يستخدم هذا البروتوكول تقدير الوضعية بواسطة بايثون لتتبع نقاط الجسم الرئيسية في ذبابة الفاكهة الزوجية، مما يسهل القياس التلقائي للسلوكيات الاجتماعية الدقيقة، خاصة في التفاعل الاجتماعي، بالإضافة إلى خرائط الحرارة ومسارات الحركة.
مقالة منهجية
بروتوكول التتبع والقياس الآلي للسلوك في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر
Anye Wu*1 , Nan Jiang*2 , Meiyu Chen*3 , Xiaojie Hu*2 , Yuling Mao*1 , Chao Gong4 , Xingyuan Shi5 , Shengqiang Chen3
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine; Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases; Guangdong Provincial clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology; Guangdong Hong Kong-Macao Greater Bay Area Higher Education Joint Laboratory of Maternal-Fetal Medicine; The Third Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical College, Guangzhou Medical University, 3School of Health Management, Guangzhou Medical University, 4School of Marxism, Guangzhou Medical University, 5The Fifth Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University
* These authors contributed equally
يفتح في علامة تبويب جديدة
في هذه المقالة
ملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
لتطوير أداة تحليلية مفتوحة المصدر تتغلب على قيود طرق التتبع التقليدية القائمة على الجدارات المركزية، نقدم بروتوكولا لتحليل التفاعلات الاجتماعية بدقة في أزواج ذبابة الفاكهة التي تتصرف بحرية. على وجه التحديد، يستلهم هذا البروتوكول من إطار الشبكة عالية الدقة (HRNet) لتتبع خمس نقاط رئيسية تشريحية في الوقت نفسه—الرأس، الصدر، البطن، وأطراف الأجنحة اليمنى واليسرى—بهدف توليد بيانات إحداثيات عالية الدقة للتحليل الكمي اللاحق للسلوكيات الاجتماعية. يوفر هذا البروتوكول سير عمل كامل يعتمد على بايثون وواجهة مستخدم رسومية (GUI) صممناها، بما في ذلك بناء مجموعات البيانات، وتدريب النماذج، واستخراج الإحداثيات الآلي، إلى جانب وحدات متكاملة لإنشاء خرائط الحرارة للإشغال المكاني، ومسارات الحركة، ونسب التفاعل الاجتماعي في الذباب. للتحقق من صحة هذا الإطار، تم اختباره باستخدام سلالات مستخدمة على نطاق واسع، w1118 وكانتون-S (CS). أظهرت نتائجنا استقرار الكشف عن نقاط المفتاح وكشفت عن فروق خاصة بالنمط الجيني في الاستخدام المكاني وبنية القاطرة. توفر هذه المنهجية أساسا قابلا للتوسع لعلم السلوك الكمي والتحليل الآلي للتفاعلات الاجتماعية في ذبابة الفاكهة، مع تقليل جهد التعليق اليدوي وتحسين قابلية التكرار.
المقدمة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر هي كائن نموذجي واسع الاستخدام يتمتع بأدوات جينية قوية ودوائر عصبية محددة جيدا تتيح التشريح الآلي للسلوك1. لديها مجموعة واسعة من السلوكيات الاجتماعية، بما في ذلك التودد والعدوانية، ولديها قدرة تعلم قوية 2,3,4,5,6,7,8. كل منها يتكون من عناصر حركية مميزة تتحكم بها نظام عصبي صغير لكنه منظم بشكل ممتاز. ومن المهم أن القياس الدقيق لوضعية الجسم ضروري لفهم الأسس العصبية لاختيار الفعل لأن العديد من هذه السلوكيات تحتوي على رموز وضعية دقيقة تشفر معلومات السياقية والحالة الداخلية9،10.
