مقالة منهجية

النظام البصري لتقييم ميكانيكا الأذين والبطين في قلوب الفئران المرواة بطريقة لانجندورف

DOI:

10.3791/72264

⸱

أغسطس 14, 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إجراءات استخراج قلب الفأر وقسطرته، بالإضافة إلى تحضير وتجهيز نظام لانجندورف للإرواء التراجعي. يرتبط الإعداد التجريبي بنظام بصري عالي الدقة مصمم لتقييم الاستجابات الميكانيكية للأذينين والبطينين مع الحفاظ على ديناميكياتهما الطبيعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يُعد قلب الفأر نموذجاً شائع الاستخدام في أبحاث القلب والأوعية الدموية، وذلك بفضل التقدم في التقنيات الهندسية. ومع ذلك، لا يزال تقييم انقباضية الأذين والبطين يمثل تحدياً بسبب صغر حجم قلب الفأر. تقدم هذه الدراسة منهجية جديدة لتقييم الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم. يتيح استخدام قلب فأر يتم ترويته بطريقة Langendorff بالتزامن مع نظام بصري عالي الدقة تقييم انقباضية الأذين والبطين. ويعالج الإعداد التجريبي التحديات المرتبطة بصغر حجم القلب ومعدلات الانقباض السريعة مع الحصول على إشارات عالية الدقة. وكان التزامن بين تردد التحفيز وتردد انقباض القلب في نطاق يتراوح من 420 إلى 660 نبضة في الدقيقة (bpm) متسقاً مع النتائج المستخلصة من طريقة auxotonic. بالإضافة إلى ذلك، تسمح قياسات تقصير البطين والإشارات الديناميكية للأذين بتحديد الانقباض الأذيني البطيني. وتعتبر هذه الطريقة مناسبة لتقييم الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم دون تأثيرات صيدلانية أو جهازية. وتظهر هذه النتائج أن النظام البصري يتيح قياس استجابات تقصير البطين والأذين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك الكثير لاكتشافه في فسيولوجيا القلب؛ حيث تُعد العمليات الرئيسية، مثل تنظيم ضربات القلب واقتران الاستثارة والتقلص، من المبادئ الأساسية التي تخضع للبحث المستمر1. ورغم أن تأثيرات الضوضاء البيولوجية على انقباضية القلب2 ونشاط تنظيم ضربات القلب لا تزال غير مفهومة بشكل جيد1، إلا أن طرق التصوير الضوئي الجديدة سمحت بطرح نماذج معرفية جديدة3,4.

لقد قدمت منهجيتان تجريبيتان تستخدمان نظام لانجندورف (Langendorff) مساهمات قيمة في قياس الوظائف القلبية. الأولى هي طريقة الانقباض متساوي الحجم (isovolumic contraction)، حيث يتم الحصول على إشارة من بالون صغير يتم إدخاله في البطين الأيسر5,6,7. والثانية هي طريقة تسجيل الانقباضات الأوكسوتونية (auxotonic recording)، حيث يتم الحصول على إشارة عن طريق خياطة أحد طرفي خيط في قمة القلب والطرف الآخر في جهاز تسجيل ميكانيكي لقياس الانقباضات الأوكسوتونية على طول محور القلب2,8. ومع ذلك، فإن تقييم قدرة الأذين والبطين على الانقباض في قلب الفأر يمثل تحدياً نظراً لصغر حجمه. علاوة على ذلك، يتطلب التحضير درجة معينة من الرفق، لأن القلب عرضة للإصابة9,10,11,12,13.

يتميز النظام البصري لتقييم الديناميكيات الميكانيكية لقلوب الفئران بالعديد من الخصائص والمزايا المبتكرة. أولاً، تعد هذه الطريقة مناسبة لتقييم القدرة الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم في غياب التأثيرات الدوائية أو الجهازية. كما يمكن توظيف هذا البروتوكول بفعالية في التجارب التي تقيم إصابة نقص التروية وإعادة التروية عند دراسة العلاجات القائمة على الأدوية، أو تجديد الخلايا، أو العلاج بالأكسجين.

نقدم في هذه الورقة بروتوكولاً لتسجيل المعاملات الفيزيائية الحيوية لوظيفة انقباض قلب الفأر باستخدام نظام بصري عالي الدقة. وتساعد هذه الطريقة في تقييم القدرة الانقباضية ومعدل ضربات القلب في قلب معزول وسليم. علاوة على ذلك، فهي تسمح بتقييم القدرة الانقباضية للأذين والبطين. ويمثل تحضير قلب الفأر بطريقة لانجندورف (Langendorff) تحسيناً يتضمن تعديلاً طفيفاً لتقليل فقدان درجة حرارة سائل التروية وتقليل الشوائب الحركية دون تثبيط الانقباضات العضلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقاً للوائح الاتحادية الخاصة بتجارب ورعاية الحيوان، وصادقت عليها لجنة رعاية الحيوان في CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico). في هذه الدراسة، تم استخدام ذكور الفئران من سلالة C57BL/6J، التي تتراوح أوزانها بين 28–34 g، وأعمارها بين 8–14 أسبوعاً. جميع المواد والمعدات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في جدول المواد. توفر الملفات التكميلية 1-11 الرسوم التوضيحية الداعمة، وأدلة البرمجيات، وبرامج التحليل، وبيانات تنظيم ضربات القلب، وملفات التطبيق الخاصة بالبروتوكول.

1. تحضير المحاليل القياسية

  1. قم بتحضير محلولين مخزنين مسبقاً واحفظهما في الثلاجة عند درجة حرارة 4 °C: (1) المحلول المخزن I، بحجم 1 L (في ماء منزوع الأيونات؛ بتركيز g/L: 76.13 NaCl، و4.02 KCl، و1 MgCl2(6H2O)، و0.4 NaH2PO4) و (2) المحلول المخزن II، بحجم 0.1 L (في ماء منزوع الأيونات؛ بتركيز g/L: 73.5 CaCl2(2H2O)).
    ملاحظة: يمكن استخدام المحاليل لمدة تصل إلى 30 يوماً بعد التحضير. تُحفظ عند 4 °C.

2. توصيل وتنظيف نظام لانجيندورف

  1. قم بتوصيل الخزان (1)، والحمام المائي الحراري للخزان (2)، ومضخة التروية (3)، والملف الحلزوني (4)، وجهاز إعادة تدوير الملف الحلزوني (5)، ونظام المراقبة (6)، ونظام التصريف (8)، كما هو موضح في الشكل 1أ.
    ملاحظة: يظهر الاتصال بين نظام المراقبة ونظام الصرف بمزيد من التفصيل في الملف التكميلي 1.
  2. املأ نظام لانجندورف (Langendorff) بـ 1 لتر من الماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 50 درجة مئوية، ثم ابدأ بتشغيل مضخات التروية والتصريف. (الملف التكميلي 1، نظام تصريف)بعد مرور 20-30 دقيقة تقريبًا، قم بإزالة السائل من النظام، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: تحقق من عدم وجود تسريبات أو انخفاض في الضغط في النظام. في حال حدوث ذلك، لا تواصل التجربة.
  3. املأ النظام بـ 1 لتر من حمض الأسيتيك بتركيز 1% (المذاب في ماء منزوع الأيونات)، ثم أوقف تشغيل مضخات التروية والتصريف وانتظر لمدة 60 دقيقة، ثم قم بتشغيل المضخات لإزالة السائل.
  4. كرر الخطوة 2.2 مرتين.
  5. املأ النظام بإيثانول بتركيز 70% (مذاب في ماء منزوع الأيونات) لمنع التصاق مكونات المحلول.
    ملاحظة: يجب تنظيف نظام تروية لانجندورف كل عشر تجارب أو شهرياً. تم شرح بروتوكول التنظيف السابق للتجربة في القسم 4بينما تم تفصيل بروتوكول التنظيف ما بعد التجربة في القسم ٨.

3. تحضير محلول تايرود (Tyrode solution) أثناء التجربة

  1. تحضير 1 L من المحلول بتركيزات mM: 130.25 NaCl، و5.4 KCl، و0.53 MgCl2(6H2O)، و0.33 NaH2PO4، و1.8 CaCl2(2H2O)، و10 D-glucose، و10 HEPES، مع ضبط الرقم الهيدروجيني pH ليكون 7.35 ± 0.05 باستخدام NaOH.
    1. اخلط 100 mL من المخزون I (Stock I) مع 700 mL من الماء منزوع الأيونات تحت تحريك مستمر، ثم ارفع درجة حرارة المحلول إلى 37 °C؛ وحافظ على أكسجة المحلول عن طريق توصيل خزان O2 بالحجر الهوائي كما هو موضح في الشكل 1A (1).
    2. أضف 3.6 mL من المخزون II (Stock II) و96.4 mL من الماء منزوع الأيونات للحصول على 1.8 mM CaCl2(2H2O)، ثم أضف NaOH لضبط الرقم الهيدروجيني pH إلى 7.35 ± 0.05.
    3. أكمل الحجم بالماء منزوع الأيونات للحصول على 1 L من محلول تايرود (Tyrode solution).
      ملاحظة: يُوصى بتخزين 100 mL من المحلول في الثلاجة عند 4 °C؛ حيث سيتم طلب هذا الحجم لاحقاً في الخطوة 6.

4. تحضير جهاز لانغندورف

ملاحظة: إذا لم يتم ملء نظام Langendorff بالإيثانول في يوم التجربة، فلا يُنصح بالمتابعة في الإجراء؛ وبدلاً من ذلك، كرر القسم 2.

  1. قم بتشغيل مضخات التروية والتصريف. اضبط معدل تدفق مضخة التروية على 3 mL/min ومضخة التصريف على 10 mL/min. قم بتصريف النظام.
  2. املأ النظام بـ 1 L من الماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 37 °C، ثم قم بتصريف الماء.
  3. املأ النظام بمحلول Tyrode الذي تم تحضيره في الخطوة 3، وحافظ على المحلول في درجة الحرارة الفسيولوجية وأكسجة ثابتة.
  4. قم بتشغيل الحمامات الحرارية للخزان والمُعيد للدوران الحلزوني. اضبط درجة حرارة الخزان (الشكل 1A (2)) على 38 °C للحفاظ على المحلول في ظروف فسيولوجية. اضبط درجة حرارة الحلزون (الشكل 1A (5)) عند 40 °C؛ حيث يعوض هذا الفقد في درجة حرارة محلول نظام Langendorff.
    ملاحظة: إذا لم تكن درجة حرارة محلول Tyrode عند مخرج النظام فسيولوجية (37 ± 0.5 °C)، فقم بتعديل درجة حرارة المُعيد للدوران الحلزوني. لا يُنصح بالانتقال إلى الخطوة 6 حتى تستقر درجة الحرارة عند القيمة المناسبة.
  5. قم بتشغيل جهاز مراقبة الضغط (الملف التكميلي 1، نظام المراقبة) وقم بمعايرته في النطاق من 0–200 mmHg. يتوفر تطبيق المراقبة وتنظيم ضربات القلب للمساعدة في معايرة النظام (الملف التكميلي 3 و الملف التكميلي 11).
    ملاحظة: من الضروري التحقق من عدم وجود فقد في الضغط وعدم وجود فقاعات في النظام. إذا كان النظام يحتوي على فقاعات، فقم بسد المخرج السفلي للحلزون مؤقتاً وافتح الصمام العلوي؛ سيؤدي ذلك إلى ملء العمود، مما يسمح بخروج الفقاعات إلى الخارج. لا يُنصح بمتابعة التجربة حتى يتم التحقق من هذا الشرط.

5. النظام البصري14

  1. قم بتجميع كاميرا CMOS (الشكل 1-أ, 10)، وعدسة كاميرا قابلة للتعديل (LC)، ونظام إضاءة.
    ملاحظة: يتكون نظام الإضاءة من اثنين من صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) (الشكل 1-أ, 9)، وعدستي إضاءة مستويتين محدبتين (LI)، وجهاز تحكم في الإضاءة (الشكل 1أ, 11)، وبطاقة استحواذ (الملف التكميلي 1، ونظام مراقبة)، وقطع دعم مصممة ثلاثية الأبعاد (الملف التكميلي 1).
  2. ضع جسماً مرجعياً بحجم يبلغ 1,000 مم³ تقريباً3 على مسافة ١٠٠-٢٠٠ مم من عدسة الكاميرا (مركز الشكل 1أ).
    ملاحظة: يجب وضع العضو في موضع القلب ضمن نظام لانجندورف (Langendorff system). يمكن ملاحظة هذا الموضع في الشكل 1ب, تحديداً في مركز الصورة حيث تسقط حزم الضوء.
  3. قم بتشغيل برنامج التقاط الصور بالكاميرا، ثم اضبط الكاميرا على تقليل العينات بمقدار 4x (4 بكسلات = 1 بكسل فرعي). حدد منطقة اهتمام (ROI) بمقدار 200 × 200 بكسل فرعي (الملف التكميلي 2).
    ملاحظة: مع هذا التكوين، يمكن تحقيق دقة زمنية تبلغ 750 إطاراً في الثانية (fps).
  4. قم بتشغيل نظام الإضاءة (الملف التكميلي 1)، ثم اضبط حزم الضوء لتركيزها على الجسم المرجعي، وتحقيق إضاءة متجانسة (الشكل 1ب).
  5. اضبط شدة الإضاءة على الجسم المرجعي لتجنب التعريض المفرط للصورة.
    ملاحظة: يجب أن تبدو الصورة مثل الشكل 2أ (أو الشكل 1ج, جهاز الكمبيوتر المتحكم (Controller PC). يجب تقليل الانعكاسات على سطح الجسم (القلب) قدر الإمكان دون فقدان دقة تحديد معالمه. يمكن القيام بذلك عن طريق ضبط قدرة التحكم في الإضاءة (Illumination control) أو عن طريق تقليل وقت التعرض في إعدادات الكاميرا.
  6. قم بضبط تركيز عدسة الكاميرا للحصول على صورة واضحة للجسم المرجعي (الشكل 1ج، وجهاز كمبيوتر التحكم). تأكد من أن الجسم المرجعي يشغل 80% من مجال الرؤية (الشكل 2-أ) للحصول على مقياس تحويل يبلغ 61 ميكرومتر تقريبًا لكل بكسل فرعي.
    ملاحظة: يقوم النظام البصري بتفعيل نظام الإضاءة تلقائيًا عند ضبط الكاميرا على وضع الالتقاط (الشكل 1أ و الملف التكميلي 2). ويُنصح بإبقاء الكاميرا في وضع الاستعداد بحيث يظل نظام الإضاءة متوقفاً، ولا يتم تفعيله إلا خلال فترات جمع البيانات التجريبية لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.

6. الإجراءات الجراحية وعمليات التقييد

  1. إعطاء الهيبارين والتخدير
    1. قم بتحضير خليط تخدير يحتوي على تيلتامين-زولازيبام (40 mg/kg من وزن جسم الفأر) وزيلازين (10 mg/kg من وزن جسم الفأر)، ثم خففه ليصل إلى 200 µL باستخدام محلول ملحي.
    2. احقن خليط التخدير داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 G. اترك الفأر حتى يدخل في حالة تخدير عميق.
      ملاحظة: تحقق من عدم وجود رد فعل استجابةً لمحفز في الأطراف أو الذيل (عادةً ما تكون 10 min كافية).
    3. احقن 200 UI من الهيبارين غير المجزأ داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 G، وانتظر حوالي 5 min لمتابعة التجربة.
  2. الاستخراج والقسطرة
    1. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء الظهري، وقم بإزالة الفراء والجلد من المنطقة الصدرية باستخدام مقص جراحي.
    2. قم بإجراء شق بطني تحت الحجاب الحاجز، مع الحرص على الحفاظ على سلامته.
    3. تابع بإجراء شق مستعرض في الحجاب الحاجز ثم قم بسرعة بإجراء عملية فتح صدر صاعد ثنائي الجانب عبر الأضلاع، ثم قم بإزالة الجدار الضلعي.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم إتلاف القلب. إذا تضرر القلب أو حدث به خلل أثناء الإجراء، يُوصى بعدم المضي قدماً في التجربة.
    4. أمسك الهياكل العلوية للقلب برفق باستخدام ملاقط دقيقة، بما في ذلك قوس الأبهر والأوعية المجاورة. ارفعها برفق لإجراء قطع أسفلها وإلى الأعلى، ثم قم بإزالة القلب والرئتين معاً.
    5. انقل القلب بسرعة إلى طبق بتري يحتوي على 50 mL من محلول تايرود عند 4 °C لإجراء غسيل أولي.
      ملاحظة: من لحظة شق الحجاب الحاجز، سيبدأ الحيوان في المعاناة من ضائقة تنفسية؛ ومن هذه النقطة فصاعداً، توجد نافذة زمنية قدرها 60 s لتنفيذ الخطوات من 6.2.3 إلى 6.2.6. قد يؤدي تجاوز هذا الحد الزمني إلى حدوث تلف إقفاري.
    6. قم بإزالة الرئتين والأنسجة الدهنية الزائدة للكشف عن قوس الأبهر باستخدام مجهر ستيريو ومقص دقيق.
      ملاحظة: عند تنظيف الأنسجة، تأكد من عدم إتلاف قوس الأبهر. إذا قُطع الأبهر أسفل الشريان الرأسي العضدي، ستصبح القسطرة صعبة، مما قد يؤدي إلى حدوث تسرب في الضغط.
    7. انقل القلب إلى قاعدة القسطرة المصممة خصيصاً والتي تحتوي على 50 mL من محلول تايرود المنظم عند 4 °C، وأدخل الطرف الأبهري في القسطرة المصنوعة خصيصاً من إبرة قياس 20 G (Supplementary File 1).
      ملاحظة: احذر من إتلاف الصمام الأبهري. إذا تضرر الصمام، سيتورم القلب، ولن يتم غسل الدورة الدموية التاجية بشكل صحيح.
    8. اربط عقدتي قسطرة باستخدام خياطة حريرية 4/0: الأولى في التجويف البعيد عن طرف القسطرة والثانية قبل الجذع الرأسي العضدي (Supplementary File 1).
    9. قم بتطبيق محلول تايرود ببطء باستخدام محقنة 1 mL مملوءة بالمحلول المنظم في درجة حرارة الغرفة. تحقق من أن الأنسجة التاجية أصبحت صافية للتأكد من نجاح القسطرة.
    10. أزل الأنسجة الدهنية للسماح بالوصول إلى البطينين والأذينين.
      ملاحظة: تجنب تجاوز 5 min من عملية القسطرة للحفاظ على حيوية القلب.
    11. انقل القلب إلى نظام لانجندورف واتركه ليستقر لمدة 30 min.
      ملاحظة: يوضع القلب في مركز النظام (Figure 1A,B)، معلقاً بشكل رأسي. عند تعليق القلب، يجب توخي الحذر الشديد لمنع تكون فقاعات الهواء. إذا حدث ذلك، سيرتفع الضغط إلى أكثر من 140 mmHg، وسيبدأ القلب في التورم، ولن يعود قابلاً للحياة.
      ملاحظة: يكتمل تركيب نظام لانجندورف عندما يظهر القلب استجابة ميكانيكية مستقرة، وتردد تذبذب طبيعي يبلغ حوالي 360 نبضة في الدقيقة (BPM)، وضغط تروية يتراوح بين 60 و 110 mmHg.

7. بروتوكول ضبط السرعة والتسجيل المرئي

  1. حيوية القلب
    1. تحقق من أن الضغط التاجي يتراوح بين 60–110 mmHg باستخدام مضخة تروية بمعدل 3 mL/min. إذا انخفض ضغط التروية التاجي إلى أقل من 60 mmHg، قم بزيادة معدل تدفق مضخة التروية قليلاً (حيث سيؤدي الضغط المنخفض إلى جعل القلب شاحباً ومرتخياً). وعلى العكس من ذلك، إذا تجاوز الضغط 110 mmHg، قم بتقليل معدل تدفق المضخة قليلاً (حيث سيؤدي الضغط المفرط إلى إحداث وذمة في الأنسجة وزيادة تدريجية في الضغط حتى يحدث توقف قلبي).
      ملاحظة: الحفاظ على ضغط التروية خارج النطاق الأمثل المذكور أعلاه لفترة طويلة سيؤدي إلى تضرر حيوية القلب بشكل غير قابل للاسترجاع.
    2. ضع القلب في وضعية أمامية بحيث يتم الحصول على رؤية أمامية كاملة في الكاميرا. اضبط الوضعية بحيث يكون كلا الأذينين مرئيين في الكاميرا (الشكل 2A).
    3. ضع الأقطاب الكهربائية البلاتينية برفق بشكل سطحي على الجزء العلوي من الأذين الأيمن عند العقدة الناظمة. استخدم بث الكاميرا كدليل لإدخال الأقطاب الكهربائية في مجال الرؤية. ضع القطب الكهربائي بحيث لا يسد الأذين الأيمن. وأثناء مراقبة العرض المباشر للكاميرا، قم بتمرير القطب الكهربائي ببطء حتى يلامس نسيج الأذين، مع الحرص على عدم ممارسة ضغط مفرط (مما قد يؤدي إلى تسطح الأذين الأيمن في الصورة).
      ملاحظة: إذا تم التنفيذ بشكل صحيح، ستبدو رؤية الكاميرا مشابهة لـ الشكل 2A.
    4. قم بتشغيل تطبيق المراقبة والتنظيم (الملف التكميلي 11) وقم بتشغيل بطاقة الحصول على البيانات (الشكل 1A (6)). اضبط قيم معاملات التحفيز: السعة عند 2 V، والتردد عند 420 و540 و720 نبضة في الدقيقة (PPM) مع نبضة مربعة بدورة تشغيل 7 ms (إطار مدرج في الشكل 2A).
    5. طبق تحفيزات الحيوية بدءاً من أدنى تردد، باستخدام مدة تحفيز تبلغ 20 s تليها فترة تعافٍ 20 s (وقت الراحة) بين الأحداث.
      ملاحظة: قم بتقييم حيوية القلب عبر مراقبة الكاميرا. إذا كان العضو فعالاً من الناحية الفسيولوجية، فسيتم ملاحظة تزامُن بين التحفيز المطبق والاستجابة القلبية، مصحوباً بتنسيق سليم بين حجرات القلب. وعلى العكس من ذلك، سيظهر فقدان الحيوية من خلال فقدان تنسيق الحجرات أو من خلال الوجود الحصري لانقباضات أذينية معزولة.
    6. أغلق باب الحجرة لأن التجربة حساسة لضوء الغرفة والتقلبات الحرارية (الشكل 1C).
      ملاحظة: يجب أن يظل باب الحجرة مغلقاً خلال وقت التجربة. راقب حيوية القلب باستخدام الكاميرا وضغط التروية.
  2. تسجيل البيانات
    1. طبق بروتوكول التنظيم، والذي يتكون من سلسلة نبضات مربعة بمدة 30 s، تليها 30 s بدون إشارة. اضبط قيم معاملات التحفيز في كل سلسلة تنظيم: السعة عند 2 V، ودورة تشغيل 7 ms، والتردد في النطاق من 360 إلى 720 PPM.
      ملاحظة: يبدأ بروتوكول التنظيم عند 360 PPM ويزداد بمقدار 60 PPM عند كل نقطة زمنية (إطار مدرج في الشكل 2A).
    2. سجل باستمرار مقاطع فيديو لديناميكيات الرؤية الأمامية للقلب بتنسيق .avi باستخدام برنامج الحصول على صور الكاميرا (الملف التكميلي 2). قم بتسجيل فيديو لمدة 20 s لكل سلسلة تنظيم. سجل المقطع الذي مدته 20 s والذي يبدأ بعد 5 s من التنظيم. يتوفر تسجيل خام ممثل في المقطع المرئي التكميلي 1.
      ملاحظة: يقوم جهاز كمبيوتر بتسجيل سلسلة التنظيم المطبقة (.xls، الملف التكميلي 9) بالتزامن مع كل فيديو مسجل (.avi)، والتي يتم إنشاؤها بواسطة تطبيق المراقبة والتنظيم وبرنامج الحصول على صور الكاميرا، على التوالي (الملف التكميلي 2 و الملف التكميلي 3).
    3. تحقق من حيوية القلب من خلال مقارنة الفيديو الأول، الذي تم تسجيله قبل بدء بروتوكول التحفيز، مع الفيديو الثاني، الذي تم تسجيله بعد تطبيق البروتوكول (الشكل 2B).

8. تنظيف نظام تروية لانجندورف بعد التجربة

  1. قم بإزالة المحفز وأقطاب تخطيط كهربائية القلب (ECG) البلاتينية. أخرج القلب من النظام وقم بتصريف جميع محاليل Tyrode المتبقية.
  2. أوقف تشغيل النظام البصري وأغلق صمام O2.
  3. اشطف النظام باستخدام 1 L من الماء منزوع الأيونات عند 37 °C، ثم قم بتصريف النظام.
  4. كرر الخطوتين 2.4 و 2.5.
  5. أوقف تشغيل جميع الأنظمة والمعدات.

9. معالجة الفيديو

  1. ابدأ باستيراد كل مقطع فيديو إلى برنامج حاسوبي وتطبيق دالة تسوية الفيديو15.
  2. حدد منطقة الاهتمام (ROI) التي تشمل منطقة القلب. قم بإجراء تجزئة للصورة لإزالة ضوضاء الخلفية والأقطاب الكهربائية والقنية (الملف التكميلي 4).
    ملاحظة: لاختيار منطقة الصورة المراد إزالتها بشكل صحيح، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  3. أجرِ تحليلاً للديناميكا الميكانيكية العامة (الملف التكميلي 5). تظهر أمثلة التباين والإشارات الداعمة في الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2 والشكل التكميلي S3.
    1. طبق عوامل مورفولوجية على كل إطار فيديو لاكتشاف محيط القلب، ثم طبق خوارزمية ملء الإطار لإنشاء قناع15.
    2. قم بعدّ البكسلات ضمن المنطقة المجزأة في كل إطار، ثم قم بتسوية هذا العدد بقسمته على العدد الإجمالي للبكسلات في الصورة لإنتاج إشارة ديناميكية (مدرجة في الشكل 2B والشكل التكميلي S3).
    3. طبق مرشح Butterworth ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة بين 3 و 100 Hz على الإشارة التي تم الحصول عليها لكبح الضوضاء عالية التردد والآثار الناتجة عن تقطير التروية15.
    4. قم بتسوية الإشارات عبر جميع مقاطع الفيديو باستخدام القيم القصوى والدنيا المسجلة.
    5. حدد معدل ضربات القلب عن طريق حساب الفاصل الزمني بين قيمتي سعتين قصويين (IAA (s)) لكل إشارة ديناميكية ومحفزة.
    6. احسب التردد بوحدة BPM باستخدام الصيغة التالية:
      صيغة حساب التردد، Frequency(BPM)=60/IAA، المستخدمة في تحليل معدل ضربات القلب.
    7. قم بإنشاء خرائط بوانكاريه (Poincaré maps) من بيانات IAA لتوضيح التباين على المدى القصير والطويل16,17,18 (الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2).
      ملاحظة: لمزيد من المعلومات التفصيلية، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  4. أجرِ تحليلاً جزئياً للديناميكا الميكانيكية البطينية (الملف التكميلي 6).
    1. طبق ثنائية الصورة (binarization). استخدم عوامل مورفولوجية لتحديد منطقة البطين، مع ضبطها لتأخذ هندسة إهليلجية دون المساس بمنطقة الاهتمام ROI15.
    2. قم بمطابقة أصغر إهليلج مع منطقة البطين في كل إطار. استخرج إحداثيات مجموعة من النقاط الطرفية في الإطار. استخدم مجموعة من 10-20 نقطة في كل طرف على طول المحور Y (الشكل 3A). يتوفر مخرج نموذجي لتقدير الإهليلج في المقطع المرئي التكميلي 2.
    3. احسب القصر البطيني (ventricular shortening) كمتوسط المسافة بين النقاط الطرفية على طول المحور Y في كل فيديو19.
    4. طبق مرشح Butterworth ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة بين 3 و 100 Hz على الإشارة التي تم الحصول عليها لكبح الضوضاء عالية التردد والآثار الناتجة عن تقطير التروية15.
    5. قم بتسوية إشارة القصر البطيني بالنسبة لجميع مقاطع الفيديو التي تم الحصول عليها لكل عملية تنظيم ضربات القلب، واحسب معدل ضربات القلب والتأخير كما في الخطوات 9.3.5–9.3.6.
      ملاحظة: يتم الحصول على المعايير، مثل مدة الدورة البطينية (DVE)، ومدة الارتخاء (DVW)، والفاصل بين البطينين (IVV)، والسعة البطينية (VA) (الشكل 3A).
      ملاحظة: لمزيد من المعلومات التفصيلية، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 10.
  5. أجرِ تحليلاً جزئياً للديناميكا الميكانيكية للأذينين (الملف التكميلي 7).
    1. استخدم منطقتي اهتمام (ROIs) لتحديد الأذينين (الشكل 3C).
    2. حلل كل أذين على حدة.
      1. استخدم عوامل مورفولوجية لتحديد الأذينين مع ضبطهما دون المساس بمنطقة الاهتمام ROI15. استخدم خوارزمية زيادة التباين لتحديد كل أذين20,21.
      2. طبق ثنائية الصورة وقم بقياس عدد البكسلات التي تختلف عن الصفر في كل إطار للحصول على إشارة ديناميكية أذينية.
      3. طبق مرشح Butterworth ثنائي الاتجاه من الدرجة الخامسة بين 3 و 100 Hz على الإشارات التي تم الحصول عليها لكبح الضوضاء عالية التردد والآثار الناتجة عن تقطير التروية15.
      4. احسب متوسط إشارتي الأذينين (الشكل 3D).
    3. قم بتسوية إشارة القصر الأذيني بالنسبة لجميع مقاطع الفيديو التي تم الحصول عليها لكل عملية تنظيم ضربات القلب، واحسب معدل ضربات القلب والتأخير كما في الخطوات 9.3.5–9.3.6.
      ملاحظة: يتم الحصول على المعايير، مثل مدة الدورة الأذينية (DAE)، والفاصل الأذيني-الأذيني (IAT)، والسعة الأذينية (AA) (الشكل 3D). لمزيد من المعلومات التفصيلية، ارجع إلى الملف التكميلي 10.
  6. أجرِ تحليلاً كهروميكانيكياً13,22 (الملف التكميلي 8).
    1. قارن بيانات تنظيم ضربات القلب مع الإشارات الأذينية والبطينية (الشكل 3D).
    2. احسب وقت الانتشار في نظام التوصيل القلبي، مع تحديد التأخير بين الأحداث الأذينية والبطينية (AVD)، باتخاذ المحفز المطبق كمرجع.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تُجرى تجارب الوظيفة الميكانيكية القلبية باستخدام جهاز لانجندورف (Langendorff)، كما هو موضح في الشكل 1-أ (أعلى)تتيح أنظمة المراقبة والأنظمة البصرية تسجيل الفيديو عند تفعيل التحكم في الإضاءة، كما هو موضح في الشكل 1أ (أسفل). الشكل 1ج يوضح المنظر الخارجي للخزانة ذات التحكم الثرموستاتي، المصممة للحفاظ على القلب معزولاً عن التقلبات الحرارية المحيطة والضوء. وكما هو مبين في الشكل 1بيتم وضع القلب المعزول ككائن مرجعي في الإعداد التجريبي الذي يضم جهاز لانجندورف، والنظام البصري، وأنظمة التحفيز.

كما هو موضح في الشكل 2A، وُضع القلب المعزول للحصول على رؤية أمامية واضحة للأذينين والبطينين تحت التروية الرجوعية. كان استخدام قاعدة التصريف (الملف التكميلي 1، نظام التصريف) ضروريًا لتخفيف آثار الحركة الناتجة عن تقطير سائل التروية ولتثبيت الإشارات المكتسبة. تضمنت بروتوكولات التحفيز سلاسل من النبضات (2 V، 7 ms) بترددات تتراوح من 360 إلى 720 bpm، وتستغرق كل منها 30 s.

يقوم النظام البصري بتسجيل التغيرات في منطقة القلب (HA). وتسمح هذه الإشارة الديناميكية أيضاً بالحصول على الفاصل الزمني بين القمم (IAA) (المربع الداخلي في الشكل 2B). تم تقييم حيوية النموذج من خلال مقارنة متوسط معدل ضربات القلب قبل (البداية) وبعد (النهاية) بروتوكول التحفيز في مجموعة مكونة من n = 6 قلوب. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط معدلات ضربات القلب (البداية: 385 ± 38 BPM مقابل النهاية: 372 ± 18 BPM، اختبار Student’s t-test P > 0.05)، مما يشير إلى أن الإجراء التجريبي لم يؤثر على الوظيفة القلبية (الشكل 2B).

يوضح الشكل 2C استجابة تردد القلب لسبعة ترددات تحفيز مختلفة، مما يظهر علاقة خطية واضحة2 (R2 = 0.98 ± 0.01, 1:1 mode). وتتقيد قيمة التنظيم الأدنى بالخصائص الفسيولوجية للفأر (360 bpm)22,23. ويظهر القلب المتروّح بطريقة لانجيندورف (Langendorff-perfused heart) نمط تسارع ضربات القلب. وقد تم عرض محفزات التنظيم التمثيلية والاستجابات المقابلة لها في المربعات الداخلية لـ الشكل 2C.

بعد ذلك، ولتقييم ديناميكيات حجرات القلب، يتم تطبيق تقنيات تقسيم محددة. تم الحصول على معاملات تقاصر البطينين من التسجيلات الضوئية (الشكل 3A). ويوضح المربع الداخلي في الشكل 3A تقاصر البطينين المعياري. ومن هذه الإشارة الديناميكية، يتم الحصول على أربعة معاملات: سعة تقاصر البطينين (VA)، والفاصل الزمني بين انقباضات البطينين (IVV)، ومدة انقباض البطينين (DVE)، ومدة ارتخاء البطينين (DVW).

الشكل 3B يوضح سعة القصر البطيني لسبع قيم لتحفيز النبض. تمثل الأعمدة الزرقاء هذه الدراسة، بينما تعبر الأعمدة البرتقالية عن البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التسجيل الأوكسوتونية (auxotonic recording method)2. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA ذو الطريقين متبوعاً باختبار Sidak. تزداد سعة القصر البطيني (VA) بشكل ملحوظ عند قيم التحفيز الأعلى، 600 PPM و 660 PPM، حيث كانت (P < 0.05*، و P < 0.005**) على التوالي. قيمة VA (المرجع 15 مقابل 360 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 420 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 480 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 540 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 600 P < 0.005، المرجع 15 مقابل 660 P < 0.05، المرجع 15 مقابل 720 P > 0.05).

للحصول على منطقة الأذين، يتم تطبيق تقنيات تقسيم محددة (الشكل 3C). يتم تحديد منطقة اهتمام (ROI) في كل أذين. يوضح الشكل 3D متوسط إشارة الأذين وتقصير البطين. ومن هذه الإشارة الديناميكية، يتم الحصول على معيارين: سعة الأذين (AA) والفاصل الزمني بين انقباضات الأذين (IAT). ومن خلال مقارنة إشارات البطين والأذين، يتم الحصول على التأخير بين أحداث الأذين والبطين (AVD).

مخطط ونظام لانجندورف لإجراء أبحاث القلب؛ يتضمن مضخة تروية ونظاماً بصرياً.
الشكل 1. التجهيز التجريبي لقلب لانجندورف المعزول والنظام البصري المثبت في كابينة. (A) مخطط تخطيطي لنظام تروية لانجندورف الارتجاعي ذو التدفق المستمر المقترن بنظام بصري. يتضمن نظام لانجندورف (في الأعلى): (1) خزان يحتوي على محلول تايرود مؤكسج باستمرار. يتم الحفاظ على درجة حرارة سائل التروية عند 37 °C بواسطة (2) خزان حمام حراري و(5) جهاز إعادة تدوير حلزوني. (3) مضخة تروية تمعجية تضمن تدفقاً مستمراً بمعدل 3 mL/min. (8) نظام تصريف يزيل المحلول. (4) يعمل ملف التبريد كمبادل حراري ومصيدة للفقاعات في آن واحد. يتم التحكم في مراقبة الضغط وتطبيقات التحفيز الكهربائي بواسطة (6) نظام المراقبة. يتضمن النظام البصري (في الأسفل) المزامنة بين (11) التحكم في الإضاءة، و(10) الكاميرا عالية السرعة المزودة بعدسة تلسنترية، ومصدرين للضوء (LEDs). تسمح عدسة الكاميرا بالتركيز اليدوي في نطاق يتراوح بين 100–200 mm. (9) صمامان LED، مقترنان بعدسة مستوية محدبة (LI)، يضيئان القلب بشكل متجانس. يتم تسجيل بيانات التحفيز باستخدام تطبيق المراقبة والتحفيز (الملف التكميلي 11). (7) يتصل جهاز الكمبيوتر المتحكم بالكاميرا وبتطبيق المراقبة والتحفيز لتسجيل البيانات (الفيديو والتحفيز الكهربائي) بشكل متزامن. (B) عرض داخلي للكابينة. يظهر الموضع الرأسي للقلب من خلال الجسم المرجعي. وتظهر العناصر الأخرى لجهاز لانجندورف. (C) عرض خارجي للكابينة. الكابينة معزولة حرارياً، والجدران الداخلية والخارجية السوداء تقلل من الانعكاسات والضوء المحيط. يظهر الكمبيوتر الذي يشغل تطبيقات المراقبة والتقاط الفيديو. الاختصارات: LC = عدسة تلسنترية؛ LEDs = صمامات ثنائية باعثة للضوء؛ LI = عدسة إضاءة؛ PC = كمبيوتر شخصي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Heart stimulation experiment setup with ECG; response frequency chart; stimulation frequency graph.
الشكل 2تثبيت قلب الفأر والتحقق من صحة النظام البصري. (أمنظر أمامي للقلب يوضح الأذينين والبطينين والتحفيز وأقطاب تخطيط كهربائية القلب. تتوافق الصورة مع إطار عند معدل تحفيز 420 نبضة في الدقيقة.الفيديو التكميلي 1). ويظهر الشكل الداخلي عملية التنظيم المطبقة. وقد تم تصوير الفيديو في الفترة ما بين 5 و25 ثانية من بروتوكول التحفيز. (باختبار حيوية القلب. يتم تسجيل مقطعي فيديو للحصول على تردد التذبذب، أحدهما قبل تطبيق بروتوكول التحفيز والآخر بعده. ثم يُحسب تردد الاستجابة. اختبار طالب (Student's) ت- تم تطبيق الاختبار (P > 0.05). والفرق بين المجموعات ليس جوهرياً. تم عرض البيانات كقيم متوسطة ± الانحراف المعياري (ن = 6). يوضح الشكل المدرج مساحة القلب (HA) التي تم الحصول عليها من الخطوة 9.3 من البروتوكول، والتنظيم الخطي المطبق. (كربون) استجابة معدل ضربات القلب لعملية التنظيم المطبقة. تشير الأعمدة الزرقاء إلى استجابة القلب لسبع قيم للتنظيم (R2 = 0.98 ± 0.01). وتتوافق الأعمدة البرتقالية مع البيانات التي أوردها Peña-Romo2يوضح الشكل الداخلي آثار استجابة نموذجية. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (two-way ANOVA) متبوعاً باختبار سيداك (Sidak test). الفرق بين المجموعات غير دال إحصائياً (P > (0.05). تُمثَّل البيانات كقيم متوسطة ± الانحراف المعياري (n = 6). الاختصارات: ANOVA = تحليل التباين؛ BPM = نبضة في الدقيقة؛ ECG = تخطيط كهربائية القلب؛ HA = مساحة القلب؛ PPM = نبضة شريانية في الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تصوير قلبي وتحليل بياني؛ vs/RA+LA؛ مخطط السعة؛ النتائج الموحدة؛ الإعداد التجريبي.
الشكل 3. تحليل الاستجابة الميكانيكية للأذينين والبطينين. (A) تقاصر البطين. تتوافق الصورة مع إطار عند تحفيز بسرعة 420 bpm (الفيديو التكميلي 1). يسمح شكل بيضاوي أحمر بتقدير تقاصر البطين (VS) (الفيديو التكميلي 2). يُحسب VS عن طريق حساب متوسط القيم القصوى والدنيا عبر مجموعة من 10–20 خطاً على طول المحور الرئيسي (NV؛ الخطوط البرتقالية). يظهر تقاصر البطين الموحد في المربع الداخلي. يمكن الحصول على مجموعة من المعاملات: مدة التقاصر (DVE)، مدة الارتخاء (DVW)، الفاصل الزمني بين انقباضات البطين (IVV)، وسعة تقاصر البطين (VA). (B) تظهر سعة الاستجابة القلبية، VA كدالة في التحفيز. تمثل الأعمدة الزرقاء هذه الدراسة. وتتوافق الأعمدة البرتقالية مع البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التسجيل الأوكسوتونية (auxotonic)2. تم تطبيق التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعاً باختبار Sidak. تزداد سعة تقاصر البطين (VA) بشكل ملحوظ لقيم التحفيز الأعلى، 600 PPM و 660 PPM، على التوالي (P < 0.05*, P < 0.005**). VA (المرجع 15 مقابل 360 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 420 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 480 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 540 P > 0.05، المرجع 15 مقابل 600 P < 0.005، المرجع 15 مقابل 660 P < 0.05، المرجع 15 مقابل 720 P > 0.05). تُعرض البيانات كقيم متوسطة ± الانحراف المعياري (n = 6). (C) تقسيم الأذينين. تتوافق الصورة مع إطار عند تحفيز بسرعة 420 bpm (الفيديو التكميلي 1). توضح الصورة مناطق الاهتمام المطبقة على الأذين الأيمن (الدائرة الصفراء) والأذين الأيسر (الدائرة الزرقاء). يتم الحصول على الإشارة الميكانيكية الأذينية عن طريق حساب متوسط كلتا منطقتي الاهتمام (ROIs). (D) ديناميكيات الأذين والبطين. تظهر الاستجابات الموحدة لمتوسط مساحة الأذين (الخط الأسود)، وتقاصر البطين (الخط الأزرق)، والتحفيز (الخط الأحمر) عند 420 bpm. يمكن الحصول على مجموعة من المعاملات: الفاصل الزمني بين انقباضات الأذين (IAT)، متوسط السعة الأذينية (AA)، والتأخير الأذيني البطيني (AVD). الاختصارات: AA = السعة الأذينية؛ ANOVA = تحليل التباين؛ AVD = التأخير الأذيني البطيني؛ DVE = مدة تقاصر البطين؛ DVW = مدة ارتخاء البطين؛ IAT = الفاصل الأذيني الأذيني؛ IVV = الفاصل بين البطينين؛ NV = عدد خطوط البطين؛ PPM = نبضة في الدقيقة؛ ROI = منطقة الاهتمام؛ VA = سعة تقاصر البطين؛ VS = تقاصر البطين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيديو التكميلي 1. فيديو تحت تحفيز بمعدل 420 PPM. تسجيل لقلب فأر معزول تم التقاطه بدقة مكانية تبلغ 200 × 200 بكسل فرعي وبدقة زمنية تبلغ 750 fps. الاختصارات: fps = إطار في الثانية؛ PPM = نبضة في الدقيقة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 2. فيديو تمثيلي لتقدير القطع الناقص لتقصير البطين. عرض لخوارزمية التجزئة باستخدام التسجيل من الفيديو التكميلي 1، والذي تمت إعادة أخذ عيناته بمعدل 75 fps. الاختصار: fps = إطار في الثانية.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1. تحليل التباين لفترات مساحة القلب. (A) الحالة الأساسية بدون تحفيز، (B) 360 PPM، (C) 420 PPM، و(D) 480 PPM. تم حساب التباين قصير المدى وطويل المدى كنسبة تشتت بالنسبة لمتوسط البيانات، كما هو موضح بالقطع الناقص الأحمر. الاختصارات: IAA = فترة مساحة القلب؛ PPM = نبضة في الدقيقة؛ SD1 = التباين قصير المدى؛ SD2 = التباين طويل المدى.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2. تحليل التباين لفترات مساحة القلب. (A) 540 PPM، و(B) 600 PPM، و(C) 660 PPM، و(D) 720 PPM. تم حساب التباين قصير المدى وطويل المدى كقياس للتشتت بالنسبة لمتوسط البيانات، كما هو موضح بالشكل البيضاوي الأحمر. الاختصارات: IAA = فترة مساحة القلب؛ PPM = نبضة في الدقيقة؛ SD1 = التباين قصير المدى؛ SD2 = التباين طويل المدى.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3. رسم بياني زمني للإشارات المعيرة المستمدة من ديناميكيات الانقباض. كان المحفز المطبق 420 PPM (باللون الأحمر)، وتشمل الاستجابات مساحة القلب الكلية (باللون الأسود)، وقصر البطين (باللون الأزرق)، وديناميكيات مساحة الأذين (باللون الأصفر). الاختصار: PPM = نبضة في الدقيقة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملفات التكميلية 1-11. الخوارزميات والوثائق التقنية.مجلد مضغوط يحتوي على: 1) صور ومواصفات الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد. 2) أدلة تفصيلية لبرنامج التقاط الصور بالكاميرا. 3) أدلة تفصيلية لتطبيقات المراقبة والتنظيم. 4) برنامج حاسوبي لتقييس وتجزئة الفيديو (الخطوات 9.1-9.2). 5) برنامج حاسوبي لحساب الميكانيكا العامة للقلب (الخطوة 9.3). 6) برنامج حاسوبي للحساب المجزأ لميكانيكا البطين (الخطوة 9.4). 7) برنامج حاسوبي لتجزئة ميكانيكا الأذينين (الخطوة 9.5). 8) برنامج حاسوبي لحساب التأخير الأذيني البطيني (الخطوة 9.6). 9) التنظيم الكهربائي المطبق على المقطع التكميلي 1. 10) دليل تفصيلي حول تشغيل البرامج الحاسوبية (الملفات 4-7). 11) تطبيق المراقبة والتنظيم. بالإضافة إلى ذلك، هناك خمس دوال خارجية (AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare) مطلوبة لعمل البرامج الحاسوبية.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتسم قلب الفأر بحساسية شديدة للتغيرات في درجات الحرارة2,9,10,11,22. وفي هذه التجربة، تم وضع القلب المروي في وضع رأسي. وقد أدخلنا تعديلاً طفيفاً للحد من فقدان درجة حرارة سائل التروية وتقليل التداخلات الحركية في طريقة تروية لانجندورف (Langendorff perfusion method). حيث تمت إضافة مضخة إعادة تدوير إلى الأنبوب المتعرج لتقليل فقدان درجة حرارة سائل التروية عند 37 ± 0.5 °C، كما تمت إضافة قاعدة تصريف لتقليل التداخلات الحركية. علاوة على ذلك، تم استخدام كابينة معزولة حرارياً مجهزة بنظام بصري ومصدرين للضوء من نوع LED بقوة إضاءة قابلة للتعديل، موضوعين على الجانبين لإشعاع الأنسجة القلبية بشكل موحد، كما هو موضح في الشكل 1.

لبحث مدى جدوى التركيب التجريبي، أُجريت مجموعة من التجارب لتتبع التغيرات في مساحة القلب تحت ظروف تنظيم ضربات مختلفة. وتم الحصول على نطاق تزامن بين التنظيم والاستجابة الترددية للقلب، وهو ما يتوافق مع منطقة التزامن التي أوردها Peña-Romo2، والذي استخدم طريقة التسجيل auxotonic8. ويمكننا الاستنتاج بأن الإعداد التجريبي البصري كافٍ لدعم المزيد من الدراسات التجريبية حول تقصر البطين (الشكل 2).

لقد بحثنا بشكل أكبر فيما إذا كانت إشارات تقصير البطين وديناميكيات مساحة الأذين تتيح تحليل الاقتران الكهروميكانيكي للقلب. تسمح الإشارات البطينية والأذينية بتحديد مدة التأخير في الانقباض الأذيني البطيني (AVD). وعند تردد تحفيز قدره 420 PPM، تم الحصول على قيمة 53 ± 14 ms (المتوسط ± الانحراف المعياري). تتفق هذه النتيجة مع نتائج VanderBrink24، الذي سجل فترة PR قدرها 44 ± 6 ms تم قياسها بواسطة تخطيط كهربائية القلب (ECG).

تتضمن هذه الطريقة أيضاً بعض القيود؛ حيث يمكن أن تعود عدم الدقة في التأخير الأذيني البطيني مقارنة بتقنيات ECG، وسعة البطين مقارنة بالنتائج التي تم الحصول عليها من طريقة التسجيل auxotonic، كما هو موضح في الشكل 3B، إلى آثار حركية خارجية.

تساهم هذه الطريقة في تقييم القدرة التقلصية ومعدل ضربات القلب دون تأثيرات دوائية أو جهازية في قلب معزول سليم. وتوضح هذه النتائج أن النظام البصري يسمح بقياس استجابات تقاصر البطينين والأذينين في القلب، مما يبرز فائدته في دراسات عدم انتظام ضربات القلب التي تؤثر على التنسيق الأذيني البطيني أو لتقييم التأثيرات الدوائية.

توجد لهذه الطريقة أيضاً بعض القيود. أولاً، ونظراً لأنها تقريب ثنائي الأبعاد (2D)، فمن غير الممكن قياس قوة الانقباض كما هو الحال في طريقة auxotonic. كما تساهم هذه الطريقة في تقليل الشوائب الحركية الناتجة عن قطرات المحلول والتحكم في درجة حرارته. ثانياً، تؤثر الفروق بين الجنسين في نماذج الفئران بشكل كبير على صحة الأبحاث الطبية الحيوية وقابلية تكرارها وسلامتها. وتاريخياً، فضل الباحثون بشكل كبير الفئران الذكور لتجنب التباين في البيانات الناتج عن دورات الشبق لدى الإناث، وهو افتراض ثبت لاحقاً أنه غير صحيح إلى حد كبير25,26. وبناءً على نوع الدراسة، يمكن تطبيق هذا البروتوكول في الدراسات التي تشمل الفئران الذكور أو الإناث.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل منحة سكرتارية العلوم والعلوم الإنسانية والتكنولوجيا والابتكار (SECIHTI) الممولة تحت رقم LN-2025-C-23.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سرنجة 1 mLBD Plastipak302485إجراء جراحي
إبرة 20 GNIPROAH-2032قنية أبهريّة
عدسة قابلة للتعديل 25 mm بتكبير 8x-100xGenericN/Aعدسة كاميرا النظام البصري؛ أشير إليها بشكل عام كعدسة كاميرا قابلة للتعديل
إبرة 27 GBD PrecisionGlide302358إجراء جراحي
قطع دعم مصممة ثلاثية الأبعادCINVESTAVN/Aقطع دعم مخصصة مصممة ثلاثية الأبعاد
خياطة حريرية 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901قنية أبهريّة
مزود طاقة 40-ASTERENPRL-25مزود طاقة LED
حجر هواءN/AN/Aأكسجة محلول تايرود
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306محلول تايرود
D-GlucoseJ.T. Baker1916-01محلول تايرود
مضخة تصريفCINVESTAVN/Aمضخة تصريف مخصصة؛ أشير إليها بشكل عام كمضخة تصريف
عدسة مستوية محدبة، F = 25.4 mmTHORLABSLA1951-Aعدسة إضاءة النظام البصري؛ أشير إليها بشكل عام كعدسة إضاءة مستوية محدبة
حمض الأسيتيك الثلجيSigma-Aldrich695092تنظيف نظام لانجندورف
هيبارينPiSA060M91مضاد للتخثر
HEPESSigma-AldrichH3375محلول تايرود
مصابيح LED عالية الطاقةLuminiusCBT-90-G-L11-C12مصدر ضوء LED
نظام إضاءةCINVESTAVN/Aنظام إضاءة مخصص؛ أشير إليه بشكل عام كنظام إضاءة
KClCTR SCIENTIFICCTR02196محلول تايرود
برنامج LabVIEW إصدار 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aبرنامج مستخدم لتشغيل تطبيق المراقبة والتحفيز؛ أشير إليه بشكل عام كتطبيق المراقبة والتحفيز
برنامج MATLABThe MathWorksN/Aبرنامج حاسوبي لبرامج تسوية الفيديو وتقسيمه وتحليله؛ أشير إليه بشكل عام كبرنامج حاسوبي
أكسجين طبيGRUPO INFRAN/Aأكسجة محلول تايرود
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104محلول تايرود
مضخة صغيرة متغيرة التدفقCONTROL COMPANY3385مضخة تروية
طقم جراحة للفئرانKent ScientificINSMOUSEKITإجراء جراحي
NaClSigma-AldrichS5886محلول تايرود
NaH2PO4DEQDEQF290400250محلول تايرود
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108ضبط pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01بطاقة استحواذ
أقطاب بلاتينية، قطر 0.25 mmSigma-Aldrich349402أقطاب تحفيز كهربائي
مزود طاقة (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30Aمزود طاقة لإعادة التدوير
جهاز مراقبة الضغطCINVESTAVN/Aجهاز مراقبة ضغط مخصص؛ أشير إليه بشكل عام كجهاز مراقبة الضغط
محول طاقة الضغطLA BOUVETB17295جهاز مراقبة الضغط لنظام لانجندورف
كحول إيثيلي نقيSigma-Aldrich493511إيثانول لتنظيف النظام
حمام حراري لإعادة التدوير (LXC)PolyScienceL113A0412جهاز إعادة تدوير الخزان
محلول ملحيPiSA111848محلول كلوريد الصوديوم (NaCl) بتركيز 0.9%
حمام حراري لولبيCINVESTAVN/Aجهاز إعادة تدوير/حمام حراري لولبي مخصص
مجهر ستيريوN/AN/Aإجراء جراحي
إضاءة مجهر ستيريوN/AN/Aإجراء جراحي
برنامج uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/Aبرنامج استحواذ الكاميرا؛ أشير إليه بشكل عام كبرنامج استحواذ الكاميرا
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624كاميرا CMOS عالية السرعة؛ أشير إليها بشكل عام ككاميرا CMOS
زايلزينPiSA4001211مخدر
Zoletil 100Virbac83048907مخدر تيلتامين-زولازيبام؛ أشير إليه بشكل عام كمزيج مخدر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة