Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

تبدأ هذه العملية بتحضير المورفو (morpho) وmRNA ذو القبعة (cap mRNA) المنسوخ في المختبر. يتم ملء ماصة دقيقة عن طريق سحب المحلول الذي يحتوي على المورفو، ثم يتم معايرة حجم الحقن باستخدام مسرح خلية واحد مزود بميكرومتر. بعد ذلك، يتم جمع أجنة سمك الزيبرا وترتيبها في غرفة حقن مجهري لإجراء عمليات الحقن المجهري في المح.

يتم حقن المحلول العامل في المح сроك مباشرة تحت الخلية، وتُستغل الحركات السيتوبلازمية لنقل المحلول من أجل عمليات الحقن المجهري للخلية. احقن المحلول في سيتوبلازم الخلية بعد عمليات الحقن. تُحضن الأجنة عند درجة حرارة 28.5 °C في وسط E3، ثم يتم فحص الأنماط الظاهرية المستهدفة في المراحل اللاحقة.

أهلاً بكم، أنا شيلوه يوين من مختبر الدكتور ساشا وقسم علم الوراثة في كلية الطب بجامعة ييل. سنقوم اليوم بشرح تقنية دقيقة للحقن المجهري لإجراء دراسات فرط التعبير عن mRNA وتثبيط الجينات باستخدام قليلات النوكليوتيد المورفولينو في أسماك الزيبرا. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة دور الهدب في أمراض الكلى الكيسية.

لنبدأ الآن. يتمثل أحد النهج القوية لدراسات وظائف الجينات في الحقن المجهري للحمض الريبي RNA المنسوخ في المختبر والمزود بقبعة (capped RNA) في أجنة سمكة الزيبرا. في هذا العرض التوضيحي، سنقوم بحقن مجهري لنسخة مرتبطة بـ EGFP، واستخدام تعبير GFP في الجنين الكامل الحي كمؤشر مرئي لنجاح عملية الحقن.

أولاً، سنقوم بإجراء تفاعل نسخ RNA مُقبع في المختبر (in vitro) للنسخة المستهدفة. وفي مختبرنا، نقوم روتينياً بإدراج A-C-D-N-A المستهدف في ناقل pCS2+ ونقوم بتفاعل تخليق في المختبر لكميات كبيرة من RNA المُقبع باستخدام مجموعة M message mMachine SP6. بعد ذلك، سنقوم بتنقية عينة RNA عن طريق تمريرها عبر مجموعة RNeasy Mini أو عن طريق الاستخلاص بالفينول والكلوروفورم والترسيب باستخدام الإيزوبروبانول.

حدد بدقة تركيز تحضير RNA واحفظه في درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يحين وقت استخدامه في يوم الحقن. قم بإذابة عينة RNA، ثم رجها بلطف باستخدام جهاز vortex وقم بطردها مركزياً لفترة وجيزة. الآن، قم بتحضير محلول عمل باستخدام ماء معقم وبتركيز نهائي يتراوح بين 0.025 إلى 0.05% من phenol red، حيث يعمل phenol red كمؤشر مرئي لعملية حقن المحلول في الجنين.

سنقوم هنا بتحضير محلول عمل من EGFP mRNA بتركيز 100 nanograms per microliter مع 0.05% phenol red. وأخيراً، احتفظ بالعينة العاملة على الثلج وأعد مخزون RNA إلى درجة حرارة minus 80 degrees Celsius. انتقل إلى تحضير الـ morpho عندما تكون مستعداً لحقن هذه العينة.

تُستخدم قليلات النيوكليوتيد المضادة للمعنى (antisense oligonucleotides) على نطاق واسع لتعديل التعبير الجيني عن طريق منع ترجمة بروتين مستهدف أو عن طريق تعديل عملية وصل الحمض النووي الريبوزي الأولي (pre-mRNA splicing). وتعمل المورفولينوهات (morpholinos) في سمك الزيبرفيش كأداة قوية في الوراثة العكسية من خلال تثبيط وظيفة الجين. سنقوم هنا بالحقن المجهري لقليل نيوكليوتيد مورفولينو يستهدف موقع بدء الترجمة لجين pkd2. ونستخدم بشكل روتيني 300 M من المورفولينو المصمم خصيصاً لجين معين يتم الحصول عليه من شركة Gene Tools LLC.

نضيف بعد ذلك 100 µL من الماء المعقم لتحضير محلول مخزون بتركيز 3 mM، ثم نقسم المحلول إلى حصص صغيرة ونخزنه في درجة حرارة -20 °C حتى يحين موعد استخدامه في يوم الحقن. نقوم بتسخين محلول المورينو عند درجة حرارة 65 °C لمدة خمس دقائق، ثم نبرد المحلول بشكل مفاجئ على الثلج فوراً ونقوم بطرده مركزياً لفترة وجيزة؛ تهدف هذه الخطوة إلى تغيير طبيعة أي بنيات ثانوية في الأوليجو وضمان ذوبان المحلول تماماً.

بعد ذلك، سنقوم بتحضير محلول عمل عن طريق تخفيف محلول Morpho في ماء معقم وبتركيز نهائي يتراوح من 0.025 إلى 0.05% phenol red. في هذا العرض التوضيحي، سنقوم بتحضير محلول عمل بتركيز 0.5 millimolar PKD two morino مع 0.05% phenol red. يُحفظ محلول العمل في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم البدء في ملء الماصة الدقيقة عند الاستعداد لحقن هذه العينة.

للبدء، سنحتاج إلى تصنيع ماصات دقيقة لاستخدامها في عمليات الحقن. يتم ذلك عن طريق تسخين وسحب أنابيب شعرية من زجاج السيليكات BOS في جهاز قطبية الماصات الدقيقة. وبمجرد سحب الإبر، يتم الاحتفاظ بها في طبق بتري فوق كمية صغيرة من الطين أو الشريط اللاصق.

بعد ذلك، سنقوم بتحضير أطباق حجرة الحقن المجهري عن طريق صب agarose بتركيز 1.5% في ثلاثة أطباق وسط XE ذات قوالب على شكل أحواض وتدية. ستكون هذه وسيلة سهلة لتثبيت الأجنة أثناء عملية الحقن. ثم تُترك أطباق حجرة agarose لتتصلب وتُخزن عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين وقت استخدامها.

لبدء ملء الماصة الدقيقة، قم بقطع الطرف البعيد باستخدام ملقط أو شفرة حلاقة جراحية لإنشاء فتحة تكون مرئية بالكاد تحت مجهر التشريح بتكبير 50x. بعد ذلك، ضع 2 µL من المحلول العامل.

ضع قطرة على شريحة غطاء، ثم قم بتوصيل الجزء الخلفي من الماصة الدقيقة بحقنة سعة 5 مل مزودة بأنبوب على إبرة طبية، واغمر الطرف البعيد للماصة الدقيقة بشكل طفيف في قطرة المحلول العامل. احذر من كسر طرف الماصة الدقيقة. اسحب المحلول العامل عبر الطرف البعيد للماصة الدقيقة عن طريق سحب مكبس الحقنة.

بعد ذلك، سنقوم بمعايرة حجم حقن الماصة الدقيقة. ضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرومترية، ثم قم بتشغيل الطاقة وإمدادات الهواء لجهاز الحقن الدقيق بالنبضات الضغطية. بعد ذلك، قم بتثبيت الماصة الدقيقة في حامل الماصات الدقيقة الخاص بجهاز الحقن الدقيق.

يتم تنظيم ضغط المحقن الدقيق، ويتم تفعيل عمليات التفريغ بالضغط على دواسة القدم الموجودة أسفل مجهر التشريح. اختبر حجم الحقن باستخدام المحقن الدقيق لوضع قطرة من محلول العمل الخاص بك فوق زيت الميكرومتر. قم بقياس قطر القطرة وهي تطفو على شكل كرة فوق الزيت.

اضبط مدة وضغط الحقن لمعايرة حجم الحقن بدقة. تساعد هذه الخطوة في ضمان تكرارية تجربة الحقن المجهري. في هذا العرض التوضيحي، سيتم إجراء جميع عمليات الحقن المجهري بقطرة يبلغ قطرها 0.15 millimeters.

أخيرًا، بمجرد معايرة حجم الحقن، استخدم مقبض التثبيت الموجود في المحقن الدقيق لمنع الارتجاع وتسرب الماصة الدقيقة. حان الآن وقت تحضير أجنة سمك الزيبرا. يتزاوج سمك الزيبرا بشكل عشوائي، لذا في الساعات الأولى من كل صباح لبدء التحضير، اجمع الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة وضعها في وسط XE 3.

باستخدام ماصة نقل سعة 3 مل، قم بترتيب الأجنة على طول الأخاديد ذات الشكل الوتدي في أطباق غرفة الحقن المجهري. قم بإزالة الوسط بحيث تكون الأجنة مغمورة بشكل ضحل وغير مغمورة بالكامل. تساعد هذه الخطوة في استقرار الأجنة في قاع الأخاديد، كما تسهل اختراق الغشاء الكوريوني بواسطة الماصة المجهرية.

سنبدأ الآن بعمليات الحقن. أولاً، سنقوم بمعالجة الأجنة باستخدام الماصة الدقيقة بحيث يكون سيتوبلازم الجنين في مرحلة الخلية الواحدة مرئياً تحت مجهر التشريح. احذر من كسر طرف الماصة الدقيقة، ثم اخترق الكوريون ومن ثم المح، باستخدام الماصة الدقيقة من أجل الحقن داخل الجنين.

في هذا العرض التوضيحي، سنقوم أولاً بالحقن المجهري في المح، مباشرة تحت الخلية، والسماح للسيتوبلازم والانتشار بنقل المحلول العامل إلى داخل الخلية. هذا التدفق مرئي بفضل إضافة الفينول الأحمر إلى المحلول العامل. وبما أن هذا الجنين يتكون من خلية واحدة، فيمكن حقنه يدوياً أو باستخدام جهاز مناولة.

سنقوم أيضاً بتوضيح عملية الحقن المباشر في سيتوبلازم الخلية. يعد الحقن المجهري المباشر في الخلية أكثر دقة، ولكنه يستغرق وقتاً أطول نظراً للحاجة إلى توجيه الجنين بشكل صحيح واتباع تقنية حقن مجهري دقيقة. وبما أن غشاء الخلية أكثر مقاومة من غشاء المح، فغالباً ما يكون إدخال الماصة المجهرية عبر المح للوصول إلى الخلية أسرع.

قد يساعد توجيه السيتوبلازم بحيث يكون القطب الحيواني نحو قاع الحوض والعمل بيدين ثابتتين في هذه الطريقة من الحقن. بعد الحقن المجهري، ضع الأجنة في طبق بتري يحتوي على وسط E three واحضنها عند درجة حرارة 28.5 °C لضمان التطور الطبيعي. وخلال الساعات والأيام القادمة من تطور الجنين، راقب الأجنة لرصد الأنماط الظاهرية المستهدفة.

للتحقق من نجاح الحقن المجهري، سنقوم بمراقبة تعبير GFP في الأجنة النامية بدءاً من مرحلة الدرع (shield stage) عن طريق مجهر الفلورة للجنين الكامل في الجسم الحي (in vivo). يكون تعبير البناء الجيني في أقوى حالاته خلال الأحداث المبكرة للتطور الجنيني، وغالباً ما يتضاءل أثناء النمو، وذلك مع تحلل RNA ذو القبعة (capped RNA) المحقون تدريجياً وبناءً على استقرار البروتين المُعَبَّر عنه. وبناءً على النتائج المنشورة سابقاً، نتوقع أن يحاكي PKD two morphine انحناء محور الجسم الظهري كما هو موجود في أسماك الزبرا الطافرة من نوع PKD two، مع ظهور تكيسات كلوية في غضون يومين إلى ثلاثة أيام تقريباً بعد الإخصاب.

لقد عرضنا لكم للتو تقنية حقن مجهري قوية لإجراء دراسات فرط تعبير mRNA وتثبيط الجينات باستخدام قليلات النوكليوتيد المورفولينية في سمك الزيبرا؛ وعند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر أن الأمر الأكثر أهمية هو الحقن بيد ثابتة. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.