تنسيق كا ^{2 +} الكشف العابر في العضلات الملساء

أولاً، يتم تحضير محلول تحميل الكالسيوم، وتدفئته، وسدّه بالفقاعات. ثم يتم تشريح المثانة البولية، وفتحها، وتثبيتها بالدبابيس بشكل مسطح، وأخذ شريحة من العضلة undetrusor. تُضاف شريحة العضلة detrusor إلى محلول التحميل، وتُحضن ثم تُشطف، وتُثبت بالدبابيس بشكل مسطح.

يتم استثارة مؤشر الكالسيوم الموجود داخل النسيج بواسطة ضوء الليزر، ثم يتم التقاط الضوء المنبعث الناتج عن ذلك. وتُحلل المقاطع المرئية المكونة من إطارات فردية عن طريق مقارنة الإطارات المتتالية، مع طرح الخلفية.

تحدد عتبة حافة الخلية المواضع التي يمكن العثور فيها على الأحداث، ويتم أخذ نسبة بين الأدمغة المتتالية. وإذا كانت الأحداث المتبقية تطابق معايير محددة مسبقاً، يتم تمييزها وتصنيفها. مرحباً، اسمي جون يونغ من مختبرات كيث برين وتوم كينين في قسم фармаكولوجيا بجامعة أكسفورد.

أنا روب أموس، ومن مختبرات براين وكان، واسمي كيث براين. اليوم، سيقدم لكم جون وروب تقنية تصوير الكالسيوم في العضلات الملساء. نحن نستخدم هذه التقنية في مختبرنا لدراسة إفراز الناقل العصبي من الأعصاب اللاإرادية وتأثيره على العضلات الملساء.

لنبدأ الآن. يتوفر مؤشر الكالسيوم organ green 488 BAFTA 1:00 AM في عبوات سعة 500 µL تحتوي على 50 µg من المسحوق. ولتحضير مؤشر الكالسيوم، أضف 40 µL من محلول Onic F1 27 إلى المسحوق ورج العبوة بلطف لمدة 30 ثانية، بعد ذلك أضف 460 µL من محلول الملح الفسيولوجي PSS، ورجها بلطف لمدة 30 ثانية أخرى.

يوفر المحلول النهائي، بتركيز 10 µM من صبغة organ green 488 BAFTA، أربع حصص حجم كل منها 125 µL. يجب تجنب التعرض للضوء وتخزين المحلول عند درجة حرارة -20 °C قبل تشريح النسيج المطلوب.

أخرج مؤشر الكالسيوم من المجمد واتركه ليذوب في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح سائلاً. ضع 1 mL من محلول PSS في أنبوب اختبار وفي حمام مائي عند درجة حرارة 33 °C. ثبّت جهاز فقاعات (bubbler) في أنبوب الاختبار باستخدام سدادة، أو يمكنك استخدام غشاء برافيل (perfil)، ثم قم بالفقاعة بمزيج مكون من 95% oxygen و 5% carbon dioxide بمعدل ظهور فقاعة واحدة تقريباً في الثانية.

قم بتشريح العضو ذو العضلات الملساء من الحيوان. في هذه الحالة، هي المثانة البولية لفأر. ضع العضو في حوالي 50 ملليمتر من محلول PSS لغسله، وبعد غسل النسيج بعناية، قم بإزالة الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة.

قم بإجراء التشريح المفتوح وفقاً لنوع العضلات الملساء للمثانة البولية. افتح طولياً من عنق المثانة، من الطرف السفلي وصولاً إلى قمة القبة. وفي الطرف القحفي، قم بتحضير أربع شرائح، يتراوح طولها بين 6 إلى 8 mm وعرضها بين 1 إلى 2 mm على طول السطح الظهري للمثانة، مع القص في اتجاه الحزم العضلية السائدة.

ضع النسيج الذي تم تشريحه وPSS الذي تم تدفئته مسبقاً وفقاعته لتحميل مؤشر الكالسيوم بمقدار 125 µL من 10 µM من organ green 488B إلى النسيج في أنبوب الاختبار، وقم برجّه قليلاً باليد للمزج. أعد الأنبوب إلى الحمام المائي. استأنف عملية الفقاعة وقم بتغطية الحمام المائي بورقة من القصدير.

يختلف الوقت اللازم لامتصاص كمية كافية من مؤشر الكالسيوم في الأنسجة باختلاف حجم النسيج وسُمك طبقة العضلات الملساء. فعلى سبيل المثال، يستغرق الأمر 70 دقيقة بالنسبة للعضلة الدافعة في الفئران والـ oxs في الجرذان. بينما نقوم بالتحضين لمدة 120 دقيقة بالنسبة للعضلة الدافعة في الجرذان والـ VAs deens في الفئران.

بمجرد تحميل النسيج بالمؤشر الكالسيومي، يمكن تحضيره للفحص المجهري. أولاً، اشطف النسيج في محلول PSS المفرغ بالفقاعات لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتثبيت النسيج في طبق تحضير مبطن بـ S guard.

قم بشدها قليلاً لتكوين ورقة مسطحة. ثبت النسيج باستخدام قطع قصيرة، على سبيل المثال، أسلاك فضية بطول 2 mm وقطر يتراوح من 25 إلى 50 µm، وأدخل الدبابيس بزاوية.

تجنب استخدام الدبابيس التي يتجاوز طولها بضعة مليمترات لأنها قد تخدش العدسة الشيئية. يعد تثبيت النسيج بالدبابيس بعناية أمراً هاماً لتقليل التقلص التلقائي للنسيج ولتسهيل تحديد موقع مناسب للتصوير. بعد تثبيت النسيج، ضع طبق التحضير على منصة المجهر.

يجب الحذر من تسرب PSS خارج المنطقة المبطنة بحارس السيليكون في الطبق، حيث قد يؤدي ذلك إلى تغطية مساحة كبيرة بـ PSS. وعندما تبدأ عملية الغمر الفائق (superfusion) لأغراض العرض التوضيحي، سيتم تنفيذ الخطوات التالية في الضوء.

يرجى ملاحظة أن هذه التجارب تُجرى عادةً في الظلام. قم بتشغيل المضخة من أجل تروية المستحضرات. وفي حالة استخدام PSS، غالباً ما يتم اعتماد معدل تدفق قدره 100 milliliters per hour.

قم بتشغيل وحدة التسخين، وضع أنابيب التدفق الداخل والخارج ومجس درجة الحرارة على طبق التحضير مع تثبيت كل