الفحص عالي الإنتاجية للطافرات العصية المثلجة التي تنتج حمض اللاكتيك L-اللاكتيك وتعمل باستخدام منصة ميكروفلويدية آلية للقطرات

Xin Da; Shuang Li; Qingyuan Wang; Xunxun Luo; Dezhi Geng; Xiaojie Guo; Liyan Wang; Dongliang Jiang; Yi Wang; Xin-Hui Xing; Zhenglian Xue; Chong Zhang

doi:10.3791/71458

مقالة منهجية

الفحص عالي الإنتاجية للطافرات العصية المثلجة التي تنتج حمض اللاكتيك L-اللاكتيك وتعمل باستخدام منصة ميكروفلويدية آلية للقطرات

DOI:

10.3791/71458

⸱

يوليو 28, 2026

Xin Da^*¹^,² , Shuang Li^*² , Qingyuan Wang³ , Xunxun Luo² , Dezhi Geng⁴ , Xiaojie Guo⁵ , Liyan Wang⁵ , Dongliang Jiang³ , Yi Wang²^,⁶^,⁷ , Xin-Hui Xing²^,⁸^,⁹^,¹⁰ , Zhenglian Xue¹ , Chong Zhang²^,⁶^,⁷^,¹⁰

¹College of Biology and Food Engineering, Anhui Polytechnic University, ²Ministry of Education Key Laboratory for Industrial Biocatalysis, Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, ³Henan Jindan Lactic Acid Technology Co., Ltd., ⁴Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School, ⁵Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., ⁶Beijing Key Laboratory of Recombinant Proteins and Biomanufacturing, ⁷State Key Laboratory of Green Biomanufacturing, ⁸Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School, ⁹Key Laboratory of Active Proteins and Peptides, Green Biomanufacturing of Guangdong Higher Education Institutes, Tsinghua Shenzhen International Graduate School, ¹⁰Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول سير عمل قياسي للفحص عالي الإنتاجية للكائنات الدقيقة الصناعية. يتضمن بناء مكتبة للطفرات عبر الطفرات بتقنية ARTP، وإجراء فحص إيجابي للقطرات باستخدام الميكروفلويديكس الآلي، ثم التحقق من النتائج. تم التحقق من موثوقية سير العمل من خلال فحص سلالات B. coagulans عالية الإنتاجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد التصنيع الحيوي الصناعي على الكائنات الدقيقة لتصنيع المنتجات المستهدفة بكفاءة تحت ظروف هندسية. ومع ذلك، غالبا ما تفتقر السلالات البرية إلى القدرة على ذلك بسبب شبكاتها الأيضية الأصلية. لذلك، فإن الفحص السريع والدقيق للسلالات عالية الأداء من مكتبات الطفرات واسعة النطاق هو خطوة حاسمة في التكاثر الصناعي للميكروبات. في السنوات الأخيرة، جذبت تقنية الميكروفلويديك للقطرات اهتماما كبيرا بسبب قدرتها العالية على الإنتاجية، واستهلاكها المنخفض، وقدرتها على تقسيم الخلايا الواحدة، مما أدى إلى تطوير العديد من أنظمة الفرز أحادية الخلية. تم تقديم بروتوكول فحص عالي الإنتاجية للسلالات الميكروبية الصناعية باستخدام منصة ميكروفلويدية قطرية آلية. يتكون سير العمل المتكامل من أربع مراحل رئيسية: بناء مكتبة طفرات عبر الطفرات الجوية وبلازما درجة حرارة الغرفة (ARTP)؛ تغليف خلية واحدة عالي الكفاءة وزراعة دقيقة محكمة داخل قطرات بمقياس بيكوليتر؛ حقن بيكو الدقيق لمستشعر حيوي فلوري، يليه فرز القطرات المنشطة بالفلورية (FADS) لعزل القطرات التي تحتوي على متغيرات عالية الإنتاج؛ والتحقق من صحة السلالات المرشحة المصنفة من خلال التخمير بالميكروبليت والشفرات الشاك-فلاسك. يقصد بوجود سير عمل فحص كامل ومتكامل كقالب موحد، ويتم إثبات التحقق من ذلك من خلال عزل الطفرات المنتجة لحمض اللاكتيك عالية الإنتاج في B. coagulans كمثال محدد. تقدم هذه المنصة الآلية عالية الإنتاجية حلا تقنيا قويا مع إمكانات كبيرة لتسريع التكاثر الصناعي للسلالات عالية الأداء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم التكنولوجيا الحيوية الصناعية الكائنات الدقيقة والإنزيمات كمحفزات حيوية لإنتاج منتجات ذات قيمة على نطاق واسع. يعتبر هذا النهج أكثر صداقة للبيئة وكفاءة من التصنيع الكيميائي التقليدي. ومع ذلك، فقد تطورت الشبكات الأيضية الطبيعية للكائنات الدقيقة لتعطي الأولوية لبقائها وتكاثرها بدلا من التخليق الفعال للمنتجات التي يرغب بها البشر. نتيجة لذلك، غالبا ما يكون التربية الميكروبية عالية الإنتاجية ضرورية لتلبية متطلبات بيئات الإنتاج الصناعية ذات الشروط الصارمة ^1,2,3. تتضمن هذه العملية بناء مكتبات طفرات ميكروبية واسعة النطاق بسرعة من خلال الطفرات الفيزيائية أو الكيميائية، تليها زراعة واكتشاف ظاهري للطفرات ذات الأنماط الجينية المميزة. يتم اختيار جزء صغير فقط من السلالات المتفوقة. ومع ذلك، فإن تقنيات الفحص التقليدية القائمة على الألواح والميكرولوح تعاني من الإجراءات المعقدة، وانخفاض الإنتاجية، والتكلفة العالية. هذا الاختناق، إلى جانب الاستهلاك الكبير للمستهلكات والكواشف، يؤدي إلى كفاءة منخفضة بشكل عام لتربية الميكروبات ^4,5.

برزت ميكروفلويدكس القطرات مؤخرا كحل تحويلي لهذا التحدي. على عكس فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS)، الذي لا يناسب فحص المنتجات المفرزة بسبب الانتشار السريع للجزيئات بعيدا عن الخلية، فإن فرز القطرات المنشطة بالفلورة (FADS) يحيط بالخلايا الفردية في مفاعلات دقيقة مقسمة على مستوى بيكوليتر ^6,7,8. يمنع هذا العزل الفيزيائي التنافس بين الإجهاد، ويتيح تراكم محلي للمستقلبات المفرزة، ويسمح بالكشف الكمي عنها عبر حساسات حيوية فلورية. وبالتالي، أثبتت FADS أنها منصة مثالية للفحص عالي الإنتاجية لمختلف المنتجات خارج الخلية، بما في ذلك الأحماض الأمينية، والأحماض العضوية، والإنزيمات. طور فريق جهاز GECFINDER الحيوي المشفر وراثيا الفلوريسنت، وبالدمجية مع FADS نجحوا في فحص السلالات المنتجة للفينيل ألانين العالي وحسنوا كفاءة الفحص بأكثر من 1000^ضعف. أنشأت مجموعة أخرى منصة فرز قطرات منشطة بالفلورة مع مستشعر حيوي مشفر وراثيا لفحص عالي الإنتاجية لسلالات منتجة لحمض 3-ديهيدروشيكيميك في الإشريكية القولونية، كما حسن نظام FADS المحسن بشكل كبير كفاءة الفحص ومكن عزل السلالات الطفرة مع إنتاج محسن^{بشكل ملحوظ 10}. طبق بعض الباحثين تقنية FADS على هندسة بوليميراز Bst DNA، وتم تطبيق الطفرات المكتسبة التي تتمتع باستقرار حراري معزز ونشاط إزاحة الخيوط بشكل كبير على كشف LAMP الذي قلل زمن التفاعل من 40 دقيقة إلى 10 دقائق^و11.

ومع ذلك، لا يزال تحويل هذه التطورات التكنولوجية إلى سير عمل تطوير التيار الصناعي الروتيني تحديا. تفتقر العديد من أنظمة الميكروفلويديك القطرية التجارية، رغم أجهزتها المتطورة، إلى إجراء تشغيل قياسي كامل وبديهي وقابل للتكرار مخصص لفحص الظاهرة الميكروبية. لسد هذه الفجوة، تم اعتماد منصة ميكروفلويدية قطرات آلية تدمج التحكم السائل المعياري والبرمجيات سهلة الاستخدام وتصميم الشرائح الموحد، مما وضع أساسا تقنيا مثاليا لإنشاء سير عمل فحص متكامل بالكامل. تستخدم هذه الدراسة فحص عالي الإنتاجية لمنتجات B. coagulans المنتجة لحمض L-lactic عالية الإنتاجية كحالة تحقق من الواقع. استنادا إلى منصة ميكروفلويدية قطراتية، تم إنشاء سير العمل التالي، الذي يتكون من أربع خطوات رئيسية متسلسلة: (1) بناء مكتبة طفرات متنوعة عبر طفرات البلازما الجوية ودرجة حرارة الغرفة (ARTP)؛ (2) تغليف خلية واحدة عالي الكفاءة وزراعة دقيقة محكمة داخل القطرات تحت ظروف محسنة لنمو B. coagulans وإنتاج حمض L-lactic؛ (3) حقن بيكو دقيق لحساس حيوي فلوري خاص ب L-Lactate، يليه فرز عالي السرعة للقطرات التي تغلف المنتجين المتفوقين؛ و(4) التحقق الدقيق للمرشحين المصنفين من خلال تخمير القارورة المرتجفة لتأكيد تحسين الإنتاج والاستقرار الجيني. يهدف هذا البروتوكول إلى الباحثين والمهندسين المشاركين في تربية الميكروبات الصناعية الذين يحتاجون إلى فحص عالي الإنتاجية للمنتجات خارج الخلية. وهو مناسب بشكل خاص للبكتيريا القابلة للزراعة التي تفرز مستقلبات جزيئات صغيرة أو إنزيمات. يجب تجهيز منصة الفحص بحساسات متوافقة مع البيئة الدقيقة للقطرات لتمكين الكشف الدقيق عن المستقلبات المستهدفة. بالنسبة للسلالات التي تتطلب زراعة خاصة (مثل اللاهوائية الصارمة)، يمكن تعديل معايير الزراعة لتحسين ووضع استراتيجية زراعة مخصصة. من خلال إنشاء هذا السير العملي المغلق والموحد للفحص، تهدف هذه الدراسة إلى توفير حل قوي وقابل للنقل لتسريع التكاثر الصناعي للسلالات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم تكن هذه الدراسة مطلوبة للحصول على موافقة أخلاقية. أجريت جميع التجارب باستخدام مزارع ميكروبية نقية، ولم يشارك أي أشخاص أو حيوانات مختبرية في هذا البحث. راجع جدول المواد لمزيد من التفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في البروتوكول التالي.

1. التحضيرات

تحذير: اتبع ممارسات السلامة البيولوجية. B. coagulans هو كائن حي من مستوى السلامة البيولوجية الأول. ارتد قفازات ومعطف مختبر. قم بجميع عمليات التحريك المفتوحة داخل غطاء تدفق طبقي. قم بتعقيم جميع المواد التي تلامس الخلايا الحية عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل التخلص منها.

مصدر الإجهاد والصيانة
1. اشتر B. coagulans ATCC 7050 من مركز جمع الثقافة التجارية كجيل ثان من ثقافة الميل.
2. امسح حلقة من الزراعة المائلة على البذور المتوسطة واحتضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. اختر مستعمرة واحدة، وتلقيحها في وسط بذور سائل، وانمو بدرجة حرارة 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة.
3. اخلط الزراعة الناتجة مع الجلسرول المعقم 40٪ إلى تركيز نهائي 25٪ (v/v) وتخزينه كمخزون مجمد عند –80 درجة مئوية. في كل تجربة، قم بإذابة أليكوت طازجة، ووضعها على أجار متوسط البذرة، وحضنها على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
4. ثم قطف مستعمرة واحدة، وتلقيحها في وسط بذور سائل، وزرعه على حرارة 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة قبل استخدامه للطفرات والفحص (الشكل التكميلي 1).
حساس حمض اللاكتيك
1. التعبير عن وتنقية حساس eLACCO1.1 كما هو موضح في المواد التكميلية¹² (الشكل التكميلي 2).
2. قم بإضافة جليسيرول 5٪ (v/v) للحساس المنقى وخزنها عند -80 درجة مئوية. لكل تجربة، قم بإذابة أليكوت واحد على الجليد وتخفيفه فورا ب 10 ملليمولار PBS معقم (pH 7.4) إلى تركيز عمل نهائي 0.1 ملغ/مل.
إعداد وسائل الإعلام الثقافية
1. وسط البذور (ج/لتر: جلوكوز 20، مستخلص الخميرة 5، تريبتون 10، أسيتات الصوديوم 2، سترات الصوديوم 2، K₂HPO₄ 2، MgSO_4.7H ₂O 0.2، MnSO₄· H₂O 0.05، FeSO_4.7H ₂O 0.01). قم بتعقيم الجلوكوز بشكل منفصل كمخزون بسعة 200 جرام/لتر عند 115 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  1. قم بتعقيم المكونات المتبقية عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التبريد، أضف مخزون الجلوكوز المعقم إلى تركيز نهائي 20 جرام/لتر، ثم تعقيم العناصر النزرة بالفلتر.
  2. تخزين الوسط الكامل عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. استخدامه للتفعيل الليلي، وتحضير اللقاح.
2. وسط الفحص (جرام/لتر: جلوكوز 20، مستخلص الخميرة 6.66، NaCl 0.333، NH₄Cl 0.665، KH₂PO₄ 2، Na₂HPO₄ 4.46، MgSO₄ 0.12، CaCl₂ 0.074).
  1. قم بتعقيم الجلوكوز بشكل منفصل عند درجة حرارة 115 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم خليط مستخلص الملح/الخميرة على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. بعد التبريد، أضف مرق الجلوكوز المعقم إلى 20 جرام/لتر. خزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. يستخدم كطور مائي لتوليد القطرات وكوسط زراعة داخل القطرات خلال فترة الحضانة التي تستمر 10 ساعات.
3. وسط التخمير (جرام/لتر: جلوكوز 90، تريبتون 13.33، مستخلص الخميرة 13.33، أسيتات الصوديوم 0.67، NaCl 0.0133، MgSO_4.7H₂O 0.0133، MnSO₄· H₂O 0.0133، FeSO_4.7H ₂O 0.0133).
  1. قم بتعقيم الجلوكوز كمخزون 500 جرام/لتر عند درجة حرارة 115 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم المعقم على المكونات الأخرى عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. بعد التبريد، أضف مخزون الجلوكوز المعقم إلى 90 جرام/لتر. أضف مسحوق CaCO₃ المعقم (4٪ w/v) قبل التلقيح مباشرة لتقليل الرقم الهيدروجيني. حضر طازجا يوميا. الاستخدام لفحص الميكروبليت الأولي والتحقق من صحة القارورة الشاك-فاك.
    ملاحظة: جهز جميع الأوساط بالماء المقطر إلى حجم نهائي 1 لتر. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.5 مع 1 ميلار هيدروكلوترون.

2. بناء مكتبة متحولين باستخدام ARTP

تحذير: تشغيل ARTP يتضمن بلازما عالية التردد ومصباح UV. يمكن أن يسبب الأشعة فوق البنفسجية إصابات في العين والجلد. تفريغ البلازما يولد الأوزون ودرجات حرارة عالية. دائما أبق باب الحجرة مغلقا أثناء تشغيل البلازما. ارتد معطف مختبر ونظارات واقية للأشعة فوق البنفسجية. استخدم فقط 99.999٪ هيليوم نقي فقط؛ تأكد من التهوية الكافية. بعد كل عملية للطفرة، امسح طاولة العمل والجدران الداخلية لغرفة الطفرات بقطعة قماش خالية من الوبر مغموسة بنسبة 75٪ (v/v) إيثانول. 75٪ إيثانول قابل للاشتعال بشدة. ابتعد عن اللهب المفتوح، الشرر، والأسطح الساخنة.

حدد منحنى قياسي يربط OD₆₀₀ بتركيز الخلايا القابل للحياة.
1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من B. coagulans في وسط بذور وحضانة عند 50 درجة مئوية وسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة حتى تصل الزراعة إلى المرحلة اللوغاريتمية المتوسطة.
2. تحضير تخفيفات متسلسلة لتعليق البكتيريا عند تدرجات 10⁴ و10^و5 و10⁶.
3. قم بطباعة 100 ميكرولتر من كل تخفيف وزعها بالتساوي على ألواح الأجار المتوسطة من البذور في ثلاث نسخ.
4. حضن جميع ألواح الأجار المطلية عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
5. عد وحدات تكوين المستعمرة (CFU) لكل تخفيف.
  ملاحظة: تظهر المعايرة أن OD₆₀₀ = 0.5 يعادل تقريبا 1 × 10⁸ CFU/mL. استخدم هذه العلاقة لتحديد كثافة الخلايا الأولية لتغليف القطرات (الشكل التكميلي 3).
تقوم بزراعة B. coagulans إلى المرحلة اللوغاريتمية المتوسطة إلى المتأخرة، ثم تخفف زراعة البذور الطازجة إلى OD₆₀₀ = 0.05 في وسط البذور الطازج.
داخل غطاء تدفق طبقي، جهز ثمانية أقراص معدنية صغيرة معقمة وقرص معدني كبير واحد. اشعل الأقراص الثمانية الصغيرة فوق موقد كحولي لمدة دقيقة واحدة، وضعها على القرص الكبير المعقم، ودعها تبرد لمدة 10 دقائق.
باستخدام ميكروبايبت، تم نشر 10 ميكرولتر من التعليق البكتيري المخفف بشكل منتظم على كل من الأقراص الصغيرة الثمانية المبردة.
انقل القرص الكبير الذي يحمل الأقراص الصغيرة الملقحة إلى طبق بتري معقم.
شغل جهاز ARTP وفعل شاشة التحكم الرئيسية. شغل المصباح فوق البنفسجي داخل غرفة الطفرات. ابدأ المبرد وقم بتبريده مسبقا لمدة 20 دقيقة حتى تستقر درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية.
افتح بسرعة باب غرفة الطفرات وضع الأقراص الصغيرة بداخله.
باستخدام ملقط معقم، انقل كل قرص صغير بشكل تسلسلي إلى مرحلة عينة ARTP.
ملاحظة: تم تثبيت قدرة التردد الراديوي، ومعدل تدفق غاز الهيليوم، ومسافة الفوهة إلى العينة، ونقاء الهيليوم عند 120 واط، و10 SLM، و2 مم، و99.999٪ على التوالي. تم ضبط زمن إشعاع الهيليوم على 5، 10، 15، 20، 25، و30 ثانية على التوالي.
تعرض كل قرص صغير لطفرات ARTP وفقا لمعايير المجموعة. بعد الإشعاع، ينقل جميع الأقراص إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل يحتوي على 10 مل من وسط الاسترداد. الحضانة عند 50 درجة مئوية مع هز 200 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات للسماح بتعافي الخلايا ونموها.
تحديد معدل الفتك.
1. قم بتخفيف الزراعة المستخرجة تدريجيا إلى تدرج من ^10-2 إلى ^10-6.
2. انشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح أجار متوسطة البذور، وحضر ثلاث نسخ لكل تخفيف.
3. حضن جميع الألواح عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
4. عد المستعمرات واحسب العدد المقابل CFU/mL.
5. احسب معدل الموت باستخدام الصيغة:
  (1)
  ملاحظة: قم بإجراء التجربة بثلاث نسخ لكل نقطة زمنية. الوقت الأمثل لحدوث الطفرات ل ARTP في هذه الحالة هو 20 ثانية (الشكل التكميلي 4).

3. تركيب منصة القطرات الميكروفلويدية الآلية والمستهلكات

نظام التشغيل (الشكل 1)
ملاحظة: يتكون من 3 قنوات من وحدات تحكم الضغط عالية الدقة بنطاق ضغط يتراوح بين 0–1000 ملي بار وزمن استجابة ضغط < 50 مللي ثانية (الشكل 1A).
نظام التصوير
ملاحظة: يتميز تصوير CMOS المجهري عالي السرعة بجمع بيانات الصور بسرعة ≥ 2 جيجابايت/ثانية، ومعدل إطارات من 0 إلى 20,000 إطار في الثانية، ودقة قصوى 1280 × 860. يتميز النظام بالتركيز التلقائي لمراقبة حركة القطرات في الوقت الحقيقي ويدعم تسجيل الصور والفيديوهات التي يمكن تصديرها بعدة صيغ مثل BMP وAVI وMP4 وTIF.
نظام الكشف
ملاحظة: يتيح الكشف عن الإشارة الفلورية باستخدام ليزرين: 488 نانومتر و633 نانومتر، وقناتي كشف.
نظام التحكم في المضيف
ملاحظة: يتم التحكم في النظام بواسطة برنامج منصة القطرات الميكروفلويدية الآلي، ويدمج عدة وحدات، بما في ذلك تشغيل السوائل، التصوير المجهري، الإثارة والكشف، توليد القطرات، حقن البيكو، والفرز. كما يدعم جمع البيانات التجريبية وتسجيلها وتخزينها وعرضها وتصديرها. تظهر وحدات التشغيل الجزئية لمنصة القطرات الآلية الميكروفلويدية (الشكل 1B).
المواد الاستهلاكية
ملاحظة: تشمل المواد الاستهلاكية المستخدمة في هذا البروتوكول: أنبوب الحقن لطور الزيت، العينة، والكواشف (الشكل 2A); أنبوب جمع لحضانة القطرات (الشكل 2B)؛ شريحة توليد القطرات (الشكل 2C)؛ شريحة حقن بيكو بقطرة (الشكل 2D); وشريحة فرز القطرات (الشكل 2E).

4. توليد القطرات

تحذير: نظف منصة الميكروفلويد القطرية الآلية. بعد كل تجربة، امسح المسرح وحامل الرقائق وأي مناطق انسكاب بنسبة 75٪ إيثانول باستخدام مناديل خالية من الوبر. قم بإزالة الزيت المفلور المتبقي، أو تعليق الخلايا، أو محلول الحساسات.

تغليف الخلية الواحدة. للحصول على λ = 0.1 في قطرات 14 بيلومتر، قم بتخفيف التعليق البكتيري إلى OD₆₀₀ ≈ 0.04 (OD₆₀₀=0.5 يعادل 1 ×^{10 8} CFU/mL). وفقا لتوزيع بواسون:
(2)
عندما يكون λ = 0.1، يكون 90.5٪ من القطرات فارغا، و9.1٪ على خلية واحدة، و0.4٪ على عدة خلايا.
ملاحظة: في هذه الحالة، كانت كفاءة تغليف الخلية المفردة المقاسة 11.2٪ (الشكل التكميلي 5). يمكن تحديد عدد الخلايا لكل قطرة بواسطة تلوين DAPI. عندما يكون λ = 0.1 ويتجاوز معدل تغليف الخلايا المتعددة 1٪، يجب تقليل OD₆₀₀ لتقليل نسبة القطرات التي تحتوي على عدة خلايا.
بيبت 300 ميكرولتر من الزيت المفلور في قارورة مدخل طور الزيت. بيبت 500 ميكرولتر من التعليق البكتيري في قارورة دخول الطور المائي.
اقشر الشريط الذي يغطي سطح شريحة توليد القطرات. قم بتوصيل قارورة الزيت، وقارورة العينة، وقارورة التجميع بآبار الشريحة المقابلة بالتسلسل.
ضع الشريحة على المسرح وثبتها. قم بتوصيل أنابيب الهواء بقوارير المدخل واحدة تلو الأخرى حسب ملصقات مسار الغاز.
افتح برنامج منصة الميكروفلويديك القطرات الآلي. قم بضبط مقبض حركة المسرح وفقا لاتجاهات السهم على الشريحة لنقل مجال الرؤية إلى موقع توليد القطرات.
انقر على "ابدأ" في واجهة "توليد القطرات" لبرنامج منصة القطرات الميكروفلويدية الآلي (الشكل 3A). في واجهة التصوير، قم بسحب أشرطة سطوع "محور Z" ومصدر الضوء لضبط وضوح الصورة وسطوعها.
انقر على أزرار "+" و"-" في "سرعة القطرة" و"حجم القطرة" لضبط سرعة التوليد وحجم القطرة.
ملاحظة: في هذه الحالة، يتم ضبط ضغط طور الزيت وضغط طور العينة لتوليد القطرات تلقائيا على 300 ملي بار و400 ميلي بار على التوالي، لتحقيق معدل توليد 1500 هرتز. تحت هذه الإعدادات، تكون حجم القطرات 14 pL، مع الحفاظ على قطر القطرات CV تحت 5٪، مما يضمن حجم القطرات ثابتا وعمليات موثوقة في المراحل النهائية.
انتظر دقيقة واحدة حتى تستقر المعدات وتبقى حالة توليد القطرات ثابتة. استبدل قارورة الجمع بسرعة لبدء جمع القطرات.
ملاحظة: أضف مسبقا كمية صغيرة من الزيت المفلور إلى أنبوب التجميع الجديد لتغطية المنفذ السفلي لأنبوب التفلون، مع التأكد من عدم ملامسة القطرات مباشرة لجدار الأنبوب وتسبب الاندماج.
أوقف جمع القطرات بعد 30 دقيقة من العملية. انقر على "إيقاف" في نافذة النافذة المنبثقة لتأكيد إيقاف توليد القطرات.
أزل أنبوب الجمع برفق من الشريحة. ضع الأنبوب وقارورة الجمع عموديا وانتظر حتى تدخل القطرات داخل الأنبوب إلى القارورة.
قم بإزالة الشريحة، وقارورة مدخل طور الزيت، وقارورة مدخل الطور المائي من المرحلة. امسح سطح المسرح بنسبة 75٪ كحول. ثم تكتمل مرحلة توليد القطرات.

5. زراعة القطرات

أضف 1 مل من الزيت المعدني إلى أنبوب التجميع.
ملاحظة: تغطي طبقة الزيت المعدني تعليق القطرات لتقليل التبخر وتقليل التعرض للأكسجين، مع السماح بتبادل كمية كافية من الغاز للكائن اللاهوائي الاختياري B. coagulans.
ضع أنبوب الجمع بشكل عمودي في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل يحتوي على ماء معقم. حافظ على غطاء أنبوب الجمع بشكل فضفاض واحتضن عند 45 درجة مئوية لمدة 10 ساعات.
ملاحظة: بعد الحضانة، تأكد من أن قطر القطرات الثانوية هو <10٪ وأنه لا يلاحظ أي تجمع للقطرات. تخلص من الدفعات إذا لم تستوفي هذه المعايير.

6. حقن بيكو بقطرة

تحذير: يتم تطبيق جهد عالي على أقطاب الشريحة عبر اتصال الجهاز أثناء حقن البيكو. المجال الكهربائي يمكن أن يسبب صدمة كهربائية شديدة. لا تلمس الأقطاب الكهربائية أو سطح الشريحة بالأدوات المعدنية أو باليدين العاريتين أثناء تفعيل الجهد العالي. دائما قم بتعطيل خرج الجهد العالي قبل التعامل مع الشريحة. ارتد قفازات معزولة واستخدم أدوات غير موصلة للاتصالات.

جهز قارورة مدخل طور الزيت. في غطاء التدفق الطبقي، يتم توصيل 300 ميكرولتر من الزيت المفلور إلى قارورة مدخل طور الزيت.
جهز قارورة مدخل العينة. أزل غطاء قارورة المدخل من أنبوب الجمع الذي يحتوي على القطرات. استبدله بغطاء جديد.
قم بتقليم طرف قارورة المدخل الجديدة. اقطع جزءا صغيرا من مقدمة قارورة المدخل الجديدة بحيث يصل الطرف إلى ما دون مستوى السائل للقطرات في القارورة العينة.
شد القبوة. ثبت الغطاء بإحكام لمنع التسرب.
جهز قارورة مدخل الكواشف. بيبت 500 ميكرولتر من حساس حمض اللاكتيك في قارورة مدخل الكواشف.
أضف PBS إلى قارورة مدخل الكواشف. في الوقت نفسه، أضف 500 ميكرولتر من مخزن PBS المعقم إلى نفس قارورة مدخل الكواشف.
ملاحظة: تمت إضافة مخزن PBS في هذه التجربة لموازنة درجة الحموضة للقطرات. كان تركيز العمل النهائي لحساس اللاكتات 0.1 ملغ/مل، وحجم التحميل لحساس اللاكتات 500 ميكرولتر.
استخدم شفرة لقطع الشريط الذي يغطي آبار الأقطاب الكهربائية لكشف الأقطاب الكهربائية. اضبط جهاز القياس المتعدد على وضع الاستمرارية واختبر اتصال الدائرة وحالة الدائرة القصيرة في الشريحة.
ملاحظة: إذا أظهر الجهاز المتعدد اتصالا طبيعيا لأقطاب الشريحة في الدائرة، انتقل إلى الخطوة التالية. إذا كانت الدائرة مفتوحة، استبدل شريحة الحقن وأجر اختبارا مرة أخرى.
بعد تأكيد الاتصال الدائري الطبيعي مع جهاز القياس المتعدد، قم بإزالة الشريط الموجود على سطح الشريحة. قم بربط قارورة الزيت، وقارورة العينة، وقارورة الكاشف، وقارورة الجمع بالآبار المقابلة للشريحة بالتسلسل.
ضع الشريحة على المسرح وثبتها. قم بتوصيل أنابيب الهواء بقوارير المدخل واحدة تلو الأخرى حسب ملصقات مسار الغاز.
افتح برنامج منصة الميكروفلويديك القطرات الآلي. اضبط مقبض حركة المسرح حسب اتجاهات الأسهم على الشريحة لتحريك مجال الرؤية إلى منطقة القطب في شريحة القطرة.
انقر على "ابدأ" في واجهة "حقن بيكو القطرة" لبرنامج منصة القطرات الميكروفلويدية الآلي (الشكل 3B). في واجهة التصوير، قم بسحب أشرطة سطوع "محور Z" ومصدر الضوء لضبط وضوح الصورة وسطوعها.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يقوم الجهاز تلقائيا بضبط ضغط مضخة طور الزيت إلى 400 مللي بار، وضغط مضخة طور العينة إلى 420 مللي بار، وضغط مضخة طور حقن الكواشف إلى 450 مل.
في المرحلة الأولى من التشغيل، يتم تفريغ جزء من الهواء في القسطرة إلى الشريحة، وهو أمر طبيعي يستمر لعدة دقائق.
انتظر حتى تدخل القطرات مجال الرؤية. انقر على "بدء حقن بيكو". في هذه المرحلة، سيتم تفعيل المجال الكهربائي للجهاز. قم بضبط سرعة توليد القطرات، وتباعد القطرات، وحجم الحقن بالنقر على زري "+" و"-" في "سرعة القطرات"، "تباعد القطرات"، و"حجم الحقن".
ملاحظة: المجال الكهربائي مضبوط على الحد الأقصى الافتراضي للترس. إذا انكسرت القطرات في منطقة المجال الكهربائي أثناء عملية الاندماج، انتقل إلى الترس المتوسط أو المنخفض. في هذه الحالة، كان معدل حقن القطرات 200 هرتز.
راقب في برنامج عرض الصور عالي السرعة. إذا كانت القطرات تستطيع الحقن بشكل مستقر في حساس حمض اللاكتيك بنسبة 1:1، انتظر 5 دقائق حتى تستقر الجهاز. استبدل قارورة الجمع بسرعة لبدء جمع القطرات.
بعد الحقن المستقر لمدة ساعتين، اضغط على "توقف" لإنهاء حقن القطرة البيكو.
أزل أنبوب الجمع برفق من الشريحة. ضع الأنبوب وقارورة الجمع عموديا وانتظر حتى تدخل القطرات داخل الأنبوب إلى القارورة.

7. فرز القطرات

تحذير: مزيل المولب مهيج وقد يسبب تهيجا في الجلد والعين. كما أنه ضار إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات، معطف مختبر، نظارات أمان). استخدم جهاز إزالة الرطوبة في منطقة جيدة التهوية أو غطاء البخار. اجمع مزيل النفايات في حاوية منفصلة تحمل علامات واضحة. لا تصب الحوض.

في غطاء التدفق الطبقي، قم بإزالة 300 ميكرولتر من الزيت المفلور بماصة وإضافته إلى قارورة مدخل طور الزيت. استبدل غطاء قارورة الدخول في أنبوب الجمع الذي يحتوي على قطرات محقونة ميكرو بغطاء جديد.
ملاحظة: قبل إجراء تجارب فرز القطرات، خذ 5 ميكرولتر من القطرات وراقبها تحت مجهر فلوري. قس قطر ما لا يقل عن 200 قطرة؛ تابع فقط إذا < السيرة الذاتية 10٪.
استخدم شفرة لقطع الشريط الذي يغطي آبار الأقطاب الكهربائية لكشف الأقطاب الكهربائية. اضبط جهاز القياس المتعدد على وضع الاستمرارية واختبر اتصال الدائرة وحالة الدائرة القصيرة في الشريحة.
بعد تأكيد الاتصال الدائري الطبيعي مع جهاز القياس المتعدد، قم بإزالة الشريط الموجود على سطح الشريحة. قم بتوصيل قارورة الزيت، وقارورة العينة، وقارورة جمع الفرز بآبار الشريحة المقابلة بالتسلسل.
ضع الشريحة على المسرح وثبتها. قم بتوصيل أنابيب الهواء بقوارير المدخل واحدة تلو الأخرى حسب ملصقات مسار الغاز.
افتح برنامج التصوير عالي السرعة. اضبط مقبض حركة المسرح حسب اتجاهات الأسهم على الشريحة لتحريك مجال الرؤية إلى منطقة القطب في شريحة القطرة.
انقر على "ابدأ" في واجهة "فرز القطرات" لبرنامج منصة القطرات الميكروفلويدية الآلي. في واجهة التصوير، قم بسحب أشرطة سطوع "محور Z" ومصدر الضوء لضبط وضوح الصورة وسطوعها.
ملاحظة: بعد النقر على "تشغيل"، يقوم الجهاز تلقائيا بضبط ضغط مضخة الزيت إلى 300 ملي بار وضغط مضخة العينة إلى 190 مللي بار، مما يؤدي إلى معدل نقل قطرات يبلغ 100 هرتز.
في المرحلة الأولى من التشغيل، يتم تصريف جزء من الهواء في القسطرة إلى الشريحة، والتي تستمر لعدة دقائق وهي ظاهرة طبيعية.
انقر لاختيار "ليزر" واختر قناة الكشف 488 نانومتر.
ملاحظة: قد يختار الطاقم التجريبي ليزر بقطر 488 نانومتر، أو ليزر 633 نانومتر، أو مزيج من الاثنين، حسب تصميم الكشف التجريبي. قوة الليزر: 20 ميلي واط.
انقر على "تسجيل البيانات". سيبدأ الجهاز في اكتساب إشارات الفلورة القطرية (الشكل 3C).
ملاحظة: اجمع إشارات الفلورة من 50,000 إلى 100,000 قطرة؛ يقوم الجهاز تلقائيا بفرز قيم الإشارة وتوليد مخطط إشارة فلوري.
استنادا إلى مخطط إشارة الفلورة المولد، اضبط عتبة الفرز على أعلى 0.1٪ من إجمالي إشارات الفلورة، وجمع قطرات ذات قيم إشارة فلورية فوق هذه العتبة.
ملاحظة: في هذه الحالة، تم ضبط بوابة الفرز لجمع قطرات ذات شدة فلورية > 2750 (a.u.)، والتي تمثل أعلى 0.1٪ من القطرات.
اضغط على "تسجيل البيانات" مرة أخرى. سيعيد الجهاز تسجيل إشارات الفلورة من القطرات المتبقية ويفرز القطرات المستهدفة بناء على العتبة المحددة في القسم 7.10.
ملاحظة: سيتم أيضا فرز ورسم إشارات القطرات المتبقية تلقائيا كمخطط فلوري.
بعد اختيار منطقة القطرة المستهدفة، قم بتشغيل "مفتاح الفرز" وضبط قيمة "قوة الانحراف". ستبدأ المعدات في فرز القطرات.
ملاحظة: يوفر الجهاز ثلاثة مستويات قوة للمجال الكهربائي القابل للاختيار (عالية، متوسطة، منخفضة). للقطرات التي تزيد حجمها عن 30 ميكرومتر، اختر القطرات العليا؛ بالنسبة للقطرات التي تقل عن 25 ميكرومتر، اختر متوسط أو منخفض. هذا يضمن استقرار الانحراف وكفاءة الفرز المثلى.
بعد أن تستقر المعدات لمدة 5 دقائق، استبدل قارورة الجمع لجمع القطرات الإيجابية.
ملاحظة: أثناء الفرز، يقيس الجهاز باستمرار شدة الفلورة لكل قطرة في الوقت الحقيقي ويقارنها بالعتبة المحددة مسبقا. فقط القطرات ذات الشدة الفلورية التي تتجاوز العتبة يتم تحويلها وجمعها في أنبوب الجمع الموجب. تعتبر القطرة موجبة إذا أظهرت الأداة إشارة فلورية تتجاوز عتبة الفرز، وفي الوقت نفسه لوحظ انحراف القطرة في واجهة التصوير، مما يؤكد توجيه القطرة بنجاح إلى قناة الجمع الموجبة.
أوقف فرز القطرات بعد 4 ساعات من التشغيل المستقر. انقر على "توقف" في واجهة "فرز القطرات".
أزل أنبوب الجمع برفق من الشريحة. ضع الأنبوب وقارورة الجمع عموديا لضمان دخول القطرات داخل الأنبوب إلى قارورة الجمع.
بعد الانتهاء من جمع القطرات، انقر على مخطط التشتت لحفظ مخطط التشتت للتجربة، وقيم إشارة الفلورة للقطرات الموجبة المرتبة، وقيم إشارة الفلورة لجميع القطرات.
قم بإزالة الشريحة، وقارورة مدخل طور الزيت، وقارورة العينة، وقارورة الكواشف من المرحلة. أغلق البرنامج.
تحلل القطرات. أضف 500 ميكرولتر من 1H، 1H، 2H، 2H-بيرفلورو أوكتانول إلى أنبوب جمع القطرات. انتظر 5 دقائق، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط الفحص الجديد للاستعادة.
ملاحظة: لا تهز أنبوب الجمع بقوة بعد إضافة جهاز إزالة المولبس؛ اخلط برفق. بعد تحلل القطرات، يتشكل واجهة واضحة بين الطور المائي والزيتي.
خذ 20 ميكرولتر من التعليق البكتيري المفكك، وقم بتخفيفه عشرة أضعاف، ووزعه على لوحين أجار. حضن عند 50 درجة مئوية لمدة يومين.
ملاحظة: يمكن تعديل عامل التخفيف حسب عدد القطرات المجمعة. في هذه الحالة، تم الحصول على حوالي 400 مستعمرة منفردة من اللوحة.

8. تصدير البيانات

انقر على مخطط إشارة الفلورة في المنطقة الفارغة من واجهة فرز البرنامج. اختر لحفظ مخطط تشتت إشارة الفلورة للقطرات، ومخطط إشارة الفلورة، وجدول بيانات إكسل لإشارة الفلورة، والتي تحتوي على قيم شدة الفلورة المسجلة لعدد القطرات الكلي للقطرات، بالإضافة إلى قيم شدة الفلورة للقطرات الموجبة المفحصة.

9. فحص الميكروبليت الأولي

اختر مستعمرات فردية عشوائيا.
قم بتطعيم صفيحة البئر العميقة ذات 24 بئر لزراعة التوسع. اختر كل مستعمرة مختارة وقم بتلقيحها في بئر واحد من طبق بئر عميق يحتوي على 2 مل من وسط التخمير. استخدم حلقة التطعيم.
أغلق صفيحة البئر العميقة ذات 24 بئرا بغشاء غير قابل للتنفس.
ملاحظة: لا تستخدم غشاء قابل للتنفس. يسبب تبخر وسط الزراعة.
حضن ثقافة التوسع. ضع لوح البئر المغلق ذو 24 بئرا عميقا في حاضنة اهتزاز عند 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
الزراعة الفرعية للتحقق من صحة التخمير. بعد 24 ساعة، انقل 200 ميكرولتر من الزراعة من كل بئر إلى صفيحة جديدة بعمق 24 بئر تحتوي على 1.8 مل من وسط التخمير (10٪ v/v لقيح). أضف CaCO₃ المعقم إلى تركيز نهائي 4٪ (w/v) لكل منها قبل التلقيح بفترة كافية لتخفيف الرقم الهيدروجيني.
أضف عناصر التحكم. في كل صفيحة جديدة بعمق 24 بئرا، املأ ثلاثة آبار مختارة عشوائيا بالسلالة الأبوية ATCC 7050 كعناصر تحكم سالبة. عالجها بنفس الطريقة التي تتوافق مع السلالات المرشحة.
أغلق صفيحة البئر العميقة ذات 24 بئرا بغشاء غير قابل للتنفس.
حضن لوحة البئر العميقة ذات 24 بئرا. ضع اللوحة المغلقة في حاضنة هز عند 50 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
جهز عينات للكشف عن اللاكتات. قم بطرد مركزي على اللوحة على 5,842 × جرام لمدة 10 دقائق. انقل 10 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى صفيحة سوداء صغيرة بسعة 96 بئر وتخفيفها ب 990 ميكرولتر من الماء فائق النقي. اخلط جيدا.
أضف حساس اللاكتات. أضف 100 ميكرولتر من العينة المخففة إلى كل بئر من صفيحة سوداء جديدة بسعة 96 بئرا. ثم أضف 100 ميكرولتر من حساس حمض اللاكتيك. اخلط بلطف.
قس التألق. حضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (محمي من الضوء). قس الفلورة باستخدام قارئ ميكروبلويت مع إثارة عند 485 نانومتر وانبعاث عند 515 نانومتر.
حدد عتبة اختيار الضربة. احسب متوسط التألق لثلاثة آبار مراقبة أبوية (الوالد) والانحراف المعياري (SD_parent). عرف العتبة بأنها F_parent + 3 × SD_parent.
حدد النتائج الأساسية. يعتبر الانفعال المرشح ضربة أولية إذا تجاوزت إشارة الفلورة الخاصة به العتبة. سجل عدد النتائج الأساسية للتحقق من المراحل النهائية.

10. التحقق الثانوي للسلالات عالية الإنتاجية

تحذير: الطور المتنقل يحتوي على حمض الكبريتيك المخفف (5 ملم)، وهو مادة تآكلية. تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات، معطف مختبر، نظارات أمان). جهز وتعامل مع الطور المتحرك في منطقة جيدة التهوية أو غطاء بخار. اجمع جميع النفايات التي تحتوي على حمض في حاوية مخصصة للتخلص السليم. لا تصب الحوض.

حضر زراعة البذور. اضرب السلالات الأساسية على ألواح البذور متوسطة الأجار. حضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. اختر مستعمرة واحدة من كل طبق وقم بتلقيحها في 30 مل من وسط البذور السائل في قارورة هزة بسعة 250 مل. الحضانة عند 50 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة.
جهز عملية التخمير. جهز وسط التخمير وأضف مسحوق CaCO3 المعقم إلى تركيز نهائي 4٪ (بدون جهد) كمعادل لدرجة الحموضة. انقل 5 مل من مزرعة البذور إلى 45 مل من هذا الوسط في قارورة إيرلينماير بسعة 250 مل (لقاح 10٪ v/v؛ حجم العمل النهائي 50 مل).
ملاحظة: استخدم ثلاث قوارير مستقلة لكل سلالة مرشحة وللسلالة الأبوية ATCC 7050 كضابط.
حضن القوارير. ضع القوارير في حاضنة اهتزاز عند 50 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة. تخمر لمدة 24 ساعة.
اجمع عينات. بعد 24 ساعة، خذ 1 مل من الزراعة من كل قارورة. الطرد المركزي عند 13,800 × جرام لمدة دقيقتين. قم بتخفيف المادة الفائقة 100 مرة بماء فائق نقي وترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر.
قم بإعداد شروط HPLC. استخدم عمود Aminex HPX-87H. جهز الطور المتحرك: 5 مللي مولار H₂SO₄ في مياه فائقة النقي، وترشيح عبر غشاء 0.22 ميكرومتر، وإزالة الغاز عن طريق الصوت. اضبط درجة حرارة العمود إلى 40 درجة مئوية، معدل تدفق إلى 0.6 مل/دقيقة، حجم الحقن إلى 20 ميكرولتر، ووقت التشغيل إلى 20 دقيقة لكل عينة (يخرج حمض اللاكتيك عند ~12.600 دقيقة). استخدم كاشف معامل الانكسار (RID).
جهز المنحنى القياسي. إذابة لاكتات الكالسيوم في مياه فائقة النقاء لتحضير محاليل قياسية من 0، 0.4، 0.8، 1.2، و1.6 جرام/لتر (معبرا عنها كإل-لاكتات الكالسيوم). حقن كل معيار في ثلاث نسخ.
ملاحظة: رسم مساحة الذروة مقابل التركيز واحصل على معادلة الانحدار الخطي (R² > 0.999). شغل المعايير في بداية ونهاية كل دفعة عينة لتصحيح الانحراف.
حقن العينات. حقن المواد الفائقة المختصرة المصفاة (20 ميكرولتر) في نظام HPLC. سجل منطقة الذروة لذروة لاكتات الكالسيوم.
ملاحظة: حقن عينة مراقبة جودة (1 جم/لتر L-L-L-L-لاکتات) كل 10 عينات لمراقبة استقرار النظام. التغير المقبول في وقت الاحتفاظ هو <0.2 دقيقة وذروة تغير المساحة <5٪ مقارنة بمعيار المعايرة الأولي.
احسب عائد حمض اللاكتيك. استيفاء مساحة الذروة لكل عينة في المنحنى القياسي للحصول على تركيز L-Lactate في الكالسيوم (g/L).
ملاحظة: حول إلى تركيز حمض L-لاكتيك باستخدام نسبة الوزن الجزيئي:
(3)
احسب نسبة التحسن:
(4)
حدد السلالات النهائية عالية الإنتاجية. اختر السلالات التي تظهر باستمرار إنتاجا أعلى من حمض L-لاكتيك مقارنة بالسلالة الأبوية كطفرات مثبتة. اختر أفضل مؤدي لمزيد من التوصيف.

11. تقييم الاستقرار الجيني للسلالات عالية الإنتاجية

انثر السلالة المتحولة المختارة على ألواح بذور متوسطة الأجار. حضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. هذا هو الجيل الأول.
اختر مستعمرة واحدة من صفيحة الجيل الأول وقم بتطعينها في 5 مل من وسط البذور السائل في أنبوب بسعة 50 مل. الحضانة عند 50 درجة مئوية وسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة للحصول على زراعة بذور F1.
انقل 10٪ (v/v) من مزرعة البذور من الجيل الأول إلى 50 مل من وسط التخمير (يحتوي على 4٪ مع زيت CaCO₃ معقم) في قارورة هزة بسعة 250 مل. حضانة عند 50 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
اجمع 1 مل من الزراعة بعد التخمير. جهاز الطرد المركزي عند 13,800 × جرام لمدة دقيقتين، وتخفيف المادة الفائقة 100 ضعف بماء فائق النقي، وقس تركيز حمض اللاكتيك L-اللاكتيك بواسطة HPLC. استخدم ثلاث قوارير مستقلة لكل جيل.
للحصول على الجيل التالي، ضع حلقة من زراعة الجيل الأول على طبق بذور طازجة من الأجار المتوسط. حضن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. كرر الخطوات 11.2 و11.3 للجيل الثاني.
كرر عملية الزراعة الفرعية للحصول على الجيل الثالث والرابع. لكل جيل، حضر ثلاث قوارير اهتزاز وقوس إنتاج حمض اللاكتيك بواسطة HPLC.
قارن نتائج الأجيال الأربعة (1–4) باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه أو اختبار t الطالب. يعتبر السلالة مستقرا وراثيا إذا لم يلاحظ فرق كبير (p > 0.05) في إنتاج حمض اللاكتيك بين الأجيال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استنادا إلى منصة الميكروفلويديك القطرية الآلية، تم إنشاء نموذج فحص عالي الإنتاجية. تم بناء مكتبة طفرة من B. coagulans بواسطة طفرات ARTP بزمن إشعاع مثالي يبلغ 20 ثانية، مما أعطى معدل فتة يقارب 90٪ (الشكل 4A). ثم تم تغليف الخلايا المتحولة في قطرات بحجم 14 بيلومتر، قطرها حوالي 30 ميكرومتر، بمعدل توليد 1500 هرتز (الشكل 4B). بعد الحضانة عند 45 درجة مئوية لمدة 10 ساعات، تم حقن الحساس بتقنية البيكو في كل قطرة بمعدل 200 هرتز (الشكل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول سير عمل موحد لفحص الميكروبات الصناعية يعتمد على منصة ميكروفلويدية آلية للقطرات. يشمل سير العمل المتكامل بناء مكتبات الطفرات، وتوليد القطرات وتغليف الخلية الواحدة، وزراعة المفاعلات الدقيقة، وحقن المستشعرات الحيوية، وفرز القطرات المنشطة بالفلورة، والتحقق النهائي من السلالات المستهدفة. باستخدام فحص عالي الإنتاجية لمادة B. coagulans المنتجة لحمض L-لاكتيك عالية الإنتاجية كحالة تحقق، أظهر هذا السير عدة مزايا مقارنة بطرق الصفائح الدقيقة التقليدية وصفائح الأجار في سي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شياوجي قوه وليان وانغ هما موظفان في شركة جيانغسو تي ماكس تري للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، التي تصنع منصة الميكروفلويديك القطرية الآلية والرقائق الدقيقة المستخدمة في هذه الدراسة. تعلن الشركة أنها لا تملك مصالح متنافسة فيما يتعلق بهذا العمل ولم يكن لها دور في تصميم الدراسة، أو جمع البيانات، أو التحليل، أو التفسير، أو إعداد المخطوطات. المؤلفون الآخرون يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل مشروع المواد المتقدمة - المشروع الوطني للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة 2024ZD0603600). تم تقديم دعم إضافي من برنامج العلوم والتقنية في قوانغدونغ (رقم المنحة 2024B1111130002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	لتحضير الصفيحة الصلبة
Anhydrous Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	مسح وتطهير مكاتب المختبرات والأجهزة
Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	تم استخدام ARTP لبناء مكتبة المتحولات لتحور السلالات.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	استخدم B. coagulans ATCC 7050 كسلعة أساسية للتحور وهدف لفحص القطيرات عالي الإنتاج.
Black microplate (96 well)	Corning	3925	تم استخدام الصفيحة الدقيقة السوداء ذات 96 فتحة لاختبارات مستشعر اللاكتات وتحديد تركيز حمض اللاكتيك.
Calcium carbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	لعزل المنتجين المفرطين للحمض اللاكتيك L-
Calcium chloride	Sinopharm	10005819	يستخدم كلوريد الكالسيوم في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Calcium L-lactate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	يستخدم كعينات لتحضير المنحنى القياسي في عملية الكشف.
Centrifuge tube (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	يستخدم لتخفيف السائل البكتيري
Collection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	لجمع القطيرات والزراعة اللاحقة
Computer	Lenovo	E450	تركيب البرنامج والتحكم في خلية DREM.
DAPI	Solarbio	c0065	لصبغ الخلايا.
Deep-well plate (24-well)	BKMAMLAB	110424008	للتحقق الأولي من عائد B. coagulans المتحولات باستخدام صفائح بعمق جيد
Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	يستخدم عامل إزالة استحلاب القطيرات لتكسير القطيرات المائية داخل الزيتية الدقيقة وإطلاق الخلايا أو السلالات أو المحلول فوقي للكشف والتحليل اللاحقين.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	يستخدم D-Glucose في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Diammonium hydrogen citrate	Solarbio	D9950	يستخدم السترون الهيدروجيني ثنائي الأمونيوم في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	P8281	يستخدم الفوسفات الهيدروجيني ثنائي البوتاسيوم اللامائي في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
DREM Software version	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	للتحكم في أداة خلية DREM. يعتبر برنامج DREM برنامجًا تجاريًا مملوكًا حصريًا لأداة DREM Cell من قبل شركة Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. ولا يوجد لديه وصول رسمي أو رابط تنزيل رسمي ويمكن توزيعه فقط مع الأداة تحت التفويض.
Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	استخدم لتغليف الخلايا الفردية وفرزها عالي الإنتاجية لفحص السلالات عالية الإنتاج بسرعة من مكتبة المتحولات.
Droplet generation chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	يستخدم شريحة توليد القطيرات لإنتاج قطرات أحادية اللون بحجم بيكوليتر (pL) للتغليف الفردي للخلايا.
Droplet injection chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	يستخدم شريحة الحقن الدقيقة للقطيرات لتحقيق حقن دقيق وتتبع الكواشف في القطيرات المتكونة مسبقًا لتفاعلات كيميائية حيوية لاحقة.
Droplet sorting chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	يستخدم شريحة فرز القطيرات لفرز القطيرات المستهدفة التي تحتوي على خلايا عالية الإنتاجية بناءً على إشارات الفلوريسنس.
Erlenmeyer shake flask (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	يستخدم لتوسيع نطاق زراعة التحقق من السلالات المتحولة B. coagulans بعد الفحص الأولي بصفائح بعمق جيد، وذلك لتأكيد استقرار وقابلية تكرار السلالات عالية الإنتاج.
Filter Membranes (0.22 μm)	Merck	SLGPR33RB	يستخدم لترشيح محلول التخمير.
Fluorescence inverted microscope	Olympus	IX73	استخدم مجهر الانعكاس الفلوري IX73 من Olympus لمراقبة شكل البكتيريا داخل القطيرات
Fluorinated Oil	Bio-Rad	1864006	يعمل الزيت الفلوري كمرحلة مستمرة في الميكروفلويديات القطيرية لإنشاء قطرات مائية داخل الزيتية مستقرة وحيدة اللون وغير متداخلة، مما يدعم زراعة الخلايا الفردية والكشف.
High Performance Liquid Chromatography column	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	يستخدم لفصل حمض اللاكتيك من المكونات الأخرى في محلول التخمير وفقًا لخصائص الاحتفاظ المختلفة، وذلك لتحقيق الكشف الكمي الدقيق لحمض اللاكتيك.
High-Performance Liquid Chromatography	Shimadzu	228-34001-02	يستخدم HPLC للكشف الكمي والتحليل لحمض اللاكتيك L في عينات التخمير.
Injection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	لحاقن طور الزيت، معلق بكتيريا العينة، ومحلول الكاشف
Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate
Laminar flow hood	Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd	SP20230501	يستخدم للتشغيل المعقم في زراعة وتخمير B. coagulans.
Magnesium sulfate heptahydrate	Sinopharm	10013018	يستخدم مستخلص الخميرة في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Manganese sulfate monohydrate	MACKLIN	M813856	يستخدم الكبريتات المنغنيزية أحادية الماء في تحضير وسط زراعة الكائنات الحية الدقيقة، مما يوفر العناصر الغذائية الأساسية لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
Microplate reader	TECAN	TCAT92000001	للكشف الفلوري عن خليط مستشعر اللاكتات وحمض اللاك

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233

الفحص عالي الإنتاجية للطافرات العصية المثلجة التي تنتج حمض اللاكتيك L-اللاكتيك وتعمل باستخدام منصة ميكروفلويدية آلية للقطرات

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة