بروتوكولات للتربية الفعالة والتحليل الوظيفي للدبور الطفيلي الداخلي Asobara japonica ومضيفه ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر

ملخص

هدف هذا البروتوكول هو تسهيل التحليل الوظيفي لتفاعلات الطفيليات والمضيف في أسوبارا جابونيكا وذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. من خلال طرق تربية محسنة، واختبار عدوى بوضع بيضة واحدة، وإسقاط جيني بوساطة RNAi.

الملخص

الطفيليات هي تفاعل بيولوجي يستغل فيه كائن حي ما جسم أو موارد كائن آخر (المضيف)، مما يؤدي إلى أضرار كبيرة أو موت للمضيف. بين الحيوانات الطفيلية، تعتبر دبابير الطفيليات من أكثر السلالات غناء بالنوع، حيث تمثل ما يقرب من 20٪ من جميع أنواع الحشرات. على وجه الخصوص، تضع الدبابير الطفيلية الداخلية البيض مباشرة في أجسام المضيف وتنشر مجموعة متنوعة من عوامل السم للتلاعب بتطور المضيف والمناعة والفسيولوجيا. استجابة لهجوم الدبابير، يحاول المضيفون القضاء على بيض الطفيليات من خلال آليات مناعة فطرية. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية والخلوية التي من خلالها مكونات السم الفردية التي تعدل بيولوجيا المضيف وتعزز الطفيليات الناجحة غير مفهومة بشكل جيد. هنا، نصف بروتوكولا مخبريا موحدا لتربية دبور الطفيليات الداخلية Asobara japonica ومضيفه ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. تتوفر كل من السلالات العذرية الجينية والجنسية من A. japonica، وتظهر السلالة العذرية نسبة نجاح عالية في الطفيليات، مما يسمح بالحفاظ على مستقرة لمخزونات المختبر لتحليل الجينوم واختبارات الطفيليات. تم تحسين اختبار العدوى بوضع البيض الواحد وطريقة إزالة الجينات المعتمدة على RNA مزدوج السلسلة للتحليل الوظيفي لجينات السم. معا، توفر هذه البروتوكولات إطارا تجريبيا عمليا لتحليل الآليات الجزيئية الكامنة وراء تفاعلات الطفيليات والمضيف، وستسهل الأبحاث المستقبلية في علم الأحياء التطوري، والمناعة، وعلم وظائف الأعضاء.

المقدمة

الطفيليات هي نمط حياة يستغل فيه كائن حي الموارد الغذائية لآخر ومنتشر بين الأنواع المختلفة. يقدر أن ما يصل إلى نصف الكائنات المعروفة تظهر طفيليات في دورة^{حياتها 1}. من بين الطفيليات، تعتبر الدبابير الطفيلية مجموعة متنوعة بشكل خاص، حيث تمثل حوالي 20٪ من جميع الحشرات². يستغلون مجموعة واسعة من مضيفي المفصليات، مثل الحشرات والعناكب والعث، ويظهرون تنوعا ملحوظا في تاريخ حياتهم واستراتيجياتهم الطفيلية³. تجعل هذه الخصائص الدبابير الطفيلية واحدة من أنجح مجموعات الحشرات تطوريا وبيئيا.

تمت دراسة التفاعلات بين الطفيليات ومضيفيها بشكل موسع كنماذج لأنظمة "سباقات التسلح" التطورية. على وجه الخصوص، تستخدم الدبابير الطفيلية مجموعة متنوعة من العوامل، بما في ذلك السموم، والفيروسات التعايشية، والخلايا التيراتوسيتية ^4,5. تؤثر هذه العوامل على فسيولوجيا وتطور المضيف، مما يضمن نجاح التطور داخل المضيف. على الرغم من هذه التقدمات، لا تزال الآليات الجزيئية التي تقوم عليها الطفيليات غير مفهومة جيدا في معظم أنواع الطفيليات. أحد القيود الرئيسية هو صغر حجم أجسامها، مما أعاق التعرف الكيميائي الحيوي على مكونات السم. بالإضافة إلى ذلك، من الناحية التقنية صعوبة في الحفاظ على الطفيليات ومضيفيها في مراحل تطورية متزامنة تحت ظروف المختبر.

التطورات الحديثة في التسلسل من الجيل القادم وتقنيات الأوميكس الأخرى تتيح الآن إجراء تحليلات شاملة للجينوم حتى في الأنواع الطفيلية الصغيرة جدا. فتحت هذه الأساليب آفاقا جديدة للتحقيق في آليات جزيئية لم تكن متاحة سابقا، مما سمح بدراسة تفاعلات الطفيليات والمضيف بدقة غير مسبوقة. في هذا السياق، يركز مختبرنا على نوع Asobara japonica Belokobylskij  (غشائيات الأجنحة: Braconidae)، وهو نوع تم تحديده أصلا في اليابان ^6,7,8. تشمل أ. جابونيكا سلالة ثيليتوكوس العذرية الوراثية، حيث تنجب الإناث ذرية دون تزاوج. تسمح لنا هذه الخاصية بجمع كميات كبيرة من الحمض النووي الجيني الموحد وراثيا لتسلسل الجينوم الكامل⁹. بالإضافة إلى ذلك، يتطفل هذا النوع على مجموعة واسعة من أنواع ذبابة الفاكهة، بما في ذلك الكائن النموذجي D. melanogaster،  الذي يقدم مزايا تجريبية كبيرة بسبب ظروف التربية الراسخة ومراحل النمو المحددة بدقة، مما يتيح إجراء اختبارات عدوى قابلة للتكرار والتحكم الدقيق في تطور الطفيليات¹⁰.

أثناء تطفل A. japonica، تقوم أنثى الدبور بحقن السم مع بيضة واحدة في يرقة ذبابة، حيث تنمو يرقة الدبور بجانب مضيفها. ومن الجدير بالذكر أن A. japonica يظهر معدل نجاح مرتفع في الطفيليات لدى D. melanogaster المضيف، مما يجعل هذا الزوج من الطفيليات والمضيف نموذجا تجريبيا قويا. هنا، نصف بروتوكولات التربية المستقرة، واختبار العدوى بوضع البيض الواحد، وطريقة إزالة الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (dsRNA) في A. japonica. توفر هذه البروتوكولات إطارا موثوقا لتحليل الآليات الجزيئية الكامنة وراء تفاعلات الطفيليات والمضيف.

البروتوكول

يتم عرض نظرة تخطيطية لطريقة التربية المتزامنة ل D. melanogaster و A. japonica في الشكل 1.

1. تربية ذبابة الفاكهة المضيفة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر في المختبر

1. حافظ على جميع الحيوانات التجريبية عند 25 درجة مئوية ورطوبة نسبية بين 50-60٪ تحت دورة ضوء/ظلام 12:12 ساعة. استخدم السلالة البرية أوريغون-آر (أوريغون) كمضيف لألبوم أورغون-جابونيكا (الشكل 2A).
2. نقل الذباب البالغ إلى قارورة طعام جديدة تحتوي على وسط دقيق الذرة-الخميرة-الأجار القياسي (0.55٪ آجار، الجدول 1). ضع علامة على القارورة بتاريخ النقل واسم السلالة ب "OR".
3. تخلص من هذه الذباب البالغ بعد يوم واحد من النقل لمنع وجود عدد زائد من البيض في الطعام. تأكد من أن يرقات النسل تتغذى على سطح الطعام.
   ملاحظة: كإرشاد، حافظ على حوالي 200-250 بيضة لكل قارورة طعام (φ30×100 مم). قد تقلل كثافة البيض الأعلى من نجاح الطفيليات وتزيد من التنوع في تطور العائل والدبابير.
4. بعد أربعة أيام من الخطوة 1.2، انقل ملعقة من يرقات الذباب (بعد 4 أيام من وضع البيضة، dAEL) إلى قارورة طعام جديدة. حافظ على هذه اليرقات دون تعرض للطفيليات للجيل القادم. تساعد هذه العملية أيضا في التحكم في كثافة اليرقات المضيفة في القارورة.

2. تربية دبور الطفيليات الداخلية Asobara japonica في المختبر

1. استخدم سلالة التوالد العذري طوكيو (TK) وسلالة جنسية إيريموتي-جيما (IR) (الشكل 2B). الأولى تتكون من الإناث، بينما الثانية تتكون من الإناث والذكور. الذكور يقتربون من الإناث قبل يومين إلى أربعة أيام. لذا، تأكد من وجود الإناث بواسطة أجهزة وضع البيض قبل النقل.
2. انقل 10-20 دبارا بالغة مباشرة من القارورة الأصلية إلى القارورة التي تحتوي على يرقات الذباب عند 4 دلال (dAEL). ضع علامة على القارورة بتاريخ النقل واسم السلالة "TK" أو "IR". حافظ على الدبابير في نفس الظروف التي وضعها Step 1.1.
3. اسمح للدبابير البالغة بوضع البيض في يرقات الذباب. تخلص من هذه الدبابير بعد يوم إلى يومين لمنع الطفيليات الفائقة، التي قد تؤدي إلى موت المضيف. قم بإزالة الذباب البالغ المغلق الذي هرب من الطفيليات بعد 10 أيام أو أكثر من الخطوة 2.2.
4. بعد أسبوعين من الخطوة 2.2، تبدأ الدبابير البالغة في الاقتراب من غلاف عذراء ذبابة المضيف. انقل هذه الدبابير البالغة المغلقة حديثا إلى قارورة طعام جديدة تحتوي على ورق فلتر يحتوي على 25٪ جلوكوز ومحلول فيتامين C بسعة 50 ملم. يجب تعقيم قطع ورق الفلتر عند درجة حرارة 130 درجة مئوية لمدة ساعتين. توفير المحلول على ورق الترشيح يعزز سلوكيات وضع البيض ويطيل عمر الدبابير البالغة. استلهم نهجنا في استخدام فيتامين C لتعزيز وضع البيض من ملاحظات دراسات ذبابة الفاكهة ¹¹.

3. اختبار عدوى بوضع البيض الواحد

1. مزامنة مرحلة التطور ليرقات الذباب المستخدمة في تجربة العدوى.
   1. ضع الذباب البالغ في أنبوب بحجم 50 مل يحتوي على طبق عصير العنب (3٪ أجار) مفرد بمعجون الخميرة الطازج ودعه يضع البيض لمدة 24 ساعة.
   2. اجمع اليرقات من المرحلة الأولى حديثا على طبق عصير العنب وانقلها إلى قارورة صغيرة (12 مل) تحتوي على 2-3 جرام من معجون طعام الذباب (طعام ذبابة ممزوج بكمية مناسبة من الماء). يتم وضع 20-30 يرقة في القارورة. يسمح ليرقات الذباب بالنمو عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
2. في الوقت المناسب، جهز طبق بترى بقطر 4 سم يحتوي على طبقة رقيقة ومتساوية من معجون طعام الذباب تغطي مساحة قطرها حوالي 1.5-2.0 سم (ويشار إليها لاحقا بساحة اختبار العدوى). بالإضافة إلى ساحة اختبار العدوى، حضر قارورة صغيرة جديدة (12 مل) تحتوي على كمية مناسبة من معجون طعام الذباب. تستخدم هذه القارورة لتربية يرقات المضيف بعد اختبار العدوى.
3. اجمع اليرقات المرحلية ونقلها إلى طبق يحتوي على ماء منزوع الأيونات (المقاومة = 15 MΩ·cm، 25 °C). اشطف اليرقات في الطبق بحركة خفيفة لإزالة بقايا الطعام من أجسامها.
4. بعد الشطف، قم بإزالة الرطوبة الزائدة من اليرقات بلطف باستخدام مناديل ورقية خالية من الوبر، حيث أن الماء الزائد يتداخل مع سلوك وضع البيض للدبابير في منطقة فحص العدوى. ثم انقل اليرقات إلى الحلبة. تزيد هذه الخطوة من نشاط اليرقات أثناء تجربة العدوى.
5. تخدير الدبابير البالغة_{بغاز ثاني} أكسيد الكربون بمعدل تدفق 5 لتر·دقيقة ^وضغط 0.2 ميغاباسكال. ثم ضع بلطف حوالي ثلاث دبابير إناث في ساحة اختبار العدوى. أغلق غطاء الطبق ودعهم يتعافون على معجون طعام الذباب.
6. راقب سلوك وضع البيض لهذه الدبابير تحت المجهر المجسم (إعداد التكبير: 10× إلى 15×).
   ملاحظة: عندما تلمس الدبور جسم يرقة ذبابة متحركة، تدخل بسرعة جهاز وضع البيض في جسم الذبابة وحقن مكونات السم. على الرغم من أن يرقة الذبابة تتلوى وتتلوى بجسدها، إلا أنها تصاب بالشلل فورا. بعد ذلك، يهتز الدبور في بطنه ويودع بويضة في جسم يرقة المضيف، وبعدها يتم سحب المبيضة. يشار إلى هذا السلوك في وضع البيض بالعدوى.
7. بعد العدوى، افتح الغطاء وانقل يرقة الذبابة المصابة إلى القارورة الصغيرة الجديدة التي تحتوي على معجون طعام الذباب المحضر في الخطوة 3.2. لتوحيد توقيت العدوى، قم بإجراء تجربة العدوى خلال 15 دقيقة.
8. ضع علامة على القارورة الصغيرة بمعلومات تجريبية مثل التاريخ، اسم العينة، وقت العدوى، وعدد الأفراد. يتم سد هذه القوارير ثم وضعها في حاوية رطبة وتحفظ عند 25 درجة مئوية.

4. توليد دبابير تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) عن طريق حقن dsRNA

1. تخليق dsRNA بطول 400 قطعة قاعدة أو أكثر لإزالة الجين بوساطة dsRNA (تداخل RNA، RNAi) باستخدام نظام تخليق dsRNA قائم على النسخ الصناعي . يجب الحفاظ على عينات dsRNA عند -20 إلى -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. البروتوكولات التفصيلية كما ذكرت سابقا^{هي 9}.
2. حضر طبق بتري بحجم 5.5 سم يحتوي على 2٪ أجار لوضع أجسام الدبابير. املأ ثلثي كل طبق بالأجار لتكوين طبقة سميكة من صفيحة الأجار للحقن.
3. ضع مناديل ورقية خالية من الوبر مبللة بالماء على غطاء طبق بلاستيكي.
4. اجمع عذراء ذبابة المضيف بعد 7 أيام من العدوى (DPI) من القارورة وضعها على مناديل ورقية خالية من الوبر المحضرة في الخطوة 4.3. إضافة قطرة ماء إلى جدار القارورة يساعد في فصل عفويات عفارقة ذبابة المضيف عن القارورة.
5. تحت المجهر المجسم (إعداد التكبير: 20×)، أزل غطاء عذراء ذبابة المضيف وكشف جسم دبور باستخدام الملقط. عند 7 نقاط في البوصة، تكون معظم الدبابير في مرحلة العذراء، حيث يمكن تمييز أجزاء الرأس والصدر والبطن. جسم الدبور غير متحرك.
6. ضع أجسام الدبابير المستخرجة على لوحة الأجار المعدة في الخطوة 4.2، مع محاذاة محاور أجسامها في نفس الاتجاه. رتب 20-30 جسم دبور بحيث يكون جانبها الظهري مرفوعا في صف إلى صفين. أزل الرطوبة الزائدة من طبق الأجار باستخدام مناديل ورقية خالية من الوبر لمنع انزلاق الدبابير.
7. باتباع تعليمات الشركة المصنعة، قم بتركيب جهاز الحقن والميكروسكوب المجسمي (الشكل 3A). استخدم نظام حقن دقيق مزود بإبرة شعرية زجاجية تسمح بالتحكم الدقيق في حجم الحقن وسرعة الحقن. ضع صفيحة الأجار التي تكون رؤوس الدبابير موجهة فيها نحو طرف إبرة الحقن. حجم الحقن هو 50 نانولتر·^دبور-1 وسرعة الحقن 50 نانولتر·ثانية ^واحدة على الحقنة.
8. جهز إبر الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام أداة سحب الإبر. شكل الشعيرات الدموية الزجاجية قابل للتعديل حسب درجة حرارة السخان.
9. ضع الإبرة الشعرية الزجاجية على مطحنة الإبر بزاوية 30-35°. قم بطحن الإبرة حتى يصل طول الرأس إلى 0.04 مم (أربعة أقسام على مؤشر العدسة العينية، الشكل 3B).
10. قبل الحقن مباشرة، قم بإذابة dsRNA. تركيز dsRNA هو 0.25-1 ميكروغرام·^{ميكروليتر-1}. للتصور، يتم تلوين محلول dsRNA بصبغة زرقاء (ملح إريوغلاوسين ثنائي الصوديوم، 2٪ وزن·^حجم-1). باستخدام رأس ماصة التحميل الدقيق، املأ الشعيرات الدموية الزجاجية بمحلول dsRNA بصبغة زرقاء. 4 ميكرولتر يكفي لحقن 30 جسم دبابير. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل المحلول.
    ملاحظة: بعد تحميل محلول dsRNA، اضغط بلطف على جانب الإبرة بظفر لإزالة أي فقاعات هواء محبوسة. يمكن أن تعيق فقاعات الهواء المتبقية تدفق المحلول وتعيق الحقن الناجح.
11. باستخدام حقنة بسعة 1 مل وإبرة، املأ الجزء غير المشغول من الشعيرات الدموية الزجاجية بزيت معدني، لضمان عدم بقاء فقاعات هواء داخل الشعيرات الدموية.
12. قم بتثبيت الإبرة الزجاجية الشعرية التي تحتوي على محلول dsRNA وزيت معدني على حامل الإبر ثم ثبتها على جهاز الحقن.
13. قم بضبط موضع لوحة الأجار وإبرة الشعيرات الدموية الزجاجية على الحقن، بحيث تكون الإبرة الزجاجية موضوعة بزاوية 30-45° بالنسبة لأجسام الدبابير (الشكل 3A).
14. أدخل الإبرة الزجاجية الشعرية في الجانب الظهري من جسم الدبور، مع الجانب الجانبي قليلا إلى الخط الأوسط الظهري. حقن محلول dsRNA داخل الجسم. محلول dsRNA المحقون مرئي بصبغة  زرقاء (الشكل 3C).
15. بعد الحقن، ضع صفائح الأجار في وعاء رطب (رطوبة نسبية 70-80٪) واحتفظ بها في حاضنة بدرجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة أسبوع حتى تقترب الدبابير البالغة. يجب إزالة أجسام الدبابير المصابة من صفيحة الأجار لمنع التلوث البكتيري.
    نقطة توقف: في الخطوة 4.6، يمكن إبقاء عذراء الدبور على صفيحة الأجار لعدة ساعات قبل الحقن. يمكن تحضير الإبر مسبقا (الخطوة 4.8 و4.9)؛ ومع ذلك، فهي عرضة للانسداد مع مرور الوقت. عادة ما توفر الإبر الطازجة أداء حقن أكثر موثوقية.

النتائج

السلالات اللاجنسية والجنسية في أسوبارا اليابانية
تنتشر أ. يابونيكا على نطاق واسع في جميع أنحاء اليابان. السلالات البارثينوجينية الثيليتوكوس سائدة في الجزر الرئيسية، بينما توجد سلالات جنسية مجهزة في الجزر شبه الاستوائية، بما في ذلك جزر أماني-أوشيما وإيريوموتي-جيما^8،12. في السلالات الجنسية، يخرج الذكور قبل الإناث ببضعة أيام، لذا يكون توقيت نقل البالغين مختلفا بين هذه السلالات. يتم تحفيز التوال...

المناقشة

في هذه الدراسة، أنشأنا منصة تجريبية متعددة الاستخدامات للتحقيق في تفاعلات الطفيليات والمضيف على المستوى الجزيئي. من خلال تحسين ظروف التربية، واختبار العدوى بوضع البيض الواحد، وبروتوكول RNAi، نوفر نظاما قويا للدراسات الوظيفية للعوامل المشتقة من الطفيليات. ستسهل هذه المنصة دراسات مستقبلية تهدف إلى كشف الآليات التي تتلاعب بها الدبابير الطفيلية بتطور العائل، وقد تساهم أيضا في تطوير استراتيجيات مكافحة آفات بيولوجية.

توفر سلالة Tk المصابة ب Wolbachia من

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	اختبار العدوى
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	حقن dsRNA
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	التربية
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	اختبار العدوى
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	حقن dsRNA
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	حقن dsRNA
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	التربية
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	اختبار العدوى
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	تحليل الصور
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	التربية
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	تلطيخ النواة، 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	اختبار العدوى
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	حقن dsRNA
Fiji	NA	https://fiji.sc	تحليل الصور
Filter paper	Advantec	ITEM 526	التربية
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	التربية
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	التربية
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	التشريح
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	تخزين العينات
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	تخزين العينات
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	اختبار العدوى
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Not availavle	التربية
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	تخليق dsRNA
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	التربية
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	تخليق dsRNA
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	حقن dsRNA
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	حقن dsRNA
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	حقن dsRNA
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	حقن dsRNA
pBluescript KS (+) plasmid	Not availavle	Not availavle	تخليق dsRNA
pBluescript SK (-) plasmid	Not availavle	Not availavle	تخليق dsRNA
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	تخليق dsRNA
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	التربية
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	اختبار العدوى، حقن dsRNA.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	اختبار العدوى
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	اختبار العدوى
Spatula	As One Corporation	6-522-02	التربية
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	حقن dsRNA
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	اختبار العدوى
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	حقن dsRNA
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	تخليق dsRNA
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	تخليق dsRNA، qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Not availavle	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	التربية
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	اختبار العدوى
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	التربية