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) لاستبعاد الحطام. ثم ضع بوابات مفردة لإزالة الدوبلت.
      8. تحديد تعبير العلامة من خلال مقارنة شدة الفلورة مع ضوابط النظير المقابلة لتحديد مجموعات موجبة وسالبة.
  2. عزل وتنقية DPSC-Exos
    1. تحضير الوسط المكيف
      1. تزرع DPSC في طبق زراعة بحجم 10 سم حتى تصل إلى التقاء بنسبة 70–80٪.
      2. أزل الوسط المستهلك ثم اغسل طبقة الخلية الأحادية بلطف مرتين باستخدام PBS المسخن مسبقا.
      3. أضف 10 مل من الوسط الكامل مع 10٪ من FBS الخالي من الإكسوسومات.
      4. حضن الزراعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يصل التقاء الخلايا إلى 90–100٪ (وهي عملية عادة ما تتجاوز 24 ساعة).
    2. مجموعة الوسط المشروط
      ملاحظة: حافظ على جميع الخطوات التالية على التجميد أو عند 4 درجات مئوية.
      1. انقل الوسط المكيف إلى أنبوب طرد مركزي.
      2. قم بعمل الطرد المركزي على حرارة 4 درجات مئوية و3000 × جرام لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا والحطام الكبير.
      3. انقل المادة الفائقة بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد دون إزعاج الحبيبة.
      4. قم بجهاز الطرد المركزي للمادة الفائقة عند 4 درجات مئوية و10,000 × جرام لمدة 10 دقائق لإزالة الجسيمات الصغيرة والأجسام الموتية.
      5. قم بترشيح المادة الفائقة عبر فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي نظيف بسعة 50 مل.
      6. قم بمعالجة الوسط المصفى فورا لعزل الإكسوسوم، أو الأكوت وخزنها عند -80 درجة مئوية.
        ملاحظة: يمكن تخزين الوسط المصحى عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.
    3. عزل الإكسوسومات بواسطة الترسيبات القائمة على البوليمرات
      1. قم بإذابة الوسط المصحى على الثلج إذا كان مجمدا.
      2. في أنبوب معقم على الجليد، ادمج الوسط مع محلول تركيز الإكسوسوم بنسبة حجم 4:1 (مثلا، وسط 20 مل: محلول 5 مل). قم بتدوير الخليط لمدة دقيقة واحدة لضمان التجانس.
      3. اترك الخليط دون اضطراب عند 4 درجات مئوية لمدة 16–18 ساعة للسماح بترسيب الإكسوسومات.
        ملاحظة: يمكن تمديد وقت الحضانة بشكل مناسب لزيادة الإنتاجية المحتملة، ولكن يجب ألا يتجاوز 24 ساعة.
      4. قم بعمل الطرد المركزي للخليط عند 4 درجات مئوية و10,000 × جرام لمدة 75–80 دقيقة لإزالة الحبيبات الإكسوسومية. استنشق السوبرنت بعناية وتخلص منها دون إزعاج الحبيبة.
      5. قم بالطرد المركزي في الأنبوب مرة أخرى عند 4 درجات مئوية و10,000 × جرام لمدة دقيقتين. قم بإزالة أي فائض متبقي باستخدام ماصة.
      6. أعد تعليق حبيبات الإكسوسوم في 1x PBS (استخدم 200 ميكرولتر من PBS لكل وسط مكيف 20 مل).
      7. نقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و12,000 × جرام لمدة دقيقتين، مع الاحتفاظ بالسوبرناتينت الذي يغني بجسيمات الإكسوسومات (كرر إذا لزم الأمر).
    4. تنقية الإكسوسومات
      1. قم بتطبيق تعليق الإكسوسوم على عمود مرشح لتنقية الإكسوسوم الموضوع في أنبوب تجميع.
      2. قم بطرد المركزي على العمود عند 4 درجات مئوية و3000 × جرام لمدة 10 دقائق.
      3. اجمع السائل الذي يمر عبر التيار من أسفل أنبوب التجميع. يحتوي هذا السائل على الإكسوسومات المنقاة.
    5. تخزين الإكسوسومات المنقاء
      1. أليكوت تعليق الإكسوسوم المنقى إلى أحجام ذات استخدام واحد مناسبة للتجارب اللاحقة.
      2. خزن الأليكوات عند -80 درجة مئوية.
        ملاحظة: الأليكوتينج ضروري لتجنب تكرار دورات التجمد والذوبان، التي قد تضعف سلامة الإكسوسومات والنشاط البيولوجي.
    6. توصيف وتحديد DPSCs-Exo
      1. إجراء التحليل الشفي باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) كما هو موضح في الخطوات 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. استخدم معصية، اسحب 10 ميكرولتر من عينة تعليق الإكسوسوم المحضرة، ثم أسقطها على بارافيلم جاهز مسبقا. ضع شبكة النحاس المطلية بالفورمفار/الكربون، جانب الفيلم مواجها للأسفل، على القطرة، ودعها تمتص بشكل طبيعي لمدة 10–15 دقيقة.
      3. استخدم شريط ورق فلتر لامتصاص أي سائل زائد واتركه ليجف في الهواء لفترة وجيزة.
      4. استخدم ماصة، اسحب 10 ميكرولتر من محلول حمض الفوسفوتونغستيك بنسبة 2٪، ثم أسقطه على البارافيلم. اقلب الشبكة التي أكملت خطوة الامتصاص بحيث يواجه جانب الفيلم محلول التلوين، واتركها لمدة 3–5 دقائق.
      5. استخدم شريط ورق فلتر لامتصاص السائل الزائد واترك الشبكة تجف تحت مصباح متوهج.
      6. راقب والتقاط الصور باستخدام مجهر إلكتروني ناقل.
      7. إجراء تحليل توزيع الحجم والتركيز باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) كما هو موضح في الخطوات 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. اشطف غرفة العينة ثلاث مرات بماء فائق النقي.
      9. قم بمعايرة الجهاز باستخدام خرزات البوليسترين القياسية بقياس 100 نانومتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تابع القياسات بعد معايرة ناجحة.
      10. اشطف غرفة العينة ب 1× PBS.
      11. قم بتخفيف عينة الإكسوسوم بمقدار 1× PBS (تخفيف 1:500) وحملها في غرفة العينة. راقب حركة الجسيمات في الوقت الحقيقي باستخدام برنامج الآلة.
      12. احصل على البيانات وأنشئ تقرير التحليل المقابل.
      13. حدد علامات البروتين من خلال تحليل البقعة الغربية كما هو موضح في الخطوات 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. عينات إكسوسومات ليز باستخدام محلول تحلل بروتين خاص بالإكسوسومات وقياس تركيز البروتين باستخدام اختبار حمض البيسينشونينيك (BCA).
      15. جهز جل المحلول وتكديس. قم بتحميل كميات متساوية من البروتين لكل مسار وأضف 5 ميكرولتر من مؤشر البروتين لكل جل.
      16. قم بالرحلان الكهربائي بجهد ثابت 80 فولت حتى تصل جبهة الصبغة إلى هلام المعالج، ثم زد إلى 120 فولت واستمر حتى تصل جبهة الصبغة إلى أسفل الهلام.
      17. قم بقص غشاء بولي فينيليدين فلورايد (PVDF) إلى الحجم المناسب وتفعيله بنقعه في الميثانول لمدة 5 دقائق.
      18. تحضير مخزن نقل يتكون من 25 مللي مولار قاعدة تريس، 192 ملليمولار جليسين، و20٪ (v/v) ميثانول (pH = 8.3). توازن جميع مكونات النقل في مخزن النقل.
      19. قم بتجميع ساندويتش النقل بالترتيب التالي من الكاثود إلى الأنود: إسفنجة – ورق مرشح – جل – غشاء PVDF – ورق فلتر – إسفنجة. قم بإزالة أي فقاعات هوائية وإجراء نقل البروتين بتيار ثابت قدره 300 مللي أمبير.
      20. بعد النقل، اشطف غشاء PVDF لفترة وجيزة بمحلول ملحي مخزن ب Tris مع 0.1٪ Tween20 (TBST) وكتلة بحليب خالي من الدهون 5٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف.
      21. حضن الغشاء بالأجسام المضادة الأولية (مثل مضاد CD63 ومضاد TSG101) مخفف في حليب خالي من الدهون 5٪ طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع هز لطيف. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 5 دقائق لكل مرة.
      22. حضن الجسم المضاد الثانوي المناسب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، تليها ثلاث غسلات باستخدام TBST (5 دقائق لكل منها).
      23. تحضير محلول عمل جديد للتلميض الكيميائي الكهربائي (ECL) (خلط المحاليل A و B بنسبة 1:1)، وتطبيقه على الغشاء، واكتشاف الإشارات باستخدام نظام تصوير كيميائي للتلميع.

2. عزل وزراعة خلايا الكيراتينية الجلدية الأولية لدى الإنسان

  1. جمع العينات ونقلها
    1. احصل على عينات من نسيج القلفة من متبرعين ذكور أصحاء في مستشفى الشعب التابع بجامعة نينغبو.
    2. ضع نسيج القلفة المستخرج فورا في PBS بدرجة 4 درجات مئوية مع 100 U/mL بنسلين-G و100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين.
    3. نقل العينات إلى المختبر عند 4 درجات مئوية ومعالجة خلال 6 ساعات.
  2. تحضير الحوض المعقم وتجزئة الأنسجة
    1. اغمر النسيج في إيثانول بنسبة 70٪ لمدة تتراوح بين 30 ثانية إلى 3 دقائق.
      ملاحظة: قم بضبط وقت الغمر بناء على حجم الأنسجة عند التعقيم الأولي.
    2. باستخدام مقص معقم أو مشرط، قم بتشريح وإزالة الدهون تحت الجلد والأنسجة الضامة من عينة النسيج المغسولة.
    3. قم بتقطيعه إلى شظايا صغيرة (حجم الشظية <1 مم3) باستخدام شفرات جراحية معقمة.
      ملاحظة: عادة ما يستغرق تقطيع 3–4 عينات من الأنسجة أقل من 15 دقيقة. أضف كمية صغيرة من PBS أثناء التقطيع إذا بدا أن النسيج جاف.
    4. انقل العجينة المفروم إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل يحتوي على محلول هضم من 2.5 ملغ/مل من كولاجنازي النوع الأول و2.5 ملغ/مل ديسباز II. أضف 10–20 مل من محلول الهضم لكل قطعة من النسيج المفروم.
    5. حضن الخليط في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. حافظ على التحريك الخفيف عند 80 × جرام، أو حرك الأنبوب بقوة يدويا كل 20 دقيقة.
  3. الهضم الثانوي وعلاج DNase
    1. أضف 0.25٪ من تريبسين-إيدتا إلى خليط الهضم بنسبة حجم 1:5. حضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة مع تحريك لطيف.
      تحذير: التربسين مهيج. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة.
    2. أضف محلول DNase I (10 ملغ/مل) إلى الخليط بنسبة 10 ميكرولتر لكل مل من إجمالي حجم الهضم. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع تحريك لطيف.
  4. إنهاء الهضم وزراعة الخلايا الأولية
    1. أوقف الهضم الإنزيمي بإضافة كمية متساوية من DMEM مع 10٪ FBS.
    2. قم بتفكيك الخليط جيدا عن طريق استخدام النبوبات للأعلى والأسفل حوالي 20 مرة لتفكيك شظايا الأنسجة. قم بترشيح تعليق الخلية عبر مصفاة خلية بطول 100 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 50 مل.
    3. قم بعمل جهاز التعليق المركزي للخلية عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا وقطع الأنسجة.
    4. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 1 مل من وسط الزراعة الكامل (α-MEM مع 20٪ FBS، 100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين).
    5. قم بزرع الخلايا المعلقة والبذر في طبق زراعة بحجم 10 سم وأضف وسط الزراعة الكامل إلى حجم نهائي يبلغ 6 مل.
    6. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظة: قم بإضافة زراعة الخلايا الكيراتينية ب Y-27632 بتركيز نهائي يبلغ 5 ميكرومولار أثناء الزراعة.
  5. صيانة الخلايا والزراعة الفرعية
    1. قم بتحديث وسيط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة.
    2. راقب الخلايا يوميا.
      ملاحظة: عادة ما تهاجر خلايا الكيراتينية الجلدية الأولية من القطع النسيجية وتصل إلى 80-90٪ من التقاء الأشجار خلال 10-14 يوما.
    3. في الزراعة الفرعية، يتم فصل الخلايا باستخدام 0.05٪ تريبسين-EDTA عند وصولها إلى 80–90٪ التقاء القوام.
      تحذير: التربسين مهيج. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ونظارات السلامة.

3. التحقق الوظيفي لوظيفة الإكسوسومات المضادة للالتهاب من ممرات مختلفة

  1. زرع الخلايا وتحضيرها
    1. تزرع خلايا الكيراتينية الجلدية للبذور بكثافة 1.5 × 10إلى 5 خلايا لكل بئر في صفيحة مكونة من 12 بئرا. أضف 1 مل من الوسط الكامل إلى كل بئر وزرع الخلايا لمدة 24 ساعة.
    2. عندما يصل التقاء الخلايا إلى حوالي 70٪، استنشق الوسط بعناية، واغسل طبقة الخلية الأحادية بلطف مرتين باستخدام 1× PBS المسخن مسبقا.
  2. التحفيز الالتهابي وعلاج الإكسوسومات
    1. تحفز نموذج خلوي صدفي الشكل، وتحفيز الخلايا بخليط السيتوكين الالتهابي "M5" (يحتوي على IL-1α، IL-17A، IL-22، Oncostatin M، وTNF-α، كل منها بتركيز نهائي 10 نانوغرام/مل).
    2. بالنسبة لمجموعات العلاج، يتم حضن الخلايا المحفزة معا باستخدام DPSC-Exos (50 ميكروغرام لكل بئر).
    3. بالنسبة لمجموعة التحكم السالبة (NC)، أضف حجما مكاويا ل PBS بدلا من الإكسوسومات.
      ملاحظة: قم بإجراء جميع التحفيز والعلاجات في وسط خال من Y-27632 لتجنب تداخله المحتمل مع مسارات الإشارات الالتهابية.
  3. جمع العينات وتحليل qRT-PCR (مقارنة وظيفية عبر المقاطع)
    1. احصد الخلايا واستخرج الحمض النووي الريبي بعد 24 ساعة من العلاج.
    2. حلل تعبير المؤشر الالتهابي الرئيسي IL-23A.
      1. قارن التأثيرات المثبطة على تعبير IL-23A بين مجموعات علاج الإكسوسومات المشتقة من ممرات مختلفة (P2، P4، وP6) باستخدام qRT-PCR لتقييم التغيرات المعتمدة على الممرات في وظيفة الإكسوسومات.
      2. قم بإجراء qRT-PCR باستخدام ظروف الدورة التالية: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 40 دورة إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، والتلدين/التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      3. إجراء تحليل منحنى الصهر من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لتأكيد خصوصية التضخيم.
        ملاحظة: تسلسلات التمهيد: Human-IL-23A (للأمام: 5'-GAAGAGGGAGATGAGAGAGAC-3'، الخلف: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTC-3'); Human-H36B4 (الأمامي: 5'-GCAATGTGGCCAGTGTGTGTGT-3'، الخلف: 5'-GCCTTGACCTTCAGCAAG-3')

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد وتوصيف خلايا اللب الجذعية السنية
أظهرت الخلايا الجذعية الأولية للب الأسنان (DPSCs) المعزولة باستخدام البروتوكول الموصوف نموا مستقرا وشكلا ميزانيا نموذجيا للميزانشيمي أثناء التوسع الصناعي. كما هو موضح في الشكل 1، أظهرت الخلايا المضغوطة في الممرات 2 و4 و6 مجموعة متجانسة من خلايا تشبه الخلايا الليفية على شكل المغزل، دون وجود اختلافات شكلية واضحة أو علامات تمايز تلقائي عبر المقاطع. تم زراعة جميع ممرات DPSCs ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول الموحد الموضح في هذه الدراسة إطارا قابلا للتكرار لعزل الخلايا الجذعية للب الأسنان (DPSCs)، وإنتاج الإكسوسومات المشتقة من DPSC (DPSC-Exos)، والتحقق الوظيفي لهذه الحويصلات عبر ممرات خلايا متعددة. تسلط المناقشة أدناه الضوء على الاعتبارات الإجرائية الحيوية، واستراتيجيات التحسين، والقيود المنهجية، والأهمية الأوسع لهذا سير العمل في أبحاث الطب التجديدي.

تعتمد موثوقية هذا البروتوكول على مراقبة جودة صارمة في المراحل الأولى، بدءا من مصدر الأنسجة والتعامل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة ليعلنوا عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا المشروع من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82273554). يشكر المؤلفون مختبر هندسة المواد الحيوية وتجديد الأنسجة في مستشفى نينغبو لطب الأسنان على الدعم المستمر، ويشكرون أعضاء الفريق الحاليين والسابقين على مناقشاتهم القيمة. كما يشكر المؤلفون الدكتورة ليليانغ شين من مستشفى الشعب التابع لجامعة نينغبو على مساعدته السخية ودعمه القوي في توفير عينات أنسجة القلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

```html

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05% Trypsin-EDTA SolutionGibco25300054نظرًا لقوة الهضم الخاصة به، يتم استخدام التربسين على نطاق واسع في فصل الخلايا، وتمرير الخلايا الروتيني، وفصل الأنسجة الأولية.
100 mm Cell and Tissue Culture DishBiofilTCD010100معالجة السطح / غير المعالجة
معقمة وخالية من البيروجينات
خالية من DNase / RNase
100 nm PS beadsThermo Fisher3100Aقبل إجراء تجارب تحليل مسار الجسيمات النانوية (NTA)، يجب معايرة الجهاز باستخدام معيار بحجم جسيمات معروف بدقة (100 نانومتر).
15-mL Bulk Conical Centrifuge TubeKIRGENKG2611معقمة وخالية من RNase / Dnase والبيروجين
200-mesh Formvar-carbon-coated copper gridZhongjing Scientific InstrumentsAZH200يدعم عينات الإكسوزم للتصوير TEM. تعمل طبقة Formvar-carbon على تعزيز التصاق العينة وتوصيلها، بينما توفر شبكة 200-mesh مساحة مفتوحة كافية لتوزيع الجسيمات بشكل متساوي وتصوير مستقر.
37 °C IncubatorThermo Scientific51032877يوفر حاضنة CO2 بدرجة 37 بيئة مثالية في المختبر.
50-mL Bulk Conical Centrifuge TubeKIRGENKG2811معقمة وخالية من RNase / Dnase والبيروجين
Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5]Abcamab193349Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5] (ab193349) هو جسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر يكشف CD63 في Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. مناسب ل الإنسان.
Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]Abcamab125011Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] (ab125011) هو جسم مضاد أحادي النسيلة من الأرانب يكشف TSG101 في Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. مناسب ل الإنسان، الفأر، الجرذ.
Automated cell counterCountstarIC1000عداد خلايا آلي لعد الخلايا بسرعة ودقة
BCA Protein Assay KitBeyotimeP0012تتمتع بعلاقة خطية جيدة ضمن نطاق التركيز من 50 - 2000 μg/ml.
Benchtop CentrifugeBIORIDGETD5الطرد المركزي المكتبي لفصل العينات بسرعة وكفاءة في إعدادات المختبرات
Biological safety cabinetThermo Scientific1379Cabinet Biological Safety هو جهاز احتواء معقم يحمي المشغلين والعينات والبيئات من المخاطر البيولوجية عن طريق ترشيح مسببات الأمراض المحمولة جوا ومنع التلوث المتبادل أثناء العمل الميكروبيولوجي.
Cell Culture Plate,12-WellEppendorf0030721110معالجة بالزرع النسيجي، مع غطاء، قاع مسطح
معقمة وخالية من المواد البيروجينة التي يمكن اكتشافها، RNase & DNase، DNA بشري & بكتيري
غير سامة للخلايا
Cell Culture Plate,96-WellNEST 701001 0714Bمعالجة بالزرع النسيجي، بوليستيرين، غير بيرويجيني، معقم
CellsavingNCMC40100خالٍ من المصل وخالٍ من البروتين الحيواني
وسط تجميد الخلايا
Collagenase, Type I, powderGibco17100017الكولاجيناز هو بروتين يقطع الرابطة بين حمض أميني محايد (X) والجلايسين في التسلسل Pro-X-Gly-Pro، والذي يوجد بتردد عالٍ في الكولاجين.
Dispase II, powderGibco17105041Dispase II (البروتياز الحيودي) هو إنزيم أمينو-إندولوبيبتياز يحلل الروابط الببتيدية الطرفية N للبقايا الأحماض الأمينية غير القطبية.
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco C11995500BT[+]4.5g/L D-Glucose
[+]L-Glutamine
[+]110mg/L Sodium Pyruvate
Evo M-MLV Reverse Transcription KitAGAG11707عامل نسخ عكسي مخصص لـ Real Time RT-PCR. إنه يستخدم Evo M-MLV reverse transcriptase مع قدرة تمديد قوية، مما يتيح تخليق cDNA بشكل فعال في فترة زمنية قصيرة.
Exosome Concentration SolutionUmibioUR52111استخراج الإكسوزم من سوبرناtant الخلية
Exosome Depleted Fetal Bovine SerumUmibioUR50202تم الحصول على المصل الجنيني البقري الخالي من الإكسوزم عن طريق ترشيح المصل الجنيني البقري الصحي الذي تم جمعه بشكل معقم، وتمت إزالة ≥99% من الإكسوزم الداخلي في المصل الجنيني البقري. كان له نفس معدل نمو الخلايا والمورفولوجيا مثل المصل الجنيني البقري قبل المعالجة.
Fetal Bovine Serum, qualified, AustraliaGibco10099141مستوى الهيموغلوبين: ≤30 mg/dL (المستويات بشكل روتيني ≤25 mg/dL)
Human-H36B4Sangon BiotechSB002الاتجاه: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3'; العكس: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Human-IL-23ASangon BiotechSB002الاتجاه: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; العكس: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
Inverted Biological MicroscopeLeicaDMI1يمكن ملاحظة الخلايا أو الأنسجة الحية مباشرة التي تلتصق بجدران الحاويات مثل أباريق الزرع وأطباق بتري.
Minimum Essential MediumGibco C12571500BT [+]L-Glutamine
[+]Ribonucleosides
[+]Deoxyribonucleosides
NcmSpin Rapid RNA Extraction KitNCMM5106يمكن لهذا Kit استخراج RNA الكلي بسرعة من ما يصل إلى 3,000,000 خلية وما يصل إلى 10 ملغ من الأنسجة.
Penicillin-StreptomycinNCMC100C5يحتوي على 10,000 وحدة/مل من البنسلين و 10,000 ميكروجرام/مل من الستربت

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lotfy, A., AboQuella, N. M., Wang, H. Mesenchymal stromal/stem cell (MSC)-derived exosomes in clinical trials. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 66 (2023).
  2. Shan, Z., Su, X., Liu, L., Duan, S. Liquid biopsy based on EV biomarkers: a new frontier for early diagnosis and prognosis assessment of cancer at ESMO 2024. Nano TransMed. 4, 100084 (2025).
  3. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 81 (8), 531-535 (2002).
  4. Pineda, J. R., et al. In vitro preparation of human Dental Pulp Stem Cell grafts with biodegradable polymer scaffolds for nerve tissue engineering. Methods Cell Biol. 170, 147-167 (2022).
  5. Chansaenroj, J., et al. Potential of Dental Pulp Stem Cell Exosomes: Unveiling miRNA-Driven Regenerative Mechanisms. Int Dent J. 75 (2), 415-425 (2025).
  6. Dhar, R., Subramaniyan, V. Exosomes: a next-generation cancer theranostics. Nano TransMed. , 100096 (2025).
  7. Wang, Y., et al. Therapeutic effect of mesenchymal stem cells and their derived exosomes in diseases. Mol Biomed. 6 (1), 34 (2025).
  8. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduction Targeted Ther. 9, 17 (2024).
  9. Li, L., Ge, J. Exosome‑derived lncRNA‑Ankrd26 promotes dental pulp restoration by regulating miR‑150‑TLR4 signaling. Mol Med Rep. 25 (5), 152 (2022).
  10. Lin, T., et al. Inhibition of chondrocyte apoptosis in a rat model of osteoarthritis by exosomes derived from miR‑140‑5p‑overexpressing human dental pulp stem cells. Int J Mol Med. 47 (3), 7 (2021).
  11. Liang, X., et al. Dental pulp mesenchymal stem cell-derived exosomes inhibit neuroinflammation and microglial pyroptosis in subarachnoid hemorrhage via the miRNA-197-3p/FOXO3 axis. J Nanobiotechnology. 22 (1), 426 (2024).
  12. Lin, T. Y., et al. 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside-stimulated dental pulp stem cells-derived exosomes for wound healing and bone regeneration. J Dent Sci. 20 (1), 154-163 (2025).
  13. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
  14. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335 (2019).
  15. Li, P., et al. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  16. Ludwig, A. K., et al. Precipitation with polyethylene glycol followed by washing and pelleting by ultracentrifugation enriches extracellular vesicles from tissue culture supernatants in small and large scales. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1528109 (2018).
  17. Veerman, R. E., et al. Molecular evaluation of five different isolation methods for extracellular vesicles reveals different clinical applicability and subcellular origin. J Extracell Vesicles. 10 (9), e12128 (2021).
  18. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
  19. Gao, M., et al. Comparison of Yield, Purity, and Functional Properties of Large-Volume Exosome Isolation Using Ultrafiltration and Polymer-Based Precipitation. Plast Reconstr Surg. 149 (3), 638-649 (2022).
  20. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell Tissue Res. 353 (1), 65-78 (2013).
  21. Noda, S., et al. Effect of cell culture density on dental pulp-derived mesenchymal stem cells with reference to osteogenic differentiation. Sci Rep. 9 (1), 5430 (2019).
  22. Ahmad, P., et al. Isolation methods of exosomes derived from dental stem cells. Int J Oral Sci. 17 (1), 50 (2025).
  23. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971 (2021).
  24. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  25. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  26. Yakubovich, E. I., Polischouk, A. G., Evtushenko, V. I. Principles and problems of exosome isolation from biological fluids. Biochem (Mosc) Suppl, Membr Cell Biol. 16 (2), 115-126 (2022).
  27. Li, Y., et al. Dental stem cell-derived extracellular vesicles as promising therapeutic agents in the treatment of diseases. Int J Oral Sci. 14, 2 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة