قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

من أجل قياس مدى الحياة في ديدان C. elegans، يتم إنشاء مجموعة سكانية متزامنة العمر باستخدام طريقة وضع البيض الموقوتة تكاثرياً. تُنقل الديدان الخنثى البالغة والنشطة إلى أطباق وسط نمو النيماتودا (NGM) المزروعة ببكتيريا E. coli المقتولة بالأشعة فوق البنفسجية، وتُترك لوضع البيض لمدة تتراوح من ست إلى ثماني ساعات ثم تُزال؛ وتفقس الديدان من هذه البيوض وتنمو حتى تصل إلى المرحلة اليرقية L4. بعد ذلك، تُنقل ديدان L4 إلى أطباق NGM جديدة تحتوي على الأمبيسيلين لمنع التلوث البكتيري الحي ومادة FUDR لمنع التكاثر، وتُترك لتتطور إلى مرحلة البلوغ.

من هذه النقطة فصاعداً، يتم فحص الديدان البالغة كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الديدان. وفي كل نقطة زمنية، تُزال الديدان الميتة من الطبق ويُسجل عدد الديدان الحية والميتة. أنا جورج سيتون من مختبر مات كابلاين في قسم علم الأمراض بجامعة واشنطن.

سنقوم اليوم بتوضيح كيفية قياس فترة الحياة ومراقبة ديدان hepatitis elegance. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة وراثة الشيخوخة. لذا، فلنبدأ.

تتطلب تجربة قياس مدى الحياة الأساسية نوعين من الأطباق: أطباق NGM القياسية التي لا تحتوي على أي إضافات، وأطباق AMP FUDR التي يضاف إليها كل من الأمبيسيلين والفلوروديوكسي يوريدين إلى وسط NGM. يتم تحضير كلا النوعين من الأطباق بزراعة بكتيريا e coli OP 50، والتي يتم قتلها لاحقاً بالتعريض للأشعة فوق البنفسجية uv. ابدأ بتحضير 10 milliliters من محلول NGM.

لكل طبق بتري بقطر 60 millimeter، قم بإذابة الوسط الصلب NGM تماماً باستخدام الميكروويف على درجة حرارة عالية في نبضات مدتها 32 ثانية. قم بتحريك الوسط بين النبضات لمنع تراكم فقاعات الغاز المضغوط، ثم ضع سائل NGM في حمام مائي بدرجة حرارة 55 degree Celsius أو على طاولة المختبر للسماح للوسط بالتبريد. وبمجرد أن يبرد الوسط إلى 55 degree Celsius، وهي النقطة التي يمكنك عندها إمساك الوعاء الزجاجي براحة بيدين عاريتين، يصبح جاهزاً لإضافة العقاقير.

ولصب الأطباق التي تحتوي على العقاقير، أضف 33 µL من FUDR بتركيز 150 mM و 100 µL من Ampicillin بتركيز 100 mg/mL لكل 100 mL من وسط NGM، ثم قم بتحريك الطبق بشكل دائري للمزج؛ حيث يُستخدم ampicillin لمنع التلوث البكتيري الخارجي، ويُستخدم FUDR لمنع فقس البيض، وبذلك لن تكون هناك حاجة لنقل الديدان كل بضعة أيام لفصلها عن اليرقات النامية.

الآن، صُب الوسط الغذائي واترك الأطباق لتجف على المنضدة لمدة يومين؛ وفي اليوم الذي يسبق انتهاء جفاف الأطباق، قم بتلقيح مزرعة سائلة من LB باستخدام مستعمرة واحدة من مسحة حديثة لبكتيريا e coli OP 50 على أطباق LB agar. قم بتحضير 0.5 milliliter على الأقل من المزرعة لكل طبق بقطر 60 millimeter.

ضع مستنبت OP 50 في هزاز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية واترك البكتيريا تنمو طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بترسيب بكتيريا OP 50 باستخدام قوة طرد مركزي قدرها 3,500 g لمدة 10 دقائق. قم بسحب كمية كافية من الطافي لإعادة تعليق البكتيريا بتركيز 10x.

قم الآن بتلقيح كل طبق بـ 100 µL من المزرعة المركزة. تجنب ملامسة طرف الماصة لسطح NGM، حيث أن العيوب الموجودة في سطح الوسط ستسمح للديدان بالحفر؛ قم بتدوير الأطباق حتى تغطي البكتيريا المنطقة المركزية من NGM دون الاقتراب من جدران الطبق، واترك الأطباق لتجف على طاولة المختبر لمدة 24 ساعة. وبمجرد جفافها، عرّض سطح الأطباق لجرعة UV قوية بما يكفي لإيقاف النمو البكتيري، ونحن نستخدم strata gene UV straddle linker 2, 400.

ابدأ بتحميل الأطباق في الوصلة العرضية دون أغطيتها. الآن اضغط على energy. أدخل 9 9 9 9 على لوحة المفاتيح واضغط على start.

سيتم تعريض الأطباق للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة خمس دقائق تقريبًا. ويمكن تخزين الأطباق التي قُتلت فيها البكتيريا بالأشعة فوق البنفسجية مقلوبة عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد. يوضح هذا القسم كيفية إنشاء مجموعة من الديدان بتاريخ فقس موحد.

ابدأ بنقل حوالي 20 دودة بالغة شابة إلى طبق NGM جديد خالٍ من الأدوية. اترك الطبق عند درجة حرارة 25 °C لمدة أسبوع تقريبًا للسماح للديدان بالتكاثر واستهلاك جميع الغذاء البكتيري في غضون أسبوع. عند ظهور الديدان حديثة الفقس في مرحلة dower المتوقفة عن النمو، يجب نقل 20 إلى 30 يرقة dower إلى طبق NGM جديد خالٍ من الأدوية وتحضينها عند درجة حرارة 25 °C في وجود الغذاء.

ستصبح يرقات dower بالغة ونشطة تكاثرياً في غضون يومين، وستظل نشطة تكاثرياً لبضعة أيام بعد ذلك. الآن، انقل من 10 إلى 15 من البالغين النشطين تكاثرياً إلى طبق NGM جديد خالٍ من العقاقير. يشار إلى هذا الطبق باسم طبق وضع البيض الموقوت أو طبق TEL.

اترك طبق TEL عند درجة حرارة 25 °C لتمكين الديدان من وضع البيض. وستكون الحيوانات التي تفقس من هذه البيوض هي الحيوانات التجريبية، ويتم تسجيل مدة بقائها بعد ست ساعات. افحص طبق TEL للتأكد من وجود البيض.

إذا لم يكن هناك عدد كافٍ من البيض بعد، فاترك طبق TEL عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة إجمالاً، مع الفحص الدوري لوجود البيض. وعند وضع عدد كافٍ من البيض، قم بإزالة الحشرات البالغة من طبق TEL.

تتطلب تجربة مدى الحياة النموذجية ما بين 30 إلى 90 بيضة لكل مجموعة تجريبية، ولكن يمكن إنتاج عدة مئات من البيض على طبق TEL واحد. تضع 10 إلى 15 من البالغين النشطين تكاثرياً ما يقرب من 150 بيضة خلال ست إلى ثماني ساعات. وعند مقارنة المجموعات التجريبية، يمكن تحقيق دلالة إحصائية للفروق الكبيرة في مدى الحياة باستخدام 30 حيواناً فقط.

يجب استخدام عدد أكبر من الحيوانات لتمييز الفروقات الأكثر تواضعاً. الآن، ضع طبق TEL الخالي من البالغين عند درجة حرارة 20 °C حتى تفقس البيوض وتتطور الديدان إلى المرحلة اليرقية L4. عادة ما يستغرق ذلك يومين في سلالة C elegance البرية، ولكن قد يستغرق وقتاً أطول في السلالات ذات الأنماط الظاهرية ذات النمو البطيء.

يصف هذا القسم كيفية متابعة حياة مجموعة سكانية متزامنة العمر. أولاً، انقل اليرقات في الطور L4 من طبق TEL إلى أطباق AMP FUDR المجهزة. وبالنسبة لكل سلالة أو حالة يتم اختبارها، فمن المعتاد إعداد طبقين إلى ثلاثة أطباق تحتوي كل منها على 25 إلى 30 دودة.

يتم تحضين أطباق AMP FUDR عند درجة حرارة 20 °C لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، يتم تقييم الديدان والوسط والبكتيريا بصرياً، ثم تُنقل الديدان إلى أطباق AMP FUDR جديدة. يتم ذلك عادةً مرة أو مرتين في الأسبوع، وذلك في حال استهلكت الديدان معظم الغذاء البكتيري.

في مرحلة مبكرة من التجربة، إذا وجد عدد كبير من اليرقات، فإن هذا يشير عادةً إلى أنه قد تم نقل الديدان إلى أطباق AMP FUDR كبالغين يافعين بدلاً من مرحلة L4. يمكن للبالغين اليافعين وضع البيض قبل أن يبدأ مفعول FUDR، وأحياناً تفلت اليرقات من تأثير FUDR وتنمو لتصبح بالغة. ستؤدي هذه اليرقات إلى إرباك نتائج التجربة؛ وفي هذه الحالة، يتم نقل الديدان البالغة إلى أطباق جديدة والتخلص من الأطباق القديمة التي تحتوي على اليرقات.

يجب أيضاً نقل الديدان إلى أطباق جديدة في حال لوحظ وجود بكتيريا حية نامية. وبشكل عام، يضمن الجمع بين القتل باستخدام AMP والأشعة فوق البنفسجية (UV) عدم تلوث التجربة بأي بكتيريا حية، ولكن قد يحدث ذلك أحياناً. كما يجب نقل الديدان.

في حال لوحظ نمو فطري على الوسط الغذائي. إذا تم اكتشاف ذلك في وقت مبكر بما يكفي، يمكن استئصال الفطر باستخدام طرف ماصة أو ملعقة مسطحة. وبمجرد أن ينمو الفطر ليتجاوز قطره بضعة مليمترات، فعادة ما يكون من الأسهل نقل الديدان إلى طبق جديد.

قم بتقييم فترة حياة جميع الديدان كل يومين إلى ثلاثة أيام. باستخدام مجهر التشريح، حدد ما إذا كانت كل دودة حية أم ميتة.

انقر بلطف على الطبق. تكون الدودة حية إذا تحركت استجابةً للنقر. وإذا لم تستجب الدودة للنقر على الطبق، فقم بتكبير منطقة الرأس، وانقر بلطف على رأس الدودة باستخدام ملقط نقل بلاتيني.

سجّل الدودة على أنها ميتة. إذا لم تستجب عن طريق تحريك رأسها، قم بإزالة الدودة الميتة من الطبق. بعد فحص جميع الديدان، سجّل التاريخ وعدد الديدان الحية والميتة.

قد تهرب الديدان التي يتم تربيتها على أوساط صلبة أحياناً من سطح الطبق عن طريق الحفر أو الزحف على الجدار. يتم استبعاد الديدان الهاربة تماماً من الدراسة. عند الانتهاء، تُعاد الأطباق إلى الحاضنة عند 20 degrees Celsius.

انتظر يومين إلى ثلاثة أيام أخرى ثم افحص الأطباق مرة أخرى. استمر في هذا النظام حتى تموت جميع الديدان. عادةً ما يُعكس عدد الديدان التي تموت في كل يوم لحساب نسبة الديدان الحية في كل يوم، ويتم رسم هذه البيانات بيانياً على شكل منحنى بقاء مع مراعاة اليوم الذي تم فيه وضع البيض الموقوت.

اليوم صفر. يبلغ متوسط العمر النموذجي لـ N two، وهي سلالة النوع البري من C. elegans التي يتم الحفاظ عليها في وسط UV kill bacteria عند 20 درجة Celsius، حوالي 25 يوماً مقاسة من مرحلة البيضة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية قياس مدى الحياة وملاحظة الرشاقة. يمكنك تعديل هذا الإجراء الأساسي لاختبار مجموعة متنوعة من الظروف البيئية، بما في ذلك التقييد الغذائي وتداخل RNA، وهو ما تمت مناقشته في النص الداعم. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في تجربتكم.