على الرغم من الحاجة إلى دقة ذبابة واحدة لالتقاط الفروق الفردية، لا تزال العديد من الاختبارات السلوكية عالية الإنتاجية في ذبابة الفاكهة تعتمد على مؤشرات على مستوى المجموعة11. تشمل اختبارات السلوك عالية الإنتاج اختبارات T-maze للتفضيل الاجتماعي12،13، واختبارات التباعد الاجتماعي التي تقيس المسافة بين الطيران، أو نماذج التجمع/التجنب تحت التحفيز الحسي14 التي يمكنها التقاط اتجاهات السكان بكفاءة. ومع ذلك، فهي بطبيعتها تتضمن المتوسط بين الأفراد، مما يحجب التباين في تسلسلات الأفعال والبنية الزمنية للتبادلات الاجتماعية. على مر السنين، اعتمدت محاولات الانتقال نحو التعرف على كل ذبابة على طرق مقيدة وظيفيا، مثل الكشف القائم على القواعد باستخدام عتبات حركية، وطرح الخلفية باستخدام تتبع المركزيات، والتعليق اليدوي على الفيديو 15,16,17,18. نتيجة لذلك، غالبا ما يتم تجاهل السلوكيات المنفصلة مثل الاندفاع، أو النقر، أو تهديدات الأجنحة أو تسميتها بشكل خاطئ، مما يستلزم تصحيحا يدويا كبيرا. وقد قيدت هذه القيود دراسات ميكانيكية تتطلب محاذاة زمنية دقيقة بين النشاط العصبي والأفعال الفردية.
حل ثوري متوفر الآن بفضل التطورات الأخيرة في رؤية الحاسوب وتقدير الوضعيات المعتمد على التعلم الآلي. تمكن أطر العمل مفتوحة المصدر مثل DeepLabCut19 وSLEAP20 من كشف أجزاء الجسم بدون علامات، وتصنيف قابل للتوسع للأفعال المنفصلة، والحفاظ على الهوية الفردية حتى أثناء التفاعلات القريبة. تتغلب هذه الميزات على عيوب الأساليب السابقة القائمة على المجموعات والقواعد وتمكن من القياس المتكرر للسلوكيات الاجتماعية المعقدة.
تتميز التفاعلات الفردية في ذبابة الفاكهة بخصائص حركية فريدة تشير إلى تطور التفاعلات الاجتماعية. العدوانية، على سبيل المثال، تشمل السلوكيات النموذجية مثل الاندفاع، وتهديد الأجنحة، والمصارعة، وكلها تمثل مراحل تصاعد في الصراع21,22. يعرف الخطبة بالمثل من خلال الاتجاه، وتمديد الجناح أحادي الجانب مع إنتاج الأغنية، والنقر، ومحاولة التزاوج، والتي تجتمع لتشكل التسلسل الزمني لتفاعلات التزاوج23. التقاط هذه الزخارف يعتمد على التعرف الدقيق على وضعية الجسم وحركات المفاصل24،25. عمليا، يتطلب أخذ العينات دقة مكانية وزمنية عالية على مدى فترات تسجيل طويلة لضمان إمكانية اكتشاف الأنماط الحركية الدقيقة ومحاذاتها بدقة مع النشاط العصبي25،26.
هنا، نقدم إطارا مفتوح المصدر قائم على الرؤية للتعرف الآلي على خمس نقاط رئيسية تشريحية—الرأس، الصدر، البطن، اليسار والأيمن27. يتكون النظام من سير عمل كامل لبناء مجموعات البيانات، وتدريب النماذج، واستخراج الإحداثيات، وينتج بيانات سلاسل زمنية عالية الدقة مناسبة لتصنيف سلوكيات قابل للتخصيص. من خلال أتمتة عمليات التعليق اليدوي وتوحيد سير العمل التحليلي، تمكن طريقتنا من التحليل الكمي الدقيق لسلوكيات التفاعل الاجتماعي، مما يزيد من الكفاءة وقابلية التكرار مع تقليل الوقت والجهد المطلوبين للتحليل بشكل كبير.
للتحقق من موثوقية النظام، طبقناه على سلالين مختبريين شائعين، w1118 وكانتون-S (CS)، ولاحظنا اكتشافا مستقرا لنقاط المفتاح عبر الإطارات، بالإضافة إلى فروقات محددة في النمط الجيني في الإشغال المكاني، وخصائص المسار، ومؤشرات التفاعل الاجتماعي بناء على مسافة الرأس وزاوية الاتجاه. يمكن للباحثين تقييم ملاءمة هذا البروتوكول بناء على الدقة المكانية والزمانية المطلوبة (≥30 إطار في الثانية، ≤0.5 مم/بكسل) وظروف تسجيل الفيديو (الإضاءة والتباين). يمكن تحديد حجم البكسل مباشرة من إعدادات الكاميرا. يمكن وضع ذبابة فاكهة بطول جسم مقاس داخل مجال الرؤية للمعايرة. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للسيناريوهات التالية: الحاجة إلى تتبع ذبابة الفاكهة المتفاعلة بحرية في نفس الوقت وتمييز هويتهما الفردية؛ مع التركيز على الوضعيات الدقيقة (مثل زاوية الرأس والمسافة) بدلا من وضع مركز الدماغ فقط؛ مدة التسجيل تتجاوز 10 دقائق عندما لا يكون التعليق اليدوي ممكنا؛ مما يتطلب محاذاة زمنية على مستوى ميلي ثانية بين الأحداث السلوكية والنشاط العصبي (مثل تصوير الكالسيوم أو الفيزيولوجيا الكهربائية) في التحليلات اللاحقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير الذبابة
- جمع ووضع جنس للذباب الذي يبلغ عمره حوالي 3-4 أيام تحت تخدير قصير بمقدار CO₂ قبل التجارب.
ملاحظة: قد تختلف مدة التخدير ومعدل تدفق ثاني أكسيد الكربون حسب مواصفات وضغط أسطوانة ثاني أكسيد الكربون المستخدمة في كل مختبر. يجب مراقبة الذباب باستمرار أثناء التخدير، ويجب الحفاظ على التعرض لثاني أكسيد الكربون فقط حتى يتم تخدير الذباب بالكامل ويظهر توقفا تاما عن الحركة. - ضع كل ذبابة بشكل منفصل في أنبوب فالكون بسعة 50 مل يحتوي على وسط دقيق الذرة–الأجار–الجلوكوز–الخميرة القياسي.
- حافظ على الذباب عند 25 درجة مئوية خلال دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة حتى الاستخدام.
2. بناء الساحة
- جهز لوحين أكريليك شفافين بحجم 3 مم ولوح بولي إيثيلين واحد بقطر 3 مم.
- اقطع أربع حجرات دائرية (قطر كل منها 35 مم) في مركز صفيحة البولي إيثيلين.
- استخدم مشابك للصق إحدى الألواح الأكريليكية بلوحة البولي إيثيلين لتشكيل قاعدة الحجرة؛ احتفظ بلوحة الأكريليك الثانية كغطاء قابل للإزالة.
الشكل 1: مخطط المجال السلوكي وإعداد التصوير. (أ) يتم تصوير بناء غرفة مراقبة مخصصة في الرسم التوضيحي. تتكون الحجرة من ثلاث طبقات أساسية: صفيحة أساس أكريليك شفافة بحجم 3 مم؛ صفيحة بولي إيثيلين بقطر 3 مم مع أربعة فتحات دائرية قطرها 35 مم تستخدم كآبار حجرة فردية؛ ولوحة أكريليك ثانية تعمل كغطاء قابل للإزالة. (ب) يستخدم مشبك محول بزاوية 90° لتركيب الكاميرا عموديا على عمود بصري بقطر 40 سم. للتصوير من الأعلى إلى الأسفل، توضع الكاميرا مباشرة فوق ساحة المراقبة متعددة الطبقات مع محورها البصري عمودي على سطح الحجرة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. إعداد التصوير
- قم بتجميع عمودين بصريين بقطر 20 سم وعمود واحد بقطر 40 سم مع مشابك محول بزاوية 90°.
- ثبت الكاميرا (1280 × 1024 بكسل) عموديا على عمود 40 سم، محاذيا عموديا على سطح الساحة، واضبط معدل الإطارات على 150 إطار في الثانية.
- ضع الساحة على لوحة LED بيضاء قابلة للتعتيم بعرض 25 سم × 25 سم مغطاة بطبقة انتشار من الفتحة.
- اضبط الإضاءة إلى حوالي 1500 لوكس على سطح الساحة.
ملاحظة: تأكد من بقاء حواف الأجنحة مرئية في المعاينة الثنائية. تجنب >2000 لوكس لمنع ظهور الآثار الناتجة عن الحرارة، حيث قد يغير الذباب حركته أو توزيعه الطبيعي بسبب الإجهاد الحراري الناتج عن مصدر الضوء.
4. إجراءات التسجيل
- ضع فوط رغوية بحجم 3 سم تحت كل زاوية من الساحة لتثبيتها.
- نقل أزواج الذباب تحت تخدير ثاني أكسيد الكربون إلى غرف؛ أغلقها بلوحة الأكريليك العلوية.
- دع الذباب يتأقلم لمدة 40 دقيقة قبل التسجيل.
- ابدأ الحصول على الفيديو باستخدام MIAS.exe27: اضغط q للبدء واضغط C للتوقف.
ملاحظة: يؤدي ذلك إلى تسجيلات فيديو مستمرة لأزواج الذباب المتفاعلة بحرية تحت ظروف موحدة.
5. تعريف لوحة النشاط الاجتماعي
- شغل السكربت المسبق: بايثون SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
ملاحظة: جميع نصوص البرمجة مقدمة في الملف التكميلي 1. - قم بتوضيح مساحة الحجرة وتعيين بيانات وصفية على شكل Genotype_age (أيام) × 1 (عدد الغرف). (على سبيل المثال، CS_3 × 1)
- قم بضبط شريط عتبة الكشف حتى تصبح الأجنحة شبه غير مرئية في الصورة الثنائية لضمان طرح الخلفية المثلى ورؤية الأجنحة.
6. إعداد مجموعة البيانات
- أنشئ مجلد بيانات جديد عن طريق تشغيل:
بايثون tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (فترة أخذ عينات الإطار)
ملاحظة: تم تعديل معامل فترة أخذ عينات الإطار ("10") من بروتوكول27 منشور سابقا. القيم المنخفضة تزيد من كثافة أخذ العينات والحمل الحسابي، في حين أن القيم الأعلى تقلل من الطلب الحسابي ويمكن تعديلها بناء على أداء الأجهزة المتاحة ومتطلبات التجريب. - قم بإعداد مسار الفيديو ومسار مجموعة البيانات في 'الأدوات/SoAL_DatasetUtils.py'
- واجهة وضع العلامات اليدوية لإطلاق التشغيل:
>python tools/SoAL_LabelUI.py DATASETNAME- التنقل في الإطار: اضغط على مفتاح المسافة أو زر Z للانتقال إلى الإطار التالي أو السابق على التوالي. بدلا من ذلك، استخدم شريط التمرير في خط الزمن للتنقل.
- وضع علامات النقاط الرئيسية: انقر على الموضع الصحيح للذبابة في كل صورة (بتسلسل محدد: الرأس، الصدر، البطن، الجناح الأيسر، والجناح الأيمن) لتحديد النقاط الرئيسية الخمس.
- اختيار نقاط المفاتيح: اضغط على مفاتيح الأرقام لاختيار نقطة مفتاح (تشير إليها دائرة بيضاء). النقرة التالية ستعيد تعيين رقم جديد لنقطة المفتاح المختارة.
- الحفظ: أغلق النافذة أو اضغط على زر D لحفظ نتائج التعليقات.
ملاحظة: يتكون أرشيف مجموعة التدريب الكامل من مكونين: دليل الصور وملف annotation.json.
7. تدريب النماذج
- قسم مجموعة البيانات إلى مجموعات تدريب ومراجعة:
بايثون tools/SoAL_DatasetGen.py تقسيم أسماء المجموعات
سيتم إنشاء مجلدين جديدين في 'dataset/'. - تكوين معلمات التدريب في hrnet/fly_w32.yaml:
عامل الدوران: 15°
عامل المقياس: 0.35
عامل السطوع: 0.25
حجم الدفعة: 24
الحقبة: 200 - تشغيل برنامج التدريب:
python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
إنهاء مجموعات التدريب عندما يصل متوسط الدقة (AP) إلى هضبة؛ احتفظ بأفضل نموذج (AP > 90٪). - التحقق من صحة النموذج باستخدام:
python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
النتيجة: نموذج قوي قائم على HRNet لاكتشاف نقاط المفتاح متعددة الطيران.
8. شغل برنامج الكشف
- انسخ ملفات الفيديو الجديدة إلى مجلد الفيديو.
- قم بالتعليق على البيانات الوصفية كما هو موضح في الخطوة 5.
- تشغيل برنامج الكشف: بايثون SoAL_KptDetect.py الجميع
- فحص نتائج الكشف:
أدوات بايثون/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.cvs/xslx)
النتيجة: إحداثيات ثنائية الأبعاد لخمس معالم تشريحية لكل رحلة عبر الإطارات.
9. القياس السلوكي
- شغل تطبيق واجهة مستخدم رسومية مستقل للتحليل (الملف التكميلي 2) واستورد ملفات الإحداثيات إلى الواجهة.
- توليد خرائط الحرارة المكانية (كثافة احتمالية مواقع الساحة).
- إعادة بناء مسارات الحركة من سلسلة الإحداثيات الزمنية.
- أنشئ بيانات التفاعل الاجتماعي، بما في ذلك مسافة الرأس، والاتجاء، والحالة الاجتماعية المستخلصة.
النتيجة: تصور موحد لاستخدام الفضاء وديناميكيات الحركة الخاصة بالنمط الجيني.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يوضح الشكل 1 هندسة الساحة، وتكوين الإضاءة، ووضع الكاميرا المستخدمة لتسجيل التفاعلات الاجتماعية الطبيعية في ذبابة الفاكهة. يضمن هذا الإعداد إضاءة متجانسة وظروف تصوير مستقرة مناسبة لتقدير الوضعية واستخراج الإحداثيات.
تم تطبيق تقدير وضعية آلي على جميع الفيديوهات المسجلة لاستخراج إحداثيات ثنائية الأبعاد لنقاط مفتاحية تشريحية محددة مسبقا لكل ذبابة. حدد النموذج باستمرار مفاصل الرأس والصدر والبطن والأجنحة عبر الإطارات، حتى أثناء...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تظهر دراستنا أن تقدير الوضعية القائم على التعلم الآلي يوفر طريقة قابلة للتوسع وموثوقة لقياس التفاعلات الاجتماعية الدقيقة في ذبابة الفاكه. يتغلب على قيود النهج المعتمدة على المركزيات 15,16,17,18 من خلال تتبع خمس نقاط رئيسية تشريحية في أزواج متفاعلة بحرية، مما يسمح بالحصول على معلومات زاوية يوفرها محور الجسم والمسافة الرأسية إلى الرأس التي يتم استنتاجها من نقاط الرأس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب مالي في المصالح.
شكر وتقدير
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
نشكر الدكتور جينغيوان تشانغ في كلية الدراسات العليا بجامعة قوانغتشو الطبية على توفير وصيانة إعداد التصوير.
التمويل: مشروع التخصصات الطبية الكبرى في قوانغتشو (2025-2027)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agar | BioFroxx | 8211GR500 | |
| camera(MV-CU013-A0UC) | Hikvision | MV-CU013-A0UC | |
| Carbon Dioxide | Messer | 124-38-9 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | BioFroxx | 1179GR500 | |
| Drosophila Narrow Vials (Falcon tube) | Biolgix | 51-0500 | |
| Ethanol | Chron Chemicals | 64-17-5 | |
| LED panel | / | / | custom-made |
| Methylparaben | Sigma | 99-76-3 | |
| polyethylene plate | / | / | custom-made |
| Python | / | version 3.6 | |
| Sucrose | DaMao | 57-50-1 | |
| transparent acrylic plates | / | / | custom-made |
| Yeast | Angel | 100004237033 |
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن