سير عمل حوسبي لتحديد أولويات جينات المضيف المرتبطة بالمستقلبات الميكروبية في متلازمة القولون المتهيج ذات الغلبة الإمساكية

ملخص

يدمج هذا البروتوكول بين التنبؤ بالأهداف الخاصة بالنواتج الأيضية الميكروبية، والتحليل النسخي للمخاطية المستقيمة، وتفاعلات البروتين-بروتين وإثراء المسارات، والرسو الجزيئي، ومحاكاة الديناميكيات الجزيئية، وتقدير الطاقة الحرة للارتباط باستخدام ميكانيكا الجزيئات/مساحة سطح بويسون-بولتزمان (MM-PBSA)، وذلك لإنشاء قائمة قصيرة مرتبة ومولدة للفرضيات من الجينات المضيفة المرتبطة بالنواتج الأيضية المرشحة، ومعقدات البروتين-الربيطة ذات الأولوية البنيوية للمتابعة التجريبية.

الملخص

لا يوجد مسار حوسبي موحد لتحديد أولويات الجينات المضيفة المرتبطة بمستقلبات ميكروبية ومعقدات البروتين-الربيطة بشكل منهجي من قواعد البيانات الكيميائية والجينية والتركيبية المتاحة للعموم. يصف هذا المقال سير عمل مكونًا من ثماني مراحل يستقبل مجموعة محددة من قبل المستخدم من المستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء، وينتج قائمة قصيرة مرتبة من الجينات المضيفة المرشحة المرتبطة بالمستقلبات، والمسارات البيولوجية المثرية، ومعقدات البروتين-الربيطة ذات الأولوية التركيبية للمتابعة التجريبية. يدمج هذا المسار ما يلي: (i) التنميط الكيميائي المعلوماتي للمستقلبات؛ (ii) التنبؤ بالأهداف المرشحة عبر قواعد بيانات متعددة باستخدام أداة التنبؤ بالأهداف القائمة على الربيطة وتفاعل البروتين-الكيميائي وبرنامج للرسو الجزيئي؛ (iii) تحليل التعبير الجيني التفاضلي لبيانات الترانسكريبتوم المتاحة للعموم؛ (iv) تداخل الجينات ذات التعبير التفاضلي مع الأهداف؛ (v) بناء شبكة تفاعل البروتين-البروتين وإثراء المسارات؛ (vi) الرسو الجزيئي باستخدام برنامج رسو جزيئي؛ (vii) محاكاة الديناميكا الجزيئية لمدة 200 ns باستخدام محرك ديناميكا جزيئية مع مجال قوة بروتيني مستخدم في محاكاة الديناميكا الجزيئية؛ و (viii) تقدير الطاقة الحرة للارتباط بطريقة MM-PBSA. كمثال تطبيقي، تمت معالجة تسعة مستقلبات مشتقة من ميكروبات الأمعاء أو معدلة ميكروبيًا تمثل الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، والأحماض الصفراوية، والمستقلبات المشتقة من التريبتوفان، واليوروليثين A، باستخدام مجموعة بيانات الترانسكريبتوم لغشاء المستقيم في حالات IBS-C المتاحة للعموم GSE36701. رتب سير العمل 17 جينًا فريدًا متوقعًا مرتبطًا بالمستقلبات كانت ذات تعبير تفاضلي في هذه المجموعة من البيانات. وقد حددت تحليلات الرسو، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، و MM-PBSA الأولوية التركيبية لخمسة معقدات من المستقلب-البروتين: lithocholic acid-VDR، و lithocholic acid-NR1H4/FXR، و ursodeoxycholic acid-NR1H4/FXR، و tryptamine-HTR2A (تمت محاكاته في طبقة ليبيدية مزدوجة صريحة من 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC))، و urolithin A-CASP3. صُمم هذا البروتوكول ليكون قابلاً للتكيف مع مجموعات مستقلبات أخرى، ومجموعات بيانات ترانسكريبتوم لأمراض مختلفة، وفئات أهداف متنوعة؛ وتعتبر جميع المخرجات تنبؤات حوسبية لتوليد الفرضيات تتطلب تكرارًا مستقلًا لبيانات الترانسكريبتوم، وتحققًا على مستوى البروتين، ومقايسات استجابة الربيطة الوظيفية قبل التوصل إلى استنتاجات سببية أو علاجية.

المقدمة

يُعد متلازمة القولون المتهيج المصاحب للإمساك (IBS-C) اضطرابًا وظيفيًا شائعًا في الجهاز الهضمي، يتميز بآلام متكررة في البطن، وتغير في عادات التبرز، وانتفاخ، وإمساك، حيث تُقدر نسبة انتشارها عالميًا بنحو 10–15% من عامة السكان^1,2. ويمكن للعلاجات الدوائية الحالية، بما في ذلك المحفزات الإفرازية، ومحفزات الحركة، ومضادات التشنج، أن تحسن أعراضًا فردية لدى مجموعة فرعية من المرضى؛ ومع ذلك، تظل الاستجابة للعلاج متباينة ونادرًا ما يتم تحقيق هجوع مستدام للمرض، مما يعكس البيولوجيا المرضية المعقدة ومتعددة العوامل لهذه الحالة^1,3,4. لذا، ثمة حاجة إلى فهم ميكانيكي أكثر اكتمالاً لكيفية نقل إشارات الميكروبات المعوية على مستوى المخاطية لصياغة فرضيات قابلة للاختبار لأهداف علاجية جديدة.

تساهم ميكروبات الأمعاء في الحفاظ على التوازن الداخلي للجهاز الهضمي السفلي من خلال إنتاج والتحويل الحيوي لنواتج أيض متنوعة كيميائياً، بما في ذلك الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs)، وأحماض الصفراء الثانوية، والمركبات المشتقة من التريبتوفان، ونواتج أيض البوليفينول مثل اليوروليثينات^5,6,7,8. وتتواصل هذه الجزيئات مع خلايا المضيف عبر مجموعة واسعة وغير محددة بالكامل من الأهداف الجزيئية التي تتجاوز بمراحل مستقبلات الغشاء الكلاسيكية المستشعرة لنواتج الأيض لتشمل المستقبلات النووية، والإنزيمات السيتوسولية، والبروتينات المعدلة للهيستون، وسلائف الهرمونات الببتيدية، وبروتينات الإشارات داخل الخلوية⁹. وقد تم توثيق تغيرات في تكوين المجتمع الميكروبي المعوي وملفات نواتج الأيض لدى المرضى الذين يعانون من متلازمة القولون المتهيج (IBS)، مما يوفر مبرراً بيولوجياً للبحث فيما إذا كانت جينات المضيف المرتبطة بالاستجابة لنواتج الأيض الميكروبية تعاني من اضطرابات نسخية في مخاطية المستقيم لدى المصابين بـ IBS-C¹⁰.

تم تحديد لوحة المستقلبات التسعة مسبقاً لتوفير مجموعة مدمجة ومتنوعة كيميائياً وقابلة للتفسير بيولوجياً من الجزيئات الصغيرة المشتقة من ميكروبات الأمعاء أو المعدلة بواسطتها. استند الاختيار إلى خمسة معايير: تمثيل الفئات الرئيسية للمستقلبات الميكروبية المشاركة في إشارات التواصل بين المضيف والميكروبات؛ التعرض المعروف أو المحتمل للمخاطية المعوية البعيدة؛ توافر معرفات PubChem وبنى قياسية غير غامضة؛ الحجم الجزيئي والقابلية البنيوية للتنبؤ بالأهداف القائمة على الربائط والرسو الجزيئي؛ والمنطقية المسبقة للإشارات المتعلقة بالخلايا الظهارية، أو الجهاز العصبي المناعي، أو الخلايا المعوية الصماء، أو المستقبلات النووية، أو الحركية في حالة متلازمة القولون المتهيج مع الإمساك (IBS-C). شملت اللوحة المختارة butyrate و propionate كأحماض دهنية قصيرة السلسلة (SCFAs)؛ و chenodeoxycholic acid و lithocholic acid و ursodeoxycholic acid كأحماض صفراوية؛ و tryptamine و indole-3-propionic acid و indole-3-lactic acid كمستقلبات مشتقة من التريبتوفان؛ و urolithin A كمستقلب بوليفينول مشتق من ميكروبات الأمعاء^5,6,7,8,9,10.

بحثت معظم الدراسات الحسابية والتجريبية السابقة في أزواج منفردة من المستقلب والمستقبل أو المستقلب والإنزيم بشكل منعزل، وهو نهج لا يستوعب الطبيعة الموزعة والتقاربية لإشارات المستقلبات الميكروبية عبر مسارات المضيف^9,11. ويمنح دمج عدة مراحل تحليلية قوة تصفية تعزز بعضها بعضاً، وهو ما لا يمكن لأي مرحلة مفردة توفيره بشكل مستقل. إذ يؤدي التنبؤ الحسابي بالأهداف مقابل قواعد بيانات منسقة إلى الحصول على مجموعة واسعة من البروتينات المرشحة في المضيف لكل مستقلب. ثم يعمل التقاطع مع البيانات الترانسكريبتومية ذات الصلة بالمرض على تصفية هذه المجموعة بشكل كبير، مع الاحتفاظ فقط بالمرشحين الذين تتغير نسخهم الترانسكريبتية في سياق المرض. بعد ذلك، تعمل تحليلات إثراء المسارات وشبكات التفاعل بين البروتينات على ربط قائمة المرشحين المختصرة بوحدات بيولوجية معروفة. ويوفر الالتحام الجزيئي تقييماً حسابياً أولياً لتكامل جيب الارتباط لكل معقد مرشح، كما يوفر محاكاة إضافية للديناميكا الجزيئية (MD) لمدة 200 ns مع تحليل تفكيك الطاقة الحرة للارتباط بطريقة MM-PBSA بُعداً ثيرموديناميكياً دقيقاً زمنياً لتحديد الأولويات الهيكلية، وهو أمر غير متاح من خلال درجات الالتحام وحدها. إن تنفيذ كل خطوة بشكل مستقل، دون تكامل منهجي وتصفية متسلسلة، سيؤدي إلى قوائم مرشحين واسعة جداً بحيث يصعب التعامل معها تجريبياً، وسيفشل في الكشف عن بنية المسارات التقاربية.

في سياق هذا البروتوكول بالكامل، نعني بمصطلح "الجين المرتبط بالمستقلبات" (MAG) جيناً بشرياً تم ترشيح ناتجه البروتيني كهدف جزيئي مفترض لواحد أو أكثر من المستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء بواسطة قاعدة بيانات تنبؤ حاسوبية منقحة واحدة على الأقل، ويكون النسخ الخاص به معبراً عنه بشكل تفاضلي في مجموعة البيانات النسخية ذات الصلة بالمرض والمستخدمة لتوضيح سير العمل. يتضمن هذا التعريف الإجرائي عمداً المستقبلات الغشائية بالإضافة إلى المستقبلات النووية، والإنزيمات السيتوسولية، وبروتينات الإشارة، وسلائف الهرمونات الببتيدية، وغيرها من البروتينات داخل الخلوية. لا يعد تعيين MAG دليلاً تجريبياً على أن المستقلب يرتبط، أو يشكل معقداً بروتين-لجين، أو ينشط مستقبلاً، أو يغير من وفرة البروتين، أو يسبب المرض، بل هو ترشيح مشتق حاسوبياً لتوليد الفرضيات يتطلب تحققاً تجريبياً.

يصف هذا البروتوكول سير العمل الحوسبي الكامل المكون من ثماني مراحل (الشكل 1) بتفاصيل تشغيلية كافية لتمكين التكرار المستقل، والتكييف مع لوحات استقلابية أخرى أو مجموعات بيانات مرضية، والتوسع ليشمل سياقات أخرى من التفاعل بين المضيف والميكروبات. تم تحديد نطاق سير العمل صراحةً كإطار عمل لتوليد الفرضيات وتحديد الأولويات الهيكلية، بحيث يعمل حصرياً على الموارد الهيكلية والأوميكس المتاحة علناً، ولا يستنتج تغيرات في تركيزات المستقلبات، أو حالات تنشيط المستقبلات، أو تغيرات التعبير البروتيني، أو نشاط الإشارات النهائية، أو الأهمية السريرية من المخرجات الحوسبية وحدها. نقوم هنا بتوضيح البروتوكول كمثال تطبيقي باستخدام تسعة من المستقلبات المشتقة من ميكروبات الأمعاء أو المعدلة بواسطتها، ومجموعة بيانات ترانسكريبتوم المخاطية الشرجية العامة لمرض IBS-C رقم GSE36701، وذلك بهدف تحديد MAGs وترتيب أولويات معقدات المستقلب-بروتين للمتابعة التجريبية اللاحقة.

البروتوكول

استخدم التحليل فقط بيانات ترانسكريبتومية مجهولة المصدر ومتاحة للعموم من GSE36701، بالإضافة إلى قواعد بيانات كيميائية وبروتينية وهيكلية متاحة للعموم. تم الدخول إلى قواعد البيانات هذه في الفترة ما بين يناير ومايو 2026. وأي تاريخ دخول لاحق تم توثيقه في جدول المواد المنفصل.

1. تصميم الدراسة، ومتطلبات الأجهزة والبرمجيات

1. حدد سير العمل قبل بدء التحليل. استخدم ثماني مراحل: اختيار المستقلبات، والتنبؤ بالأهداف، وتحليل التعبير التفاضلي، وتداخل الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEG) مع الأهداف، وتفاعل البروتين-بروتين (PPI)/إثراء المسارات، والالتحام الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية (MD)، وتقدير MM-PBSA.
2. سجل أن كل من الالتحام الجزيئي، والديناميكا الجزيئية (MD)، وMM-PBSA هي أدوات لتحديد الأولويات الهيكلية فقط. لا تفسر هذه المخرجات كأدلة تجريبية على الارتباط، أو تنشيط المستقبلات، أو تغير وفرة البروتين، أو الفعالية العلاجية، أو مسببات المرض.
3. تحقق من أجهزة الحوسبة قبل تشغيل محاكاة MD. استخدم نظام تشغيل Linux بمعمارية 64-bit، ووحدة معالجة مركزية (CPU) بـ 6 أنوية أو أفضل، ومنصة تسريع GPU بذاكرة VRAM تبلغ ≥8 GB، أو منصة تسريع GPU مكافئة بذاكرة VRAM تبلغ ≥8 GB، وبحد أدنى 32 GB من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM)، وما لا يقل عن 200 GB من مساحة التخزين الحرة لكل نظام MD.
4. سجل البرمجيات الأساسية: محرك ديناميكا جزيئية، وبرنامج للالتحام الجزيئي لربط المستقلبات بالبروتينات المستهدفة، وأداة لتحويل تنسيقات الملفات الكيميائية¹²، وبرنامج لتوليد الربائط ثلاثية الأبعاد، وأداة لتحضير الربائط، ومجموعة أدوات لتحضير مدخلات الالتحام، وبرنامج للالتحام الجزيئي لربط المستقلبات بالبروتينات المستهدفة، وبيئة برمجة عامة الأغراض، وبيئة حوسبة إحصائية مع إطار عمل لبرمجيات المعلوماتية الحيوية، وحزمة لتحليل التعبير الجيني التفاضلي.
5. سجل أدوات التحليل الهيكلي: أداة بناء أنظمة الغشاء القائمة على الويب، وخدمة تحديد بارامترات الربائط المتوافقة مع CHARMM، وأداة حساب طاقة الارتباط باستخدام الميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر، ومكتبة تحويل التوبولوجيا والبارامترات الجزيئية، وبرنامج تصور جزيئي ثلاثي الأبعاد، وأداة للتصور الجزيئي ومخططات التفاعل ثنائية الأبعاد لعام 2021 (راجع جدول المواد للحصول على روابط التنزيل ومعلومات الإصدار).
6. سجل المعرفات الدقيقة لحقل القوة البروتينية المستخدم في محاكاة الديناميكا الجزيئية، وCGenFF، وCHARMM-GUI، وإطار عمل R/المعلوماتية الحيوية، ومعرفات إصدار أداة حساب طاقة الارتباط باستخدام الميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر في جدول المواد/ملف البيئة. حدد المعرفات الغائبة بعبارة "غير قابلة للاسترداد"؛ ولا تقم باستنتاجها.

2. اختيار المستقلبات والتوصيف الكيميائي المعلوماتي

1. حدد مجموعة المستقلبات قبل البدء في التنبؤ بالأهداف. تشمل هذه المجموعة: butyrate (PubChem CID: 264)، وpropionate (CID: 1032)، وchenodeoxycholic acid (CID: 10133)، وlithocholic acid (CID: 9903)، وursodeoxycholic acid (CID: 31401)، وtryptamine (CID: 1150)، وindole-3-propionic acid (CID: 3744)، وindole-3-lactic acid (CID: 92904)، وurolithin A (CID: 5488186).
2. استخرج نظام إدخال السطور الجزيئية المبسط (SMILES) المعياري ومعرف PubChem CID لكل مستقلب. تحقق من المترادفات والبنى المكررة قبل التنبؤ بالأهداف. قم بتخزين المعرفات النهائية في ورقة المستقلبات الرئيسية.
3. أرسل سلاسل SMILES المعيارية إلى أداة الويب الخاصة بالتنبؤ بالخصائص الفيزيائية الكيميائية والـ ADME¹³ (راجع جدول المواد). سجل الوزن الجزيئي، ومساحة السطح القطبية الطوبولوجية (TPSA)، وقيمة consensus logP، ومانحي الروابط الهيدروجينية، ومستقبلي الروابط الهيدروجينية، والروابط القابلة للدوران، والامتصاص المعدي المعوي المتوقع، وتنبؤ P-glycoprotein، وتنبيهات Lipinski وVeber وGhose وEgan وMuegge وPAINS.
4. احتفظ بالمستقلبات التي تم التعرف على بنيتها بنجاح، والتي يبلغ وزنها الجزيئي ≤500 Da، والتي لا تظهر عليها تنبيهات PAINS. سجل أي معيار لم يتم استيفاؤه والقرار المتخذ بشأن الاحتفاظ بالمستقلب أو استبعاده.
5. حدد حالات التأين قبل التنبؤ بالأهداف والالتحام الجزيئي (docking). استخدم الكربوكسيلات منزوعة البروتون لـ butyrate وpropionate، وأشكال حمض الكربوكسيل المتعادلة للأحماض الصفراوية، والأمونيوم المبرتنت لـ tryptamine، والأشكال المتعادلة للمستقلبات المتبقية.

3. التنبؤ بالأهداف البشرية المرشحة

1. افتح برنامج التنبؤ بأهداف التفاعل بين المركبات الكيميائية والبروتينات¹⁴ (انظر جدول المواد). أدخل اسم كل مستخلص أيضي أو رقم تعريف PubChem CID، واختر Homo sapiens (معرف التصنيف: 9606)، واضبط الحد الأدنى لدرجة التفاعل المجمعة على ≥0.700.
2. أعطِ الأولوية لقنوات الأدلة التجريبية وقواعد البيانات المنسقة في برنامج التنبؤ بأهداف التفاعل بين المركبات الكيميائية والبروتينات. قم بتنزيل جدول الارتباط البروتيني الكامل لكل مستخلص أيضي.
3. افتح برنامج الإرساء الجزيئي (molecular docking)¹⁵ (انظر جدول المواد). أرسل كل سلسلة SMILES مع اختيار Homo sapiens، واحتفظ بالأهداف التي تبلغ احتمالية تفاعلها ≥0.70.
4. قم بدمج مخرجات التنبؤ بأهداف التفاعل بين المركبات الكيميائية والبروتينات ومخرجات برنامج الإرساء الجزيئي كمجموعة اتحاد لكل مستخلص أيضي. احتفظ بأي هدف يستوفي عتبة أي من قاعدتي البيانات، وقم بإزالة الإدخالات المكررة تماماً لرموز الجينات.
5. قم بتوحيد إدخالات البروتين لتتوافق مع رموز الجينات المعتمدة من لجنة تسمية جينات البشر (HGNC) باستخدام خرائط معرفات البروتين لربطها برموز الجينات الموحدة المعتمدة من HGNC أو قاعدة بيانات معلومات الجينات البشرية المتكاملة (انظر جدول المواد). قم بتسوية الأسماء المستعارة، والرموز القديمة، وتوصيفات الأشكال المتعددة للبروتين (isoforms) لتنحصر في رمز جين واحد لكل بروتين.
6. صنّف كل هدف على أنه مستقبل غشائي، أو مستقبل نووي، أو إنزيم، أو بروتين إشارات داخل خلوي، أو هرمون ببتيدي، أو بروتين مرتبط بالهرمونات، أو بروتين آخر داخل خلوي. وسجل هذه الفئة في جدول الأهداف.

4. مجموعة بيانات النسخ التحليلي وتحليل التعبير الجيني التفاضلي

1. قم بالوصول إلى GSE36701 من خلال أداة تحليل التعبير الجيني التفاضلي القائمة على الويب في NCBI^16,17 (راجع جدول المواد). دوّن أن مجموعة البيانات تتضمن بيانات التعبير عن خزعة المخاطية المستقيمة من مجموعات IBS-C، ومتلازمة القولون المتهيج السائدة بالإسهال (IBS-D)، وIBS ما بعد العدوى، ومجموعات من المتطوعين الأصحاء¹⁸.
2. ابحث في GEO و ArrayExpress عن مجموعة تحقق مستقلة. استخدم تركيبات من IBS-C، ومتلازمة القولون المتهيج السائدة بالإمساك، والمخاطية المستقيمة، والمخاطية القولونية، والخزعة، والترانسكريبتوم، والمصفوفات الدقيقة (microarray)، و RNA-seq. دوّن المستودعات، ومصطلحات البحث، وتاريخ البحث، وما إذا تم تحديد مجموعة بيانات تحقق قابلة للمقارنة.
3. قم بتشغيل أداة تحليل التعبير الجيني التفاضلي القائمة على الويب من سجل GSE36701 (راجع جدول المواد). قم بتعيين عينات IBS-C الـ 18 إلى مجموعة IBS-C، وتعيين المتطوعين الأصحاء الـ 40 إلى مجموعة التحكم، واترك عينات IBS-D و IBS ما بعد العدوى غير معينة.
4. قم بإجراء تحليل التعبير التفاضلي باستخدام إطار حزمة تحليل التعبير الجيني التفاضلي مع تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) بطريقة Benjamini-Hochberg¹⁹. قم بتنزيل جدول النتائج الكامل الذي يحتوي على معرف المسبار (probe ID)، ورمز الجين، وعنوان الجين، و logFC، و AveExpr، وإحصائية t المعدلة، وقيمة P الخام، وقيمة P المعدلة.
5. قم بدمج المسابير إلى إدخالات على مستوى الجين. استبعد المسابير التي تفتقر إلى رموز الجينات؛ واحتفظ بالمسبار الذي يحتوي على أدنى FDR للرموز المكررة؛ واستخدم القيمة المطلقة الأكبر لـ logFC كمعيار لفك الارتباط.

5. تحليل التداخل بين الأهداف والجينات المتغيرة تعبيرياً والتقييم الإحصائي

1. قم بإجراء تقاطع بين كل قائمة أهداف متوقعة خاصة بمستقلب معين وقائمة الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEG) عند مستوى FDR < 0.05. سجل الجينات المتداخلة، والمستقلب المصدر، وقيمة logFC، وقيمة P المعدلة، واتجاه التعبير.
2. دمج قوائم التداخل الخاصة بكل مستقلب في قائمة واحدة غير مكررة من الجينات المتأثرة بالمستقلبات (MAG). احسب إجمالي الأهداف المتوقعة، وعمليات التداخل الخاصة بكل مستقلب، وإجمالي جينات MAG الفريدة.
3. قم بتقييم اتساق الاتجاه على مستوى المسبار (probe) للجينات التي تحتوي على مسبارات متعددة. ضع علامة تمييز على أي جين تختلف مسباراته في اتجاه التعبير.
4. أنشئ جدول التوافق الخاص باختبار فيشر الدقيق (Fisher’s exact test) باستخدام إجمالي المدخلات المدمجة على مستوى الجين، وإجمالي جينات DEG، وإجمالي الأهداف المتوقعة الفريدة، وجينات MAG المرصودة. احسب قيمة P أحادية الذيل، ونسبة الأرجحية (odds ratio)، وفاصل الثقة 95% باستخدام تطبيق اختبار فيشر الدقيق.
5. إذا تجاوز معدل DEG في الخلفية 50%، يتم تسجيل التداخل كوصفي بدلاً من كونه إثراءً تم التحقق منه بشكل مستقل. تعامل مع التنظيم الخافض الموحد كنمط اتجاهي وصفي ما لم يتم إجراء اختبار اتجاهية منفصل.

6. تحليل شبكة التفاعل بين البروتينات وإثراء المسارات

1. قم بإرسال قائمة MAG الفريدة والكاملة إلى برنامج بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات²⁰ (راجع جدول المواد). اختر Homo sapiens واضبط الحد الأدنى لدرجة التفاعل على 0.700.
2. قم بتصدير الشبكة المدمجة الناتجة عن بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات وجدول التفاعلات الكامل. إذا أنتج التنقيب في النصوص (text-mining) طبوغرافيا كثيفة بشكل اصطناعي، قم بإلغاء تحديد التنقيب في النصوص والاحتفاظ بقنوات التجارب، والتعبير المشترك، وقواعد البيانات.
3. قم بإنشاء شبكات فرعية لفئات المستقلبات الخاصة بـ MAGs المرتبطة بـ SCFA، والمرتبطة بالأحماض الصفراوية، والمرتبطة بالتريبتامين/السيروتونين. استخدم نفس إعدادات الكائن ومستويات الثقة الخاصة ببرنامج بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات.
4. قم بتشغيل برنامج بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات مقابل موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG)²¹، وReactome²²، والعمليات البيولوجية في علم الوجود الجيني (GO Biological Process)^23,24. طبق تصحيح Benjamini–Hochberg BH FDR <0.05 وقم بتصدير جميع جداول الإثراء.

7. الالتحام الجزيئي

1. استرجع بنيات المستقبلات المحددة تجريبياً من بنك بيانات البروتينات التابع لمختبر التعاون البحثي للمعلوماتية الحيوية البنيوية RCSB PDB²⁵ (راجع جدول المواد). استخدم VDR/1DB1، وNR1H4/FXR/3DCT، وCASP3/2DKO، وHTR2A/6A93 للمعقدات الخمسة ذات الأولوية من البروتين والربيطة.
2. قم بتحضير كل مستقبل عن طريق الإبقاء على السلسلة A وإزالة الماء، والربيطات المشتركة في التبلور، والعوامل المساعدة، والأيونات، وسجلات HETATM غير البروتينية. بالنسبة لـ 6A93، قم بإزالة قطعة اندماج الليزوزيم T4 قبل تحضير المستقبل.
3. أضف ذرات الهيدروجين القطبية، وخصص شحنات Gasteiger، واحفظ كل مستقبل بصيغة PDBQT باستخدام مجموعة أدوات البنية الجزيئية. افحص حالات برتنة الهيستيدين في موقع الارتباط قبل التحويل إلى PDBQT ووثق الحالات المختارة.
4. قم بتوليد البنية ثلاثية الأبعاد لكل ربيطة في مجموعة أدوات تحويل ملفات البنية الكيميائية. قم بتقليل الطاقة باستخدام حقل القوة العام (UFF) لمدة 500 خطوة، وخصص حالة التأين عند pH 7.4، وخصص شحنات Gasteiger، واحفظ الملف بصيغة PDBQT.
5. حدد صندوق إرساء بأبعاد 25 Å x 25 Å x 25 Å يتمركز حول المركز الهندسي للربيطة المشتركة في التبلور. استخدم المراكز (10, 19, 33) لـ VDR، و(137, 31, 78) لـ FXR، و(37, 34, 32) لـ CASP3، و(12, −1, 61) لـ HTR2A.
6. قم بإجراء إرساء جزيئي لربيطات المستقلبات على البروتينات المستهدفة^26,27 بقيم exhaustiveness = 8، وseed = 42، وnum_modes = 9، وenergy_range = 3 kcal/mol. سجل أعلى قيمة لدرجة Vina وقيم جذر متوسط مربع الانحراف (RMSD) لجميع الوضعيات.
7. اختر النمط 1 (mode 1) لكل معقد ذو أولوية. قم بتوليد مخططات ثنائية الأبعاد للربيطة والبقايا باستخدام أداة تصور جزيئي وأداة مخططات تفاعل ثنائية الأبعاد، ومناظر ثلاثية الأبعاد للمستقبل والربيطة في برنامج تصور جزيئي ثلاثي الأبعاد.
8. أجرِ ضوابط إعادة الإرساء (redocking) لـ VDR/1DB1 وFXR/3DCT. يتم قبول إعداد إرساء المستقبل عندما يكون RMSD للذرات الثقيلة <2.0 Å بالنسبة للوضعية البلورية.
9. أجرِ ضوابط الإرساء المتقاطع (cross-docking) عن طريق إرساء حمض الليثوكوليك (LCA) في CASP3 والتريبتامين في VDR. قارن بين درجات الربيطات المتوافقة وغير المتوافقة وسجل الحالات التي يكون فيها فرق الدرجة <1.0 kcal/mol.

8. محاكاة الديناميكيات الجزيئية

1. قم بتوليد بارامترات الربيطة باستخدام خدمة تحديد بارامترات الربيطة المتوافقة مع CHARMM²⁸ (راجع جدول المواد). افحص جميع درجات الجزاء وقم بتمييز أي بارامتر بقيمة جزاء >50.
2. حول ملفات تدفق الربيطة إلى ملفات .itp و .prm المتوافقة مع محرك الديناميكا الجزيئية باستخدام نص تحويل توبولوجيا حقل القوة. ادمج ملفات توبولوجيا الربيطة والبروتين لكل معقد.
3. طبق إعادة تقسيم كتلة الهيدروجين باستخدام مكتبة تحويل التوبولوجيا الجزيئية والبارامترات. ولد توبولوجيات مائية باستخدام حقل القوة البروتيني المستخدم في محاكاة الديناميكا الجزيئية²⁹ ونموذج مياه صريح ثلاثي المواقع³⁰.
4. قم بإذابة المعقدات المائية في صندوق اثني عشري السطوح مع خلوص لا يقل عن 1.2 nm بين المذاب والحافة. عادل الأنظمة وأضف NaCl بتركيز 0.15 M.
5. قم ببناء نظام غشاء tryptamine-HTR2A باستخدام أداة بناء أنظمة الأغشية القائمة على الويب^31,32,33 (راجع جدول المواد). استخدم إحداثيات المستقبل المحاذية لقاعدة بيانات توجيه البروتين الغشائي³⁴ (راجع جدول المواد)، وطبقة ثنائية من POPC النقي، وطبقات مياه بسمك 22.5 Å، و NaCl بتركيز 0.15 M.
6. قم بتقليل طاقة جميع الأنظمة بطريقة الانحدار الأكثر حدة لما يصل إلى 50,000 خطوة. تأكد من التقارب عند Fmax <1000 kJmol^-1nm^-1 قبل مرحلة التوازن.
7. قم بموازنة الأنظمة المائية باستخدام مراحل مجموعة العدد الثابت من الجسيمات والحجم ودرجة الحرارة (NVT) ومجموعة العدد الثابت من الجسيمات والضغط ودرجة الحرارة (NPT). وازن نظام الغشاء باستخدام سير عمل تحضير وموازنة النظام الجزيئي متعدد المراحل المكون من ست خطوات والقائم على الويب مع تحرير القيود تدريجيًا.
8. قم بتشغيل محاكاة ديناميكا جزيئية إنتاجية لمدة 200 ns لجميع المعقدات الخمسة. استخدم خطوة زمنية قدرها 4 fs مع إعادة تقسيم كتلة الهيدروجين HMR، ومنظم حرارة V-rescale عند 310 K، ومنظم ضغط Parrinello-Rahman عند 1 bar، وكهرومغناطيسية Particle mesh Ewald (PME)³⁵، وقيود LINCS³⁶.
9. حلل المسارات النهائية باستخدام أدوات تحليل مسار الديناميكا الجزيئية. احسب RMSD للعمود الفقري، وتقلب جذر متوسط المربعات (RMSF) لـ Cα، ونصف قطر الدوران، ومساحة السطح المتاحة للمذيب (SASA)، والروابط الهيدروجينية بين البروتين والربيطة، باستخدام الـ 150 ns الأخيرة كنافذة تحليل أساسية.

9. تقدير الطاقة الحرة للارتباط بطريقة MM-PBSA

1. استخرج لقطات المسار لتحليل MM-PBSA. استخدم 2,001 إطاراً لكل معقد مائي و201 إطاراً معالجاً للنظام الفرعي HTR2A المدمج في الغشاء.
2. شغّل أداة حساب طاقة الارتباط بالميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر³⁷ باستخدام تميه Poisson-Boltzmann، وثابت عزل داخلي = 1، وثابت عزل خارجي = 80، وتميه غير قطبي قائم على SASA، ودون تصحيح الإنتروبيا. سجّل متوسط الطاقة الحرة للارتباط والانحراف المعياري.
3. أجرِ تفكيكاً لكل ثمالة لجميع المعقدات الخمسة. سجّل الثمالات المثبتة والمزعزعة التي تبلغ مساهماتها المطلقة ≥0.5 kcalmol⁻¹.

    

النتائج

الأهداف المرشحة المرتبطة بالمستقلبات

أنتجت المستقلبات التسعة مجموعات أهداف متوقعة غير متجانسة عبر برنامج للتنبؤ بأهداف التفاعل بين المواد الكيميائية والبروتينات وبرنامج للرسو الجزيئي. وقد أسفر كل من البروبيونات، والتريبتامين، والأحماض الصفراوية، واليوروليثين A عن عدة أهداف ذات صلة معروفة بنقل الإشارات في الجهاز الهضمي. وشمل مشهد الأهداف المتوقعة مستقبلات غشائية تقليدية، ومستقبلات نووية، وإنزيمات داخل خلوية، وبروتينات نقل الإشارة، وبروتينات مرتبطة بالهرمونات الببتيدية. وبناءً على ذلك، توصف النتائج اللاحقة بأنها جينات مرتبطة بالمستقلبات (MAGs) بدلاً من كونها نتائج مقتصرة على المستقبلات فقط (الجدول 1).

المقارنة المرجعية مع تفاعلات المستقلبات والبروتينات المُبلغ عنها

لمقارنة مخرجات تنبؤ الأهداف مع المعرفة التجريبية الحالية، تم تصنيف العلاقات المتنبأ بها بين المستقلبات والأهداف إلى ثلاثة مستويات من الأدلة: (i) تفاعلات مباشرة أو وثيقة على مستوى الفئة بين المستقلب والبروتين مدعومة تجريبياً، حيث تم الإبلاغ عن ارتباط المستقلب، أو مستقلب داخلي وثيق الصلة به، بالبروتين المشفر أو تنشيطه أو تثبيطه أو تنظيمه وظيفياً؛ (ii) تفاعلات مدعومة بالمسار أو فئة الهدف، حيث ينتمي الهدف المتنبأ به إلى مسار مستجيب للمستقلبات أو عائلة مستقبلات معروفة، ولكن الأدلة المباشرة على الزوج المحدد من المستقلب والبروتين محدودة؛ و(iii) ارتباطات حسابية فقط لم يتم تحديد أي تفاعل تجريبي مباشر لها في الدراسات التي تمت مراجعتها. وقد استُخدمت عملية المقارنة هذه لوضع مجموعة الجينات المرتبطة بالمستقلبات (MAGs) المتنبأ بها في سياقها، وليس للتحقق من صحتها.

أعادت العديد من التنبؤات صياغة بيولوجيا تم الإبلاغ عنها سابقاً. تم التعامل مع تنبؤ Propionate-FFAR2 على أنه مدعوم تجريبياً لأن FFAR2/GPR43 هو مستقبل نموذجي للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة. وصُنِّف تنبؤ Butyrate-HDAC3 على أنه مدعوم تجريبياً أو مدعوم فئوياً لأن butyrate يُعد مثبطاً معروفاً لإنزيم نزع أسيتيل الهستون، وكان التداخل المتوقع يشمل عضواً من عائلة HDAC. واعتُبرت التنبؤات المرتبطة بالأحماض الصفراوية والتي تشمل NR1H4/FXR وVDR مدعومة ببيولوجيا المستقبلات النووية للأحماض الصفراوية الراسخة، خاصة بالنسبة للأحماض الصفراوية الكارهة للماء مثل LCA؛ بينما فُسرت التنبؤات الخاصة بـ FXR المرتبطة بـ Ursodeoxycholic acid (UDCA) بحذر لأن UDCA يكون عموماً ربيطة FXR أضعف أو تعتمد على السياق. وصُنِّفَت التنبؤات المرتبطة بـ tryptamine لكل من HTR1B وHTR2A وHTR2B وHTR6 على أنها مدعومة بمسار السيروتونين بدلاً من كونها تفاعلات مباشرة مؤكدة خاصة بالمستقبل، لأن tryptamine هو مونوأمين مشتق من tryptophan ميكروبي، ومستقبلات السيروتونين هي منظمات راسخة للحركية والإفرازات المعدية المعوية. واعتُبر تنبؤ Urolithin A-CASP3 مدعوماً بالمسار بناءً على الروابط المنشورة بين urolithin A والاستجابات المرتبطة بـ apoptotic/caspase، ولكن ليس من خلال دليل مباشر على ارتباط CASP3. أما تنبؤات indole-3-lactic acid-KYAT1 وindole-3-propionic acid-KYAT1 فقد تم الإبقاء عليها كفرضيات حاسوبية فقط لأن الأدبيات الأوسع تدعم إشارات المضيف بواسطة مشتقات indole الميكروبية، ولكن ليس الارتباط المباشر بـ KYAT1 بواسطة هذه المستقلبات تحديداً^7,8,38,39,40.

وبناءً على ذلك، يفرق الجدول 1 بين ترشيح الأهداف الحسابي ومستوى الدعم التجريبي أو دعم المسارات المسبق. كما يوضح لكل هدف مصدر التنبؤ (تنبؤ بهدف تفاعل كيميائي-بروتيني، أو برنامج إرساء جزيئي، أو كليهما)، ودرجة التفاعل المدمجة لتنبؤ هدف التفاعل الكيميائي-البروتيني، واحتمالية برنامج الإرساء الجزيئي عندما تم تحديد الهدف بواسطة برنامج إرساء جزيئي. وتوصف الأهداف المتوقعة التي تفتقر إلى أدلة تجريبية مسبقة مباشرة بأنها جينات مرشحة مرتبطة بالمستقلبات تتطلب تحققاً مستقلاً على مستوى البروتين واستجابة الرابط.

التداخل بين الأهداف المتوقعة والجينات ذات التعبير التفاضلي في متلازمة القولون العصبي مع الإمساك (IBS-C)

أدى تقاطع قوائم الأهداف المتوقعة المدمجة والنتائج التفاضلية للتعبير الجيني إلى تحديد 17 جيناً فريداً من الجينات المتوقع ارتباطها بالنواتج الأيضية والتي أظهرت تعبيراً تفاضلياً معنوياً عند مقارنة مرضى IBS-C بالمتطوعين الأصحاء. وقد كانت جميع هذه الجينات الـ 17 منخفضة التعبير. وشملت هذه المجموعة مستقبلات غشائية ونووية (CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR) وبروتينات غير مستقبلية (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN) (الجدول 1، الشكل 2A,B).

استوفت جميع مجموعات الجينومات المجمعة (MAGs) البالغ عددها 17 مجموعة عتبة معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) التي تقل عن 0.05؛ واستوفت 16 من أصل 17 المجموعة معيار FDR الأكثر صرامة < 0.001، بينما كان الجين المتبقي (HTR1B) ذا دلالة إحصائية عند FDR < 0.05. وحقق سبعة من الأهداف الـ 17 (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, HDAC3, TBXA2R) كلاً من FDR < 0.001 وقيمة مطلقة لتغير الطي اللوغاريتمي log₂ تتجاوز 1.0 (تراوح logFC بين −1.34 و −1.10)، مما يشير إلى تثبيط قوي ومتسق لهذه المجموعة الفرعية. أما الأهداف المتبقية فقد أظهرت تثبيطاً متوسطاً ولكن ذا دلالة إحصائية (|logFC| يتراوح من 0.45 إلى 0.97). وقد تم تفسير هذا النمط الوصفي الموحد بحذر، مع مراعاة خصائص التعبير الجيني على مستوى الجينوم لمجموعة البيانات (انظر التقييم الإحصائي أدناه).

التقييم الإحصائي للتداخل في الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEG) المستهدفة

لتقييم الدلالة الإحصائية لتداخل الـ 17 جينًا بشكل رسمي، تم تطبيق اختبار فيشر الدقيق (Fisher’s exact test) أحادي الذيل، باستخدام الـ 17 جينًا مستهدفًا المتوقعة كمجموعة استعلام، وجميع الإدخالات الفريدة المدمجة للجينات البالغ عددها 18,296 والتي تم رصدها في GSE36701 كخلفية جينومية. ومن هذه الخلفية، تبين أن 17,296 جينًا (94.5%) كانت متباينة التعبير عند FDR < 0.05، مما يعكس تثبيطًا نسخياً شبه شامل في مقارنة المخاطية المستقيمة لمرضى IBS-C. وكانت جميع الجينات المستهدفة المتوقعة الـ 17 من بين الجينات متباينة التعبير (التداخل الملحوظ 17/17، 100%). وبالنظر إلى معدل التعبير المتباين في الخلفية البالغ 94.5%، فإن التداخل المتوقع لأي مجموعة مختارة عشوائياً من 17 جينًا هو 16.1 جينًا. وقد أسفر اختبار فيشر الدقيق عن قيمة p = 0.384 مع نسبة أرجحية مصححة للاستمرارية بلغت 2.03 (فاصل ثقة 95% يتراوح بين 0.12–33.73)، وهو ما لم يكن ذا دلالة إحصائية عند α = 0.05 (الشكل 3A–C).

تشير هذه النتيجة إلى أن التداخل الملحوظ بنسبة 17/17 لا يتجاوز التداخل المتوقع عن طريق الصدفة في ظل ملف التعبير الجيني على مستوى الجينوم لهذه المجموعة من البيانات. وبناءً على ذلك، تُفسَّر هذه النتائج على أنها نمط اتجاهي وصفي، حيث تم تثبيط التعبير بشكل متسق ومعنوي لجميع الأهداف الـ 17 المتوقعة في أنسجة المخاطية للمستقيم في حالات IBS-C، بدلاً من اعتبارها دليلاً على إثراء إحصائي أو تحقق مستقل مقارنة بالخلفية الجينومية. يتطلب اختبار الإثراء الرسمي التكرار في مجموعات بيانات ترانسكريبتومية ذات ملفات تعبير تفاضلي أكثر انتقائية، بحيث تصل نسبة أقل بكثير من نصف جميع الجينات إلى مستوى المعنوية. ويجب التأكيد على أن التثبيط الموحد لجميع الجينات الـ 17 المتداخلة هو ملاحظة وصفية وليس نتيجة إحصائية تم التحقق منها بشكل منفصل، لأن خلفية التعبير التفاضلي في مجموعة البيانات هذه هي نفسها مثبطة في الغالب، لذا فإن الاتجاه النزولي المشترك بين الجينات المتداخلة كان متوقعاً ولم يخضع لاختبار اتجاهية رسمي. وبالتالي، لا ينبغي تفسير هذا الاتجاه الموحد كدليل إحصائي مستقل على تنظيم منسق وخاص بالمستقلبات.

أنماط محددة للمستقلبات

سجل البروبيونات (Propionate) أكبر عدد من الجينات المتداخلة، بما في ذلك CASR وFFAR2 وGCG وGNAQ وGPHN وGPR68 وMLN وTBXA2R، مما يشير إلى احتمال مشاركة إشارات الاستجابة للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة والإشارات المرتبطة ببروتين Gq. وتداخل البوتيرات (Butyrate) مع HDAC3، وهو ما يتوافق مع بيولوجيا نزع أسيتيل الهيستون المرتبطة بالبوتيرات، رغم أن انخفاض تنظيم mRNA وحده لا يثبت تغير الاستجابة للبوتيرات. وشملت التداخلات المرتبطة بالأحماض الصفراوية المستقبلات النووية VDR وNR1H4، وكلاهما من المؤثرات المعروفة لإشارات الأحماض الصفراوية في الأمعاء^38,39. وتداخل التريبتامين (Tryptamine) مع HTR1B وHTR2A وHTR2B وHTR6، مما يشير إلى أن إشارات السيروتونين تمثل وحدة مرشحة، وهو نظام له أدوار مثبتة جيداً في الحركة والإفراز في الجهاز الهضمي⁴⁰. كما تداخل حمض الإندول-3-لاكتيك (Indole-3-lactic acid) وحمض الإندول-3-بروبيونيك (indole-3-propionic acid) مع KYAT1، وتداخل اليوروليثين أ (urolithin A) مع CASP3.

إثراء المسارات

كشف تحليل الإثراء الوظيفي للجينات الـ 17 المتداخلة عن مسارات مرتبطة بتأشير المصب للمستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCR)، وتأشير Gαq، وارتباط ربيطة GPCR، والتشابك السيروتونيني، والتفاعل بين الربائط والمستقبلات النشطة عصبياً، ونقل إشارة الكالسيوم، وتأشير cAMP، وإفراز الهرمونات الببتيدية. وتتسق هذه النتائج مع تكوين مجموعة الجينات وتدعم تماسكها البيولوجي، إلا أنها تعكس التعليق الوظيفي للجينات المقدمة بدلاً من أن تكون دليلاً مستقلاً على النشاط على مستوى المسار.

بنية شبكة التفاعل بين البروتين والبروتين

تم تفسير بناء شبكة التفاعل بين البروتينات وتحليل إثراء المسارات عبر ثلاث شبكات متكاملة. في الشبكة الشمولية المدمجة التي تضم 17 جيناً (الشبكة 1)، كان الهيكل الأكثر وضوحاً والمدعوم بالتوصيفات هو مكون إشارات GPCR/Gαq متمحور حول GNAQ، يربط GNAQ بالجينات المرتبطة بالمستقبلات، بما في ذلك TBXA2R وCASR وHTR2A وHTR2B. كما تم الاحتفاظ باتصالية محدودة لمستقبلات السيروتونين، وبشكل أبرز بين HTR2A وHTR2B، بينما ظلت العديد من الجينات الأخرى معزولة أو ضعيفة الاتصال عند عتبة الثقة المحددة. وأظهرت الشبكة الخاصة بالبروبيونات (الشبكة 2) توبولوجيا أكثر تقييداً، حيث احتفظ GNAQ بروابط مدعومة بالتوصيفات مع CASR وTBXA2R، بينما كان FFAR2 وGPR68 وGCG وGPHN وMLN معزولة أو ضعيفة الاتصال. أما شبكة التريبتامين/السيروتونين (الشبكة 3) فقد شملت HTR1B وHTR2A وHTR2B وHTR6؛ وضمن هذه المجموعة الفرعية، أظهر HTR2A وHTR2B الاتصال الرئيسي المدعوم بالتوصيفات، بينما لم يكن HTR1B وHTR6 متصلين بشكل مباشر عند العتبة المختارة (الشكل 4A–C).

الرسو الجزيئي

تم إجراء الإرساء الجزيئي على خمسة معقدات مختارة من المستقلبات والبروتينات. وأظهرت أزواج الأحماض الصفراوية والمستقبلات النووية درجات Vina أكثر ملاءمة من أزواج urolithin A-CASP3 وtryptamine-HTR2A. وسجل LCA-VDR أفضل درجة بلغت −10.0 kcal/mol، يليه LCA-NR1H4/FXR (−9.9 kcal/mol) ثم UDCA-NR1H4/FXR (−9.4 kcal/mol). أما Urolithin A-CASP3 وtryptamine-HTR2A فقد سجلتا درجات أقل ولكنها لا تزال منطقية بلغت −7.1 kcal/mol (الجدول 2).

بالنسبة لمعقد LCA-VDR (معرف PDB: 1DB1)، تم دعم الوضعية المتوقعة بواسطة رابطة هيدروجينية تقليدية بين أكسجين كربوكسيلات LCA و Ser278 (4.29 Å)، بالإضافة إلى تلامسات كارهة للماء واسعة النطاق تشمل Leu230 و Val234 و Trp286 و Val300 و His305 و Tyr295 و Leu233 و His397، وتلامسات فان دير فالس إضافية مع Met272 و Leu313 و Ile271 و Ile268 و Leu309 و Phe422 و Val418 و Ala231 و Ala303 و Cys288 و Ser275 و Phe150. وسجلت الوضعية الأعلى تصنيفاً درجة Vina بلغت −10.0 kcal/mol، وحجم تجويف قدره 2055 ų، ومركز شبكة إحداثياته (10, 19, 33) (الجدول 3، الشكل 5A,B).

بالنسبة لمعقد LCA-NR1H4/FXR (برقم PDB ID: 3DCT)، ترافقت درجة الالتحام البالغة −9.9 kcal/mol مع روابط هيدروجينية متوقعة تشمل His294 وIle335، وتفاعل π-Sigma مع His294، وتلامسات كارهة للماء من نوع Alkyl أو π-Alkyl تشمل Met290 وMet328 وAla291 وLeu287 وIle352 وHis447، مع تلامسات van der Waals إضافية تدعم استيعاب الهيكل الستيرويدي في جيب FXR (الجدول 4، الشكل 6A,B).

أظهر الوضع المتوقع لمعقد UDCA-NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT) وجود رابطة هيدروجينية تقليدية مع His447 (3.66 Å)، ورابطة هيدروجينية أخرى مع Gly322 (3.46 Å)، وتفاعل π-Anion مع Val325 (4.96 Å)، ورابطة كربون-هيدروجين مع Trp469 (4.51 Å). كما حددت خريطة التفاعل وجود تلامسات غير مواتية من نوع مانح-مانح (donor-donor) مع Arg395 (3.89 Å) و Gln396 (3.40 Å)، مما يشير إلى أن درجة Vina المنخفضة لـ UDCA مقارنة بـ LCA في جيب المستقبل نفسه قد تعود إلى هندسة موضعية أو خصائص إلكتروستاتيكية أقل ملاءمة (الجدول 5، الشكل 7A,B).

في معقد urolithin A-CASP3 (PDB ID: 2DKO)، تميز نمط الارتباط المتوقع بوجود روابط هيدروجينية تقليدية مع Gln161 (3.78 و4.19 Å)، وSer120 (3.95 Å)، وArg207 (3.05 و3.77 Å)، كما تعزز استقراره عبر تفاعلات π-Cation مع Arg207، ورابطة هيدروجينية من نوع π-Donor مع Cys163، بالإضافة إلى تلامسات π-Alkyl وvan der Waals شملت Arg64 وAla162 وHis121 وSer205 وTrp206 (الجدول 6، الشكل 8A,B).

بالنسبة لمعقد tryptamine-HTR2A (برقم PDB ID: 6A93)، تم تثبيت الوضعية المتوقعة بواسطة جسر ملحي إلكتروستاتيكي بين الأمين المبرتن لـ tryptamine و Asp155، وهو حمض الأسبارتيك المحفوظ في اللولب عبر الغشائي 3 (D3.32 وفق ترقيم Ballesteros-Weinstein) الذي يثبت الأمين المبرتن لربيطات الأمين عبر مستقبلات السيروتونين والمستقبلات ذات الصلة^41,42,43، بالإضافة إلى روابط هيدروجينية مع Thr160 و Ser159، وتلامسات أروماتية مع Phe340 و Trp336، وتفاعلات π-Alkyl مع Val156 و Ile163. كما دعمت تلامسات فان دير فالس الإضافية مع Tyr370 و Phe339 و Ser242 و Phe243 و Phe332 و Leu123 نمط الارتباط بالجيب الأرثوستيري (الجدول 7، الشكل 9A,B).

التحقق من صحة بروتوكول الإرساء

لتقييم موثوقية بروتوكول الإرساء (docking)، تم إجراء تجربتين ضابطتين متكاملتين. بالنسبة لضوابط إعادة الإرساء (positive controls)، تم استخراج الليجاندات المشتركة في البلورة من هياكل الأشعة السينية المرجعية الخاصة بها وإعادة إرسائها في مواقع الارتباط الأصلية. وقد انحرفت الوضعية المتوقعة الأعلى ترتيباً لنظير فيتامين D المسمى VDX في VDR/1DB1 بمقدار 0.87 Å عن الموضع البلوري، وانحرف الليجاند المشترك في البلورة WAY-362450 في FXR/3DCT بمقدار 1.79 Å؛ وكانت كلتا القيمتين أقل من عتبة القبول التقليدية البالغة 2.0 Å، مما يدعم الصلاحية الهندسية لبروتوكول الإرساء لأنظمة المستقبلات هذه (الشكل 10A،B). بالنسبة لضوابط الإرساء المتبادل (negative controls)، تم إرساء حمض الليثوكوليك في caspase-3 (2DKO)، وهو بروتياز سيستين لا يعد حمض الليثوكوليك ليجاندًا معروفًا له، مما أعطى درجة متوقعة (−8.3 kcal/mol) أضعف بمقدار 1.7 kcal/mol مقارنة بهدفه الأصلي VDR (−10.0 kcal/mol)، وهو ما يتفق مع انتقائية موقع الارتباط المتوقعة. أما إرساء التريبتامين في VDR فقد أعطى درجة متوقعة بلغت −6.4 kcal/mol مقارنة بـ −7.1 kcal/mol في هدفه الأصلي HTR2A، وهو فرق قدره 0.7 kcal/mol يقع ضمن نطاق عدم اليقين المبلغ عنه في درجات الإرساء الجزيئي لليجاندات المستقلبية على البروتينات المستهدفة، وبالتالي يشير فقط إلى انتقائية متوقعة متواضعة لهذا الليجاند الأصغر حجمًا (الشكل 10C). وبشكل عام، تشير هذه الضوابط إلى أن بروتوكول الإرساء يعيد إنتاج هندسة الارتباط المعروفة ويميز بين الأزواج المتوافقة وغير المتوافقة تحت الظروف المختبرة، مع بقائه مجرد تنبؤات حاسوبية لا تعوض قياسات الألفة التجريبية (الجدول 8).

محاكاة الديناميكا الجزيئية

أُجريت عمليات محاكاة الديناميكا الجزيئية للمركبات الخمس ذات الأولوية عبر مسارات إنتاج استمرت لمدة 200 ns. تمت محاكاة المركبات الأربعة الذائبة والمستقبلات النووية في مذيب مائي صريح، بينما تمت محاكاة مركب tryptamine-HTR2A في طبقة ثنائية من دهون POPC صريحة لتوفير بيئة غشائية مناسبة فسيولوجياً لهذا المستقبل المقترن ببروتين G. واختبرت التحليلات الاستقرار الديناميكي لأوضاع الإرساء تحت ظروف تعتمد على الزمن، وسمحت بمقارنة السلوك البنيوي النسبي عبر المركبات (الجدول 9).

أظهر ملف RMSD لمعقد LCA-VDR/1DB1 فترة اتزان قصيرة خلال أول 10 ns، تلاها استقرار في مستوى ثابت، مع تقلبات تراوحت بشكل أساسي بين 0.20–0.28 nm (الشكل 11A). كانت قيم RMSF منخفضة، وكانت تقلبات العمود الفقري < 0.15 nm لمعظم البقايا (الشكل 11B). وأظهر تحليل الروابط الهيدروجينية وجود شبكة مستمرة تتكون من 2–5 روابط هيدروجينية، مع زيادات عرضية تصل إلى 7 (الشكل 11C). كما ظل نصف قطر الدوران (Rg) ضمن نطاق 1.25–1.75 nm، وبقيت مساحة السطح المتاحة للمذيب (SASA) حول 130 nm² (الشكل 11D,E).

أظهر معقد urolithin A-CASP3/2DKO نشاطاً ديناميكياً أكبر. فقد زاد RMSD في البداية ثم تذبذب بين 0.4 و0.7 nm، مع حدوث واقعة انحراف عالية وجيزة عند حوالي 165 ns (الشكل 12A). وأظهر تحليل RMSF حركية عالية على مستوى البقايا، مع وجود أكبر التقلبات في منطقة الحلقة المرنة حول البقية 175 (الشكل 12B). وكشف تحليل الروابط الهيدروجينية عن شبكة واسعة أولية تتكون من حوالي 2–5 روابط خلال أول 30–40 ns، تلتها في الغالب 0 إلى 2 من الروابط المتقطعة (الشكل 12C). وتظهر ملفات نصف قطر الدوران وSASA المقابلة في الشكل 12D,E.

بالنسبة لأنظمة الأحماض الصفراوية NR1H4/FXR (3DCT)، ظل ملف RMSD للهيكل الأساسي ضمن نطاق ضيق نسبيًا خلال معظم مسار المحاكاة (الشكل 13A)، بينما أظهر ملف RMSF حركية أقل في المناطق المركزية وتقلبات أعلى في المناطق المرنة (الشكل 13B). حافظ معقد LCA-3DCT على ما يقرب من ثلاث إلى أربع روابط هيدروجينية مستمرة طوال مسار المحاكاة، بينما أظهر معقد UDCA-3DCT تقلبًا أكبر في الروابط الهيدروجينية وانخفاضًا في الترابط الهيدروجيني بعد حوالي 125 ns. تظهر ملفات نصف قطر الدوران (Radius-of-gyration) للأنظمة المرتبطة بـ LCA و UDCA في الشكل 13C،D على التوالي، وتظهر ملفات SASA المقابلة لها في الشكل 13E،F.

الديناميكيات الجزيئية لغشاء معقد التريبتامين-HTR2A

تمت محاكاة معقد tryptamine-HTR2A/6A93 لمدة 200 ns ضمن طبقة ليبيدية ثنائية صريحة من POPC تتكون من 258 جزيئاً ليبيدياً، ونموذج مياه صريح ثلاثي المواقع، و 0.15 M NaCl، ليصل الحجم الإجمالي للنظام إلى حوالي 100,925 ذرة^33,44,45. وظل المستقبل مغموراً بشكل مستقر في الطبقة الثنائية طوال مسار المحاكاة (الشكل 14). ارتفع RMSD للعمود الفقري من حوالي 0.10 nm إلى مستوى استقرار يقارب 0.15–0.20 nm خلال أول 100 ns وظل مستقراً بعد ذلك، مع بقاء جميع القيم دون 0.25 nm، مما يشير إلى أن المستقبل حافظ على تشكيل مستقر في بيئة الغشاء دون حدوث تفكك كلي (الشكل 15A). وأظهر RMSF لكل ثمالة تقلبات منخفضة في اللب الحلزوني العابر للغشاء مع حركية أعلى متوقعة في مناطق العروات والنهايات، وهو ما يتفق مع المرونة النموذجية لـ GPCR (الشكل 15B). وكان نصف قطر الدوران محصوراً بدقة بين حوالي 2.06 و 2.12 nm، وتذبذب SASA ضمن نطاق ضيق دون انزياح تدريجي، مما يؤكد كلاهما الحفاظ على الحزمة المدمجة العابرة للغشاء (الشكل 15C,D).

تم الحفاظ على الروابط الهيدروجينية بين البروتين والرابط طوال مسار المحاكاة (الشكل 15E)، مع وجود تقلبات رئيسية في عدد الروابط الهيدروجينية، تراوحت بين 1 و 3. ولتقييم استمرارية التفاعل الأيوني الرئيسي بشكل محدد، تمت مراقبة المسافة الدنيا بين نيتروجين الأمونيوم المبرتن في التريبتامين وذرات أكسجين الكربوكسيلات في Asp155 (D3.32) طوال مسار المحاكاة بالكامل. ظلت هذه المسافة موزعة بشكل ضيق حول متوسط قدره 0.270 nm (الحد الأدنى 0.247 nm، والحد الأقصى 0.424 nm)، وتم الحفاظ على تلامس الجسر الملحي (< 0.4 nm) بنسبة 99.9% من وقت المحاكاة مع حدوث رحلتين عابرتين قصيرتين فقط، ولم يحدث أي حدث تفكك مستمر (الشكل 16). تشير هذه النتائج إلى أن التفاعل الأيوني المحفوظ لـ Asp155 كان كافياً لتثبيت التريبتامين داخل الجيب الأورثوستيري لـ HTR2A طوال محاكاة الغشاء.

طاقة الربط الحرة بطريقة MM-PBSA والتحليل التفصيلي لكل ثمالة

أُجري تحليل MM-PBSA لإضافة طبقة إضافية من تحديد الأولويات الطاقية للمركبات الخمسة (الجدول 10). وبالنسبة للمركبات المائية الأربعة، حدد تحليل التفكيك لكل بقايا (per-residue decomposition) المساهمات الطاقية الرئيسية لكل نمط ارتباط متوقع. وفي معقد LCA-VDR/1DB1، كانت مساهمة الليجند وGln317 مواتية، بينما كانت مساهمة Trp286 غير مواتية. وفي معقد urolithin A-CASP3/2DKO، أظهر كل من Arg64 وArg207 مساهمات سالبة قوية لكل بقايا، مما يشير إلى استقرار قطبي أو إلكتروستاتيكي كبير؛ ومع ذلك، ظل المسار المقابل ديناميكيًا للغاية، مما يثبت أن الطاقات المواتية على مستوى البقايا وحدها لا تضمن استقرار المعقد بشكل مستدام. أما بالنسبة لأنظمة 3DCT، فقد كان ارتباط LCA مدفوعًا بشكل أساسي بـ Arg331، بينما تضمن ارتباط UDCA شبكة طاقية أكثر توزيعًا تشمل Glu326 وAsp394 وArg395 وArg441 وAsp470. وعبر الأنظمة المائية الأربعة، دعم تفكيك MM-PBSA تحديد الأولويات النسبية للمعقدات القائمة على LCA.

بالنسبة لمعقد tryptamine-HTR2A/6A93 المدمج في الغشاء، تم إجراء تحليل MM-PBSA على النظام الفرعي المكون من البروتين والرابط المستخلص من مسار الطبقة الثنائية^46,47. لُوحظت مساهمات إيجابية للرابط والحمض الأميني Asp155 (D3.32)، والذي كان المساهم المهيمن بوضوح في الاستقرار على مستوى البقايا، وهو ما يتفق مع تفاعل الجسر الملحي الذي تم تحديده في كل من تحليلات الإرساء وتحليلات المسافة في المسار. وأظهر Trp137 أكبر مساهمة غير مواتية لكل بقية من بين بقايا جيب الارتباط الأصلي المحيطة (Ser86, Phe87, Phe133, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171)، والتي تشكل معاً شبكة الاتصال العطرية والقطبية التي تبطن جيب الارتباط. تمثل هذه القيم تقديرات حسابية نسبية لتحديد الأولويات الهيكلية وليست ألفات ارتباط تجريبية.

الشكل 1: سير العمل الحوسبي لتحديد أولويات جينات المضيف المرتبطة بالمستقلبات في حالة IBS-C. تمثيل تخطيطي لسير عمل مكون من ثماني مراحل يدمج بين اختيار المستقلبات، والتنبؤ بالأهداف، والتعبير التفاضلي للنسخ، وتحليل التداخل، وإثراء الشبكة والمسارات، والالتحام الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، وتحليل الطاقة الحرة للارتباط باستخدام MM-PBSA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تحليل التعبير التفاضلي وتداخل أهداف المستقلبات في مخاطية IBS-C. (A) مخطط بركاني للتعبير التفاضلي على مستوى الجينات في GSE36701. النقاط الزرقاء تمثل الجينات التي انخفض تعبيرها بشكل ملحوظ؛ النقاط الحمراء تمثل الجينات التي ارتفع تعبيرها بشكل ملحوظ؛ النقاط الرمادية تمثل الجينات غير ذات الدلالة. تم وضع تسميات على جينات مختارة مرتبطة بالمستقلبات المتداخلة. (B) مخطط فين يوضح التداخل بين 330 هدفاً مستقلاً متوقعاً للمستقلبات والجينات التي انخفض تعبيرها في GSE36701؛ حيث تم تشارك 17 جيناً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التقييم الإحصائي لـ 17 جينًا مستهدفًا من المستقلبات المتوقعة مقابل GSE36701. (A) تغير الطي اللوغاريتمي log2 لكل جين من الجينات الـ 17، ملونة حسب مستوى الأهمية. (B) معدل التعبير التفاضلي للجينات الخلفية مقابل الأهداف المتوقعة، باستخدام اختبار فيشر الدقيق. (C) تم استخدام جدول طوارئ بمقاس اثنين في اثنين لاختبار فيشر الدقيق. كانت جميع الأهداف الـ 17 منخفضة التعبير بشكل ملحوظ؛ ويُفسر التداخل على أنه نمط اتجاهي وصفي وليس إثراءً إحصائيًا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: بناء شبكة تفاعلات بروتين-بروتين مركبة وإثراء المسارات لشبكات تفاعل البروتينات-البروتينات للجينات المتداخلة المرتبطة بالنواتج الأيضية. (A) الشبكة 1: شبكة ميتا مدمجة لجميع الجينات الـ 17. (B) الشبكة 2: شبكة خاصة بالبروبيونات تتكون من ثمانية جينات (CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R). (C) الشبكة 3: شبكة التريبتامين/السيروتونين المكونة من أربعة جينات (HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6). تم إنشاء الشبكات لـ Homo sapiens كحد أدنى، باستخدام بناء شبكة تفاعل البروتينات-البروتينات وإثراء المسارات بمستوى ثقة ≥ 0.700. تمثل الحواف الارتباط الوظيفي المدعوم بالتوصيف يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تمثيل هيكلي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد لحمض الليثوكوليك في معقد مع VDR (PDB ID: 1DB1). (A) تمثيل سطحي وكرتوني ثلاثي الأبعاد يظهر فيه حمض الليثوكوليك على شكل كرات. (B) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد توضح الرابطة الهيدروجينية لـ Ser278 والاتصالات الكارهة للماء واتصالات فان دير فال المحيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6. تمثيل بنيوي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد لحمض الليثوكوليك في معقد مع NR1H4/FXR (معرف PDB: 3DCT). (A) تمثيل سطحي وكارتوني ثلاثي الأبعاد. (B) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد توضح الروابط الهيدروجينية مع His294 و Ile335، وتفاعل π-Sigma، والاتصالات المحيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: تمثيل بنيوي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد لحمض ursodeoxycholic في معقد مع NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). (أ) تمثيل السطح والرسوم التخطيطية ثلاثية الأبعاد. (ب) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد توضح الترابط الهيدروجيني مع His447 و Gly322، وتفاعل π-Anion مع Val325، ورابطة كربون-هيدروجين مع Trp469، وتلامسات مانح-مانح غير مواتية مع Arg395 و Gln396. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: تمثيل بنيوي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد لمركب urolithin A مع CASP3 (PDB ID: 2DKO). (A) تمثيل سطحي وكارتوني ثلاثي الأبعاد. (B) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد توضح الروابط الهيدروجينية مع Gln161 و Ser120 و Arg207، وتفاعلات π-Cation مع Arg207، ورابطة هيدروجينية من نوع π-Donor مع Cys163، والتلامسات المحيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 9: تمثيل هيكلي ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد للتريبتامين في معقد مع HTR2A (PDB ID: 6A93). (A) تمثيل سطحي وكارتوني ثلاثي الأبعاد تم إنشاؤه باستخدام برنامج تصور جزيئي ثلاثي الأبعاد. (B) خريطة تفاعلات ثنائية الأبعاد تم إنشاؤها باستخدام أداة تصور جزيئي ومخطط تفاعلات ثنائي الأبعاد، توضح جسر ملحي Asp155 وتفاعلات إضافية في موقع الارتباط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 10: التحقق من صحة بروتوكول الإرساء. (A,B) إعادة إرساء الربيطات المشتركة في البلورة إلى VDR/1DB1 (RMSD 0.87 Å) و FXR/3DCT (RMSD 1.79 Å)؛ حيث تظهر الوضعيات البلورية ووضعيات إعادة الإرساء متراكبة، وكلاهما أقل من عتبة القبول البالغة 2.0 Å. (C) انتقائية الإرساء المتقاطع: درجات Vina للربيطات المتوافقة مقابل غير المتوافقة لحمض الليثوكوليك والتريبتامين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 11. تحليل مسار الديناميكا الجزيئية لمعقد LCA-VDR/1DB1 على مدى 200 ns. (أ) مخطط RMSD. (ب) مخطط RMSF. (ج) عدد الروابط الهيدروجينية. (د) مخطط نصف قطر الدوران. (هـ) مخطط SASA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 12: تحليل مسار الديناميكيات الجزيئية لمعقد urolithin A-CASP3/2DKO على مدى 200 ns. (A) مخطط RMSD يظهر تقلبات تشكيلية واسعة وحدث انحراف عالٍ عابر بالقرب من 165 ns. (B) مخطط RMSF يظهر مرونة ملحوظة على مستوى الثمالة بالقرب من الثمالة 175. (C) عدد الروابط الهيدروجينية. (D) مخطط نصف قطر الدوران (Radius-of-gyration). (E) مخطط SASA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 13: تحليل مسار الديناميكا الجزيئية لأنظمة أحماض الصفراء NR1H4/FXR (3DCT) على مدار 200 ns. (A) ملف RMSD للهيكل الأساسي لمعقد 3DCT. (B) ملف RMSF للهيكل الأساسي. (C) ملف نصف قطر الدوران لـ 3DCT-LCA. (D) ملف نصف قطر الدوران لـ 3DCT-UDCA. (E) ملف SASA لـ 3DCT-LCA. (F) ملف SASA لـ 3DCT-UDCA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 14: معقد tryptamine-HTR2A المندمج في طبقة ليبيدية ثنائية صريحة من POPC. يظهر المستقبل في شكل تخطيطي يمتد عبر الطبقة الثنائية، وتظهر ليبيدات POPC كخطوط مع إبراز مجموعات الفوسفات الرأسية، ويظهر tryptamine داخل الجيب الأرثوستيري. كما يظهر الماء فوق وتحت الغشاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 15: تحليل مسار الديناميكا الجزيئية لمعقد tryptamine-HTR2A/6A93 على مدى 200 ns في طبقة ليبيد مزدوجة صريحة من POPC. (A) مخطط RMSD للعمود الفقري. (B) مخطط RMSF لكل ثمالة. (C) مخطط نصف قطر الدوران. (D) مخطط SASA. (E) عدد الروابط الهيدروجينية بين البروتين والربيطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 16: استمرارية التفاعل الأيوني بين tryptamine و Asp155 (D3.32) على مدى مسار غشائي مدته 200 ns. يوضح الرسم البياني الحد الأدنى للمسافة بين نيتروجين الأمونيوم في tryptamine وذرات أكسجين الكربوكسيلات في Asp155 مقابل الوقت؛ ويمثل الخط المتقطع عتبة تلامس الجسر الملحي عند 0.4 nm. تم الحفاظ على التلامس بنسبة 99.9% من وقت المحاكاة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رمز الجين	المستقلب (المستقلبات) الأصلية	الفئة الوظيفية	log2FC	معدل الاكتشاف الخاطئ (القيمة الاحتمالية المعدلة)	مستوى الأهمية
الجلوكاجون	بروبيونات	البروتين المرتبط بالهورمون الببتيدي	−1.342	1.97e−7	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001 & |logFC| > 1
HDAC3	بيوتيرات	إنزيم	−1.234	2.44e−6	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001 & |logFC| > 1
CASP3	يوروليثين أ	إنزيم	−1.198	6.66e−7	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001 & |logFC| > 1
GPR68	بروبيونات	مستقبل غشائي	−1.137	4.35e−6	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001 & |logFC| > 1
GNAQ	بروبيونات	بروتين إشارات داخل الخلوية	−1.122	1.05e−6	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001 & |logFC| > 1
GPHN	بروبيونات	بروتين داخل خلوي آخر	−1.109	1.13e−6	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001 & |logFC| > 1
TBXA2R	بروبيونات	مستقبل غشائي	−1.104	4.04e−7	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001 & |logFC| > 1
HTR6	تريبتامين	مستقبل غشائي	−0.967	2.17e−5	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
مستقبل فيتامين د (VDR)	حمض الليثوكوليك	المستقبل النووي	−0.942	5.73e−7	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
HTR2A	تريبتامين	مستقبل غشائي	−0.937	4.99e−6	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
مستقبل الأحماض الدهنية الحرة 2 (FFAR2)	بروبيونات	مستقبل غشائي	−0.889	1.44e−4	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
NR1H4	حمض الليثوكوليك / حمض أورسوديوكسي كوليك	المستقبل النووي	−0.861	3.68e−6	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
HTR2B	تريبتامين	مستقبل غشائي	−0.702	1.29e−4	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
عقدة لمفاوية مساريقية	بروبيونات	بروتين مرتبط بالهرمونات الببتيدية	−0.605	7.39e−5	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
KYAT1	حمض إندول-3-لاكتيك / حمض إندول-3-بروبيونيك	إنزيم	−0.530	3.61e−4	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
مستقبل الكالسيوم المستشعر (CASR)	بروبيونات	مستقبل غشائي	−0.483	4.05e−4	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.001
HTR1B	تريبتامين	مستقبل غشائي	−0.455	3.18e−2	معدل الاكتشاف الخاطئ <0.05

الجدول 1: الجينات المستهدفة المتوقعة المرتبطة بالمستقلبات والمتداخلة مع الجينات ذات التعبير التفاضلي في مجموعة بيانات الغشاء المخاطي للمستقيم في حالات IBS-C. كانت جميع الجينات المتداخلة المدرجة ذات تعبير منخفض. تم تقديم الجدول 1 بشكل منفصل كجدول بيانات، ويوضح لكل هدف: المستقلب (أو المستقلبات) الأصلية، والفئة الوظيفية، ومصدر توقع الهدف (توقع هدف تفاعل كيميائي-بروتيني، أو برنامج إرساء جزيئي، أو كلاهما)، ودرجة التفاعل المجمعة لتوقع هدف تفاعل كيميائي-بروتيني، واحتمالية برنامج الإرساء الجزيئي، وعند توفرها، مستوى التوقع، وlog2 fold change، وFDR مع مستوى أهمية التعبير. المصدر: تم الحصول على قيم التعبير الجيني من جدول التعبير التفاضلي GSE36701 المدمج جينياً (المسبار ذو أدنى FDR لكل جين). تم تجميع مصدر توقع الهدف وقيم الثقة من مخرجات توقع هدف تفاعل كيميائي-بروتيني وبرنامج إرساء جزيئي، باستخدام عتبات درجة تفاعل مجمعة لتوقع هدف تفاعل كيميائي-بروتيني ≥ 0.700 واحتمالية برنامج إرساء جزيئي ≥ 0.70. درجات توقع هدف التفاعل الكيميائي-البروتيني هي درجات مجمعة على مقياس من 0 إلى 1؛ ويرمز STP إلى احتمالية برنامج الإرساء الجزيئي. المستوى 1 = دعم صارم لتوقع هدف تفاعل كيميائي-بروتيني؛ المستوى +1 = دعم صارم لتوقع هدف تفاعل كيميائي-بروتيني مدعوم بشكل متقاطع بواسطة برنامج إرساء جزيئي.

المعقد	البروتين (PDB ID)	الربيطة	نتيجة Vina (kcal/mol)	حجم التجويف (A^3)	مركز الشبكة X,Y,Z (A)	صندوق البحث (A)
LCA-VDR	VDR (1DB1)	حمض الليثوكوليك	−10.0	2055	10, 19, 33	25 x 25 x 25
LCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	حمض الليثوكوليك	−9.9	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
UDCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	حمض أورسوديوكسي كوليك	−9.4	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
Urolithin A-CASP3	CASP3 (2DKO)	يوروليثين أ	−7.1	233	37, 34, 32	25 x 25 x 25
Tryptamine-HTR2A	HTR2A (6A93)	تريبتامين	−7.1	3238	12, −1, 61	25 x 25 x 25

الجدول 2: نتائج الإرساء الجزيئي: درجات الإرساء الجزيئي لأفضل المرتبطات من المستقلبات مع البروتينات المستهدفة ومعلمات التجويف لخمسة معقدات بروتين-مرتبط ذات أولوية. يتم التعبير عن حجم التجويف بـ ų. المصدر: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx، ورقة 'Original_Docking_Scores'. الإرساء الجزيئي للمرتبطات من المستقلبات مع البروتينات المستهدفة؛ exhaustiveness = 8، seed = 42 (ثابت)، num_modes = 9 لجميع المعقدات؛ تم تسجيل الوضعية الأعلى تصنيفاً (mode 1).

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (أ)	ملاحظات
رابطة هيدروجينية تقليدية	Ser278	4.29	أكسجين الكربوكسيلات في حمض اللينوليك (LCA)
تلامس كاره للماء / بي-ألكيل (Pi-Alkyl)	Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397	-
تلامس فان دير فالس	Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150	-

الجدول 3: أنماط الارتباط الناتجة عن إرساء حمض الليثوكوليك مع VDR (PDB ID: 1DB1). المصدر: أداة التصور الجزيئي ومخطط التفاعل ثنائي الأبعاد، مخططات التفاعل ثنائية الأبعاد بين اللجند والبقايا، كما ورد في نتائج المخطوطة (الإرساء الجزيئي). تشير العلامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم يتم ذكرها بشكل فردي لهذا التلامس.

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (A)	ملاحظات
رابطة هيدروجينية	His294	-
رابطة هيدروجينية	Ile335	-
تفاعل Pi-Sigma	His294	-
تفاعل ألكيلي / Pi-ألكيلي (كاره للماء)	Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447	-
تلامس فان دير فال	ثمالات جيب إضافية (غير محددة بشكل فردي في المصدر)	-	يدعم استيعاب الهيكل الستيرويدي

الجدول 4: أنماط الارتباط الناتجة عن إرساء حمض الليثوكوليك مع NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT).

المصدر: أداة التصور الجزيئي ومخطط التفاعلات ثنائي الأبعاد؛ مخططات تفاعل الربيطة مع البقايا ثنائية الأبعاد، كما ورد في قسم النتائج (الرسو الجزيئي) في المخطوطة. تشير العلامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم يتم تسجيلها بشكل فردي لهذا التماس.

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (A)	ملاحظات
رابطة هيدروجينية تقليدية	His447	3.66
رابطة هيدروجينية	Gly322	3.46
تفاعل Pi-Anion	Val325	4.96
رابطة كربون-هيدروجين	Trp469	4.51
تلامس مانح-مانح غير مواتٍ	Arg395	3.89
تلامس مانح-مانح غير مواتٍ	Gln396	3.40

الجدول 5: أنماط الارتباط الناتجة عن عملية إرساء حمض ursodeoxycholic مع NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). المصدر: أداة التصوير الجزيئي ومخططات التفاعل ثنائية الأبعاد، وفقًا لما ورد في قسم النتائج (الإرساء الجزيئي) في المخطوطة. تشير العلامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم يتم الإبلاغ عنها بشكل فردي لهذا التلامس.

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (أ)	ملاحظات
الرابطة الهيدروجينية التقليدية	Gln161	3.78
الرابطة الهيدروجينية التقليدية	Gln161	4.19	الاتصال الثاني
الرابطة الهيدروجينية التقليدية	Ser120	3.95
الرابطة الهيدروجينية التقليدية	أرجينين 207	3.05
رابطة هيدروجينية تقليدية	Arg207	3.77	التواصل الثاني
التفاعل بين كاتيونات ومجموعات باي (Pi-Cation interaction)	Arg207	-
رابطة هيدروجينية مانحة لـ باي	Cys163	-
تلامس باي-ألكيل / فان دير فالس	Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206	-

الجدول 6: أنماط الارتباط الناتجة عن عملية إرساء urolithin A مع CASP3 (PDB ID: 2DKO). المصدر: أداة التصوير الجزيئي ومخطط التفاعل ثنائي الأبعاد لمخططات التفاعل ثنائية الأبعاد بين الربيطة والبقايا، كما ورد في نتائج المخطوطة (الإرساء الجزيئي). تشير العلامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم يتم تسجيلها بشكل فردي لهذا التلامس.

نوع التفاعل	الثمالة (الثمالات)	المسافة (أ)	ملاحظات
جسر ملحي إلكتروستاتيكي	Asp155 (D3.32)	-	الأمين المبرتِن للتريبتامين
رابطة هيدروجينية	Thr160	-
الرابطة الهيدروجينية	Ser159	-
تلامس أروماتي	Phe340, Trp336	-
تفاعل باي-ألكيل (Pi-Alkyl interaction)	Val156, Ile163	-
تلامس فان دير فالس	Tyr370، Phe339، Ser242، Phe243، Phe332، Leu123	-

الجدول 7: أنماط الارتباط الناتجة عن إرساء tryptamine مع HTR2A (PDB ID: 6A93). المصدر: أداة التصور الجزيئي ومخطط التفاعل ثنائي الأبعاد، مخططات التفاعل ثنائية الأبعاد بين الربيطة والبقايا، كما ورد في قسم النتائج (الإرساء الجزيئي) في المخطوطة. تشير العلامة '-' إلى أن قيمة المسافة لم يتم الإبلاغ عنها بشكل فردي لهذا التلامس.

(A) التحقق من إعادة الإرساء (الضوابط الإيجابية)
معرف PDB	البروتين	الرابط المشترك في البلورة	درجة Vina (kcal/mol)	RMSD (A)	العتبة (A)	النتيجة
1DB1	VDR	VDX (نظير فيتامين D)	−13.0	0.87	2.0	ناجح
3DCT	FXR	WAY-362450 (064)	−11.9	1.79	2.0	ناجح
(B) التحقق من الإرساء المتبادل (الضوابط السلبية)
الرابط	الهدف المتوافق (PDB)	درجة التوافق (kcal/mol)	الهدف غير المتوافق (PDB)	درجة عدم التوافق (kcal/mol)	دلتا (kcal/mol)	الانتقائية
حمض الليثوكوليك	VDR (1DB1)	−10.0	CASP3 (2DKO)	−8.3	1.7	مؤكدة
تريبتامين	HTR2A (6A93)	−7.1	VDR (1DB1)	−6.4	0.7	متوسطة (ضمن نطاق عدم يقين Vina +/−0.5–1.0)

الجدول 8: نتائج التحقق من صحة بروتوكول الإرساء: قيم RMSD لإعادة الإرساء (ضوابط إيجابية) ودرجات الإرساء المتقاطع (ضوابط سلبية).المصدر: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx و Docking_Validation/Logs/*.log (إرساء جزيئي لربيطات المستقلبات على البروتينات المستهدفة، exhaustiveness = 8, seed = 42, صندوق بأبعاد 25 Å × 25 Å × 25 Å). تم حساب RMSD عن طريق مطابقة اسم الذرة والذرة الثقيلة (بدون تراكب).

المعقد	RMSD (nm)، المتوسط + / – SD (المدى)	Rg (nm)، المتوسط + / – SD (المدى)	SASA (nm^2)، المتوسط + / – SD (المدى)	الروابط الهيدروجينية، المتوسط + / – SD (المدى)	RMSF (nm)، المتوسط (الحد الأقصى)
LCA-VDR/1DB1	0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296)	1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919)	130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4)	1.9 + / − 0.9 (0–7)	0.093 (الحد الأقصى 0.600 عند الثمالة 120)
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849)	129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1)	3.8 + / − 0.7 (1–6)	0.113 (الحد الأقصى 0.298)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921)	131.0 + / −3.4 (121.6–143.5)	1.1 + / − 1.1 (0–5)	0.113 (الحد الأقصى 0.298)
Urolithin A-CASP3/2DKO	0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755)	1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984)	134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4)	0.6 + / − 0.7 (0–3)	1.172 (الحد الأقصى 2.532 عند الثمالة 175)
Tryptamine-HTR2A/6A93 (غشاء)	0.177 + / –0.017 (0.131–0.227)	2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116)	165.1 + / − 2.7 (156.–172.7)	1.7 + / − 0.7 (0–4)	0.090 (الحد الأقصى 0.319)

الجدول 9: ملخص لسلوك محاكاة الديناميكا الجزيئية لمدة 200 ns لخمسة معقدات بروتين-ربيطة ذات أولوية، بما في ذلك نظام tryptamine-HTR2A المدمج في الغشاء.المصدر: ملفات أدوات تحليل مسار الديناميكا الجزيئية (.xvg) — gmx rms، وgmx gyrate، وgmx sasa، وgmx hbond، وgmx rmsf — المحسوبة على مدار الـ 150 ns الأخيرة (50–200 ns) من كل تشغيل إنتاجي لمدة 200 ns، وفقاً للخطوة 8.8 من البروتوكول. تم مطابقة RMSD/Rg مع الهيكل الأساسي؛ نصف قطر مسبار SASA هو 0.14 nm؛ وقطع المانح-المستقبل للرابطة الهيدروجينية 0.35 nm / 30 °. يتشارك LCA-3DCT وUDCA-3DCT مسار هيكل بروتيني واحد (RMSD، RMSF) مع قيم Rg/SASA/H-bonds خاصة بكل ربيطة.

Tryptamine-HTR2A/6A93 (الغشاء) — تفكيك كمي لكل ثمالة
الثمالة	إجمالي مساهمة ddG (kcal/mol)، المتوسط + / − الانحراف المعياري	الاتجاه
Asp155 (D3.32)	−89.94 + / − 6.81	مثبّت (مهيمن)
Tryptamine (الربيطة)	−13.01 + / − 6.22	مثبّت
Tyr171	13.62 + / − 4.54	مزعزع للاستقرار
Val167	23.32 + / − 3.96	مزعزع للاستقرار
Val156	20.03 + / − 3.81	مزعزع للاستقرار
Thr160	4.86 + / − 3.64	مزعزع للاستقرار
Ser159	24.16 + / − 3.48	مزعزع للاستقرار
Ser86	24.48 + / − 3.65	مزعزع للاستقرار
Phe87	35.18 + / − 4.04	مزعزع للاستقرار
Phe133	32.80 + / −3.70	مزعزع للاستقرار
Phe140	30.63 + / − 3.84	مزعزع للاستقرار
Phe141	35.25 + / − 3.55	مزعزع للاستقرار
Ile163	27.64 + / − 3.71	مزعزع للاستقرار
Trp137	53.77 + / − 4.32	مزعزع للاستقرار (أكبر تأثير غير ملائم)
المعقدات الأربعة الأخرى — الثمالات المحددة في التفكيك لكل ثمالة (نوعي)
المعقد	الثمالة	الاتجاه
LCA-VDR/1DB1	الربيطة (LCA)	ملائم
LCA-VDR/1DB1	Gln317	ملائم
LCA-VDR/1DB1	Trp286	غير ملائم
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg331	ملائم (مهيمن)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Glu326	شبكة مختلطة/موزعة
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp394	شبكة مختلطة/موزعة
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg395	شبكة مختلطة/موزعة
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg441	شبكة مختلطة/موزعة
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp470	شبكة مختلطة/موزعة
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg64	ملائم بقوة (قطبي/إلكتروستاتيكي)
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg207	ملائم بقوة (قطبي/إلكتروستاتيكي)

الجدول 10: تحليل MM-PBSA لكل ثمالة ملخص قصير: الثمالات المثبتة والمزعزعة (مساهمة مطلقة ≥ 0.5 kcal mol⁻¹) لكل من معقدات البروتين-الربيطة الخمس ذات الأولوية، بما في ذلك نظام tryptamine-HTR2A المدمج في الغشاء.المصدر: Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat (أداة حساب طاقة الارتباط للميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر تحليل Generalized Born (GB) لكل ثمالة، 'Complex: Total Energy Decomposition'). تم تحويل أرقام الثمالات من الترقيم الداخلي للنظام المبني بواسطة CHARMM-GUI (إزاحة +68) إلى ترقيم PDB الأصلي لـ 6A93 المستخدم في مواضع أخرى من هذه المخطوطة.

المصدر: بيانات محاكاة الديناميكا الجزيئية السابقة/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg ونتائج المخطوطة (طاقة الارتباط الحرة بطريقة MM-PBSA والتحلل لكل ثمالة). لا توجد لهذه المعقدات الأربعة مخرجات رقمية بتنسيق .dat/.csv لكل ثمالة في دليل المشروع (توجد فقط مخططات SVG مُصيرة بنصوص مسارات شعاعية غير قابلة للاستخراج آلياً)؛ وقد تم الإبلاغ فقط عن هوية الثمالة والاتجاه المفضل/غير المفضل، كما ورد في نص المخطوطة. إن المساهمات الدقيقة بوحدة kcal/mol لهذه المعقدات الأربعة غير متوفرة في المستودع المصدر.

المناقشة

توضح هذه الدراسة الحسابية الاستكشافية سير عمل متكامل وقابل للتكرار لتحديد أولويات الجينات المضيفة المرتبطة بالمستقلبات الميكروبية ومعقدات البروتين-الربيطة، والتي طُبقت هنا على مجموعة بيانات ترانسكريبتومية عامة للغشاء المخاطي المستقيم لمرضى متلازمة القولون المتهيج المصحوب بإمساك (IBS-C). وباستخدام سير العمل هذا، تداخلت مجموعة فرعية من الجينات المتوقعة المرتبطة بالمستقلبات الميكروبية مع جينات تم خفض تعبيرها بشكل مستمر في مجموعة البيانات، حيث تجمعت ضمن مسارات GPCR، والمسارات السيروتونينية، وإشارات الكالسيوم، ومستقبلات الربيطات النشطة عصبيًا، والمسارات المرتبطة بالمستقبلات النووية، وهي أنظمة يزداد تورطها في التواصل بين الميكروبات والمضيف^48,49. ويجب تفسير هذه النتائج بدقة على أنها مولدة للفرضيات فقط؛ حيث أن التحليل لا يقيس تركيزات المستقلبات الميكروبية، أو وفرة بروتين المستقبلات، أو ارتباط الربيطة، أو تنشيط المستقبلات، أو إشارات المصب، أو الحركية، أو الإفراز، أو استجابات الألم، أو النتائج السريرية. وأقوى استنتاج يمكن دعمه هو أن الجينات والمسارات المحددة هي مرشحة للتحقق التجريبي وليست آليات مرضية مؤكدة.

تكمن الأهمية البالغة لهذا البروتوكول، مقارنة بالأعمال السابقة التي درست أزواج المستقلب-المستقبل بشكل منفرد، في دمجه للتنبؤ بالأهداف، والترانسكريبتوميات العامة، وتحليل الشبكات، والارتباط الجزيئي مع ضوابط التحقق، والديناميكيات الجزيئية، وMM-PBSA ضمن مسار تسلسلي واحد لتحديد الأولويات. حيث تعمل كل مرحلة على تضييق وسياق مجموعة المرشحين الناتجة عن المرحلة السابقة، وهذا الترشيح التسلسلي هو ما يجعل قائمة المرشحين النهائية قابلة للتنفيذ تجريبياً. وتعتبر وحدة GPCR المتمحورة حول GNAQ والوحدة المرتبطة بمستقبل السيروتونين المحددة هنا منطقية بيولوجياً بالنظر إلى دور إشارات Gq في تنشيط phospholipase C، وإنتاج inositol 1,4,5-trisphosphate، وتعبئة الكالسيوم، والإفراز، والوظيفة المعوية الصماوية، والأدوار الراسخة لإشارات الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة والتربتوفان في التوازن المخاطي، وإشارات السيروتونين في الحركية المعدية المعوية، والإفراز، والحساسية الحشوية، والتواصل بين الأمعاء والدماغ^10,18,50,51.

تتمثل إحدى السمات المنهجية الرئيسية لهذه الدراسة في التعامل مع المستقبل HTR2A المدمج في الغشاء. ونظراً لأن محاكاة الطور الذائب لا يمكنها إعادة إنتاج البيئة الدهنية التي تحكم السلوك التشكيلي للمستقبل المقترن ببروتين G، فقد تمت محاكاة معقد tryptamine-HTR2A في طبقة ثنائية صريحة من POPC. وفي هذه البيئة الغشائية، ظل المستقبل مستقراً هيكلياً على مدار مسار المحاكاة الكامل الذي استمر لمدة 200 ns، كما تم الحفاظ على الجسر الملحي بين أمونيوم tryptamine و Asp155 (D3.32) طوال فترة المحاكاة تقريباً. إن التقاء ثلاثة أدلة مستقلة -وضعية الارتباط (docking pose)، ومسافة التلامس المستمرة عبر مسار المحاكاة، ومساهمة MM-PBSA السائدة لكل ثمالة- حول التفاعل المحفوظ نفسه لـ D3.32 يمنح اتساقاً داخلياً لنمط ارتباط tryptamine المتوقع، والذي يعيد إنتاج هندسة الارتباط النموذجية للربيطات الأمينية في مستقبلات السيروتونين.

هناك بعض المسائل المنهجية التي يجب مراعاتها عند إعادة إنتاج سير العمل هذا. إن الأخطاء في البنية القانونية أو المركبات التي تسبب تداخلاً في الاختبارات العامة ((PAINS)- flagged compounds) تنتقل عبر التنبؤ بالأهداف والرسو الجزيئي، مما يتطلب اختياراً دقيقاً للمستقلبات وتنسيقاً كيميومعلوماتياً. يجب تقليل مجموعات الأهداف المدفوعة بالضجيج من خلال تطبيق معايير الثقة باستمرار (التنبؤ بأهداف التفاعل بين الكيميائيات والبروتينات: ≥0.700؛ برنامج الرسو الجزيئي: ≥0.70؛ بناء شبكة التفاعلات بين البروتينات وإثراء المسارات: ≥0.700). وينبغي تجميع الأهداف المتوقعة حسب الفئة الوظيفية لتجنب التوصيف الخاطئ لجميع الجينات المرتبطة بالمستقلبات على أنها مستقبلات. ويُعد المعالجة المسبقة الدقيقة لبنى PDB، وتقليل طاقة الرابطة، ووضع الشبكة حول بقايا الربط المعروفة جوانب أساسية في عملية الرسو، كما توفر ضوابط إعادة الرسو والرسو المتقاطع المقدمة هنا مقياساً موضوعياً لصحة منهجية الرسو. ويتم تحديد نطاق إمكانية التكرار في الديناميكيات الجزيئية من خلال مزيج من تحديد معاملات حقل القوة، والترطيب المناسب أو بناء الغشاء، والتوازن المتدرج، وأخذ عينات الإنتاج الكافية.

تشمل التعديلات المعتادة وخطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها تخفيف العتبات إذا لم تسفر التنبؤات المستهدفة عن أي نتائج، والتحقق من الاتساق الاتجاهي على مستوى المسبار للجينات التي تحتوي على مسبارات متعددة، وتفسير عقد بناء شبكة التفاعل بين البروتينات وإثراء المسارات المعزولة على أنها تعتمد على العتبة بدلاً من اعتبارها غير ذات صلة بيولوجياً. بالنسبة لمستقبلات الغشاء، يجب استخدام محاكاة صريحة لطبقة الليبيد الثنائية بدلاً من المحاكاة المائية، كما هو موضح في طريقة HTR2A الموصوفة هنا. وعندما يكون تحليل تفكيك الطاقة لكل بقايا ضرورياً، يجب إجراء الحساب باستخدام محرك قادر على التفكيك، كما يجب مطابقة ترقيم البقايا المُبلغ عنه مع ترقيم المستقبل الأصلي لتجنب الغموض. ونقترح التعامل مع نتائج إثراء المسارات كسياق تنظيمي لقائمة المرشحين بدلاً من اعتبارها تحققاً على مستوى المسار. ومن الناحية الميكانيكية، سيحدث إثراء لمصطلحات GPCR، أو السيروتونينية، أو إشارات الكالسيوم كلما احتوت قائمة الجينات على جينات متعددة لمستقبلات السيروتونين، بغض النظر عن التنظيم المشترك على مستوى البروتين. كما يجب تفسير قيم RMSD و Rg و RMSF لنظام HTR2A المدمج في الغشاء مع مراعاة طبقة الليبيد الثنائية؛ حيث قد يعكس انخفاض Rg في المسار اللاحق تكيفاً تشكيلياً لحزمة عبر الغشائية مدفوعاً بالطبقة الثنائية بدلاً من الانكشاف العالمي، ويجب تفسير الروابط الهيدروجينية المستمرة بين الليجاند والبروتين جنباً إلى جنب مع استقرار RMSD العام.

إن القيود التي شابت هذه الدراسة كبيرة وتحد من عملية التفسير. فقد استند البحث إلى مجموعة بيانات عامة واحدة صغيرة نسبيًا، ولم يسفر البحث في المستودعات العامة الرئيسية للترانسكريبتوم (أداة تحليل التعبير الجيني التفاضلي القائمة على الويب وArrayExpress) عن تحديد مجموعة بيانات مستقلة لترانسكريبتوم المخاطية المستقيمة لمرضى IBS-C ذات تصميم ومنصة مماثلة يمكن أن تكون بمثابة مجموعة تكرارية وقت التحليل. ويُعد غياب التكرار الترانسكريبتومي المستقل قيداً رئيسياً، ولا ينبغي تفسير أي عبارة في هذه المخطوطة على أنها تحقق خارجي لنتائج مجموعة البيانات الواحدة. تُظهر مجموعة البيانات تعبيراً تفاضلياً شبه شامل (حوالي 94.5% من الجينات ذات دلالة، والغالبية العظمى منها مثبطة)، وهي خاصية تجعل إحصائيات الإثراء التقليدية غير مفيدة وتمنع استخلاص استنتاجات حول خصوصية تثبيط الجينات المستهدفة مقارنة بالخلفية الجينومية؛ وبناءً على ذلك، تم الإبلاغ عن التداخل كنمط اتجاهي وصفي بدلاً من إثراء إحصائي. كما أن تحليلات الترانسكريبتوم للمخاطية الكلية (Bulk mucosal transcriptomics) لا يمكنها التمييز بين التنظيم الجيني الفعلي والتغيرات في التكوين الخلوي. ولا يحدد تعبير mRNA وفرة البروتين أو الاستجابة الوظيفية. وتعاني قواعد بيانات التنبؤ بالأهداف من تحيز التوصيف، كما تعتمد نتائج docking وMD وMM-PBSA على اختيار حقل القوة، ومعايير الربيطة (ligand parameterization)، والموضع الابتدائي، ووقت المحاكاة، وكفاية أخذ العينات. إن المعرفات الدقيقة للإصدارات/البناء لبعض مكونات خادم الويب والحزم، بما في ذلك خدمة معايير الربيطة المتوافقة مع CHARMM، وCHARMM-GUI، وبيئة الحوسبة الإحصائية

لم يكن من الممكن استعادة إصدارات بناء الحزم، والإصدارات الفرعية لأداة حساب طاقة الارتباط بالميكانيكا الجزيئية/المذيب المستمر بشكل كامل من سجل المشروع المؤرشف، ويجب الإبلاغ عنها على أنها متوفرة في جدول المواد المنفصل. وتعتبر قيم MM-PBSA تقديرات نسبية، ولا تحتوي على حد صريح لإنتروبيا التشكيل، ولا ينبغي تفسيرها على أنها ألفات تجريبية. تفتقر الدراسة إلى البيانات الميتابولومية، ولا يمكنها تحديد ما إذا كانت وفرة الربيطة تتغير في حالات IBS-C، أو ما إذا كانت تغيرات التعبير الملاحظة هي مسببات، أو نتائج، أو استجابات تعويضية، أو ارتباطات غير ذات صلة.

يجب أن تشمل التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة تكرار النسخ الترانسكريبتومي بشكل مستقل، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، والتحقق من مستوى البروتين، وتحديد موقع النوع الخلوي عن طريق الترانسكريبتوميات أحادية الخلية أو الترانسكريبتوميات المكانية، والتنميط الميتابولومي لفئات المستقلبات ذات الصلة، ومقايسات استجابة الربيطة الوظيفية في الكولونيدات المشتقة من المرضى، أو المستأصلات المخاطية، أو النماذج المماثلة. ومن شأن إجراء مقارنات مع مجموعات مرضى متلازمة القولون المتهيج ذات الغلبة الإسهالية، ومتلازمة القولون المتهيج المختلطة، ومرض الأمعاء الالتهابي، ومجموعات الإمساك غير المرتبط بمتلازمة القولون المتهيج^1,2 أن تساعد في تحديد خصوصية المرض. أما بالنسبة للمكون الهيكلي، فإن تكرار مسارات الديناميكا الجزيئية (MD)، وإجراء تحليلات الحساسية باستخدام وضعيات بداية بديلة، والتوثيق الكامل لإيداع الطوبولوجيا، والمسارات، وملفات مدخلات ومخرجات MM-PBSA، من شأنه أن يعزز قابلية إعادة الإنتاج بشكل أكبر. وتظل مقايسات استجابة الربيطة التجريبية ضرورية لتحديد ما إذا كانت المعقدات ذات الأولوية ذات صلة وظيفية؛ حيث لا تدعم النتائج الحالية أي ادعاءات سريرية أو علاجية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
AutoDock Vina	مؤسسة سكريبس للأبحاث / مفتوح المصدر	v1.2.7؛ https://vina.scripps.edu/	الالتحام الجزيئي لربيطات المستقلبات بالبروتينات المستهدفة.
CGenFF/ParamChem	SilcsBio / جامعة ميريلاند	v4.6؛ https://cgenff.com/	توصيف معاملات حقل القوة للّجين في المحاكاة الديناميكية الجزيئية.
حقل القوة CHARMM36m	مطورو CHARMM / مفتوح المصدر	CHARMM36m؛ https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/	حقل القوة البروتيني المستخدم في محاكاة الديناميكيات الجزيئية.
أداة بناء الغشاء CHARMM-GUI	CHARMM-GUI / جامعة ليهاي	خادم ويب؛ الإصدار الدقيق غير قابل للاسترداد؛ https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane	إعداد بناء وموازنة نظام غشاء POPC الصريح.
برنامج Discovery Studio Visualizer	BIOVIA (Dassault Systèmes)èأشهر)	2021؛ https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download	تحليل ثنائي الأبعاد للتفاعل بين الربيطة والثمالة.
GEO2R	قاعدة بيانات التعبير الجيني NCBI Gene Expression Omnibus	أداة ويب؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/	تحليل التعبير التفاضلي لـ GSE36701.
GeneCards	معهد ويزمان للعلوم	قاعدة بيانات إلكترونية؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.genecards.org/	التحقق من رمز الجين ومعلومات الجين أثناء توحيد الهدف.
gmx_MMPBSA	مفتوح المصدر (Valdé(s-Tresanco وآخرون)	1.5.x؛ https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/	تقدير الطاقة الحرة للارتباط بطريقة MM-PBSA والتحلل لكل ثمالة.
GROMACS	فريق تطوير GROMACS / مفتوح المصدر	2024.2؛ https://www.gromacs.org/	محرك محاكاة الديناميكيات الجزيئية.
مجموعة بيانات النسخ GSE36701	مستودع بيانات التعبير الجيني التابع للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI Gene Expression Omnibus)	GSE36701؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701	مجموعة بيانات التعبير الجيني العامة لغشاء المستقيم في حالات متلازمة القولون المتهيج المصحوبة بإمساك (IBS-C).
أوبن بابيل (Open Babel)	مفتوح المصدر	3.2.0؛ https://openbabel.org/	تحويل تنسيق الملفات الكيميائية، وتوليد الربائط ثلاثية الأبعاد، وتحضير الربائط.
قاعدة بيانات OPM	جامعة ميشيغان	قاعدة بيانات ويب؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://opm.phar.umich.edu/	توجيه البروتينات في الأغشية؛ الإحداثيات المستخدمة لمحاذاة HTR2A.
ParmEd	مطورو ParmEd / مفتوح المصدر	4.x؛ https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html	إعادة توزيع كتلة الهيدروجين ومعالجة طوبولوجيا المحاكاة الجزيئية.
PyMOL	شرايدرöدينجر / مفتوح المصدر	2.x؛ https://www.pymol.org/	التصور البنيوي ثلاثي الأبعاد وأشكال المستقبل والربيطة.
بنك بيانات البروتينات RCSB	RCSB PDB	قاعدة بيانات إلكترونية؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.rcsb.org/	مصدر البنى البروتينية التجريبية وإحداثيات بنك بيانات البروتينات (PDB).
STITCH	اتحاد STITCH (EMBL)	v5.0؛ https://stitch.embl.de/	التنبؤ بأهداف التفاعل بين الكيماويات والبروتينات.
يرجى تقديم النص المراد ترجمته.	اتحاد STRING / ELIXIR	v12.0؛ https://version-12-0.string-db.org/	بناء شبكة التفاعلات البروتينية-البروتينية وإثراء المسارات.
SwissADME	المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية (SIB) / جامعة لوزان	أداة ويب؛ تم الوصول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.swissadme.ch/	واصفات المعلوماتية الكيميائية، وتنبؤات الحرائك الدوائية، وتقييم مركبات PAINS.
SwissTargetPrediction	المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية SIB / جامعة لوزان	أداة ويب؛ تم الوصول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.swisstargetprediction.ch/	التنبؤ بأهداف البروتين البشرية استناداً إلى الربيطة.
تعيين معرفات UniProt	اتحاد UniProt	خدمة ويب؛ تم الدخول إليها في الفترة من يناير إلى مايو 2026؛ https://www.uniprot.org/id-mapping	ربط معرفات البروتين برموز الجينات الموحدة والمعتمدة من قبل لجنة تسمية الجينات البشرية (HGNC).
NVIDIA RTX 3080	شركة NVIDIA Corporation	RTX 3080؛ ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو (VRAM) بسعة 8 جيجابايت؛ إصدار CUDA/برنامج التشغيل غير محدد في المخطوطة	وحدة معالجة رسومات تدعم تقنية CUDA تُستخدم في محاكاة الديناميات الجزيئية.
وحدة معالجة رسومات (GPU) متوافقة مع CUDA	شركة NVIDIA	لم يتم تحديد إصدار مجموعة أدوات CUDA في المخطوطة؛ ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو (VRAM) بسعة 8 جيجابايت	وحدة معالجة رسوميات (GPU) تدعم تقنية CUDA مع ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو (VRAM) بسعة 8 جيجابايت؛ كما تطلب محطة العمل أيضاً ≥ذاكرة وصول عشوائي (RAM) بسعة 32 جيجابايت ووحدة معالجة مركزية (CPU) سداسية النواة.
أوبونتو لينكس (Ubuntu Linux)	شركة Canonical Ltd. / مفتوح المصدر	22.04 LTS	نظام تشغيل Linux بنظام 64 بت.
Python 3.9	مؤسسة برمجيات بايثون (Python Software Foundation)	3.9	بيئة برمجة عامة الغرض تُستخدم لكتابة نصوص سير العمل والتحليل.
مستودع التعبير الجيني (GEO)	المركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI) / المكتبة الوطنية الأمريكية للطب	مستودع ويب عام؛ لم يتم تحديد إصدار البرنامج في المخطوطة	مستودع بيانات الجينوميات الوظيفية العام.
AutoDockTools/MGLTools	مختبر الرسوميات الجزيئية، Scripps Research	1.5.7	مجموعة أدوات تحضير البنية الجزيئية ومدخلات الإرساء.
أدوات تحليل GROMACS	فريق تطوير GROMACS / مفتوح المصدر	2024.2	أدوات تحليل مسارات الديناميكا الجزيئية.
بروتوكول CHARMM-GUI المكون من ست خطوات	CHARMM-GUI / جامعة ليهاي	بروتوكول الويب؛ تعذر استعادة الإصدار الدقيق	سير عمل قائم على الويب لتحضير وموازنة الأنظمة الجزيئية متعددة المراحل.
cgenff_charmm2gmx_py3.py	نص برمجي للتحويل مفتوح المصدر؛ لم يتم تحديد المصدر في المخطوطة	لم يتم تحديد الإصدار في المخطوطة	نص برمجي لتحويل توبولوجيا حقل القوة.
بايثون	مؤسسة برمجيات بايثون (Python Software Foundation)	3.9	بيئة برمجة للأغراض العامة.
SciPy	مجتمع SciPy / مفتوح المصدر	لم يتم تحديد الإصدار في المخطوطة	مكتبة الحوسبة العلمية.
scipy.stats.fisher_exact	مجتمع SciPy / مفتوح المصدر	إصدار SciPy غير محدد في المخطوطة	فيشر’تنفيذ اختبار فيشر الدقيق (Fisher's exact test).
R	مؤسسة R للحوسبة الإحصائية	4.3.x	بيئة الحوسبة الإحصائية.
Bioconductor	مشروع Bioconductor / مفتوح المصدر	3.18	إطار عمل برمجيات المعلوماتية الحيوية.
limma	مشروع Bioconductor / مفتوح المصدر	الإصدار غير محدد في المخطوطة	حزمة تحليل التعبير الجيني التفاضلي.
بنجاميني–إجراء هوكبيرج	الطريقة الإحصائية	غير قابل للتطبيق (إجراء إحصائي)	طريقة تصحيح معدل الاكتشافات الخاطئة.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080؛ ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو (VRAM) بسعة 8 جيجابايت؛ إصدار CUDA/برنامج التشغيل غير محدد في المخطوطة	وحدة معالجة رسومات بذاكرة فيديو لا تقل عن 8 جيجابايت.
وحدة معالجة رسوميات متوافقة مع CUDA	شركة NVIDIA	لم يتم تحديد إصدار مجموعة أدوات CUDA في المخطوطة؛ ≥ذاكرة وصول عشوائي للفيديو بسعة 8 جيجابايت	وحدة معالجة الرسوميات التي تدعم الحوسبة المتوازية للأغراض العامة.
Ubuntu Linux 22.04 LTS	شركة Canonical Ltd. / مفتوح المصدر	22.04 LTS	نظام تشغيل لينكس (Linux) بمعمارية 64 بت.
TIP3P	مطورو حقل القوة CHARMM / مفتوح المصدر	TIP3P؛ لا ينطبق إصدار البرنامج	نموذج الماء الصريح ثلاثي المواقع.
طريقة ميكانيكا الجزيئات/مساحة السطح لـ بويسون-بولتزمان (MM/PBSA)	مطورو gmx_MMPBSA / مفتوح المصدر	gmx_MMPBSA 1.5.x	ميكانيكا الجزيئات/بواسون–طريقة بولتزمان لحساب طاقة الربط بناءً على مساحة السطح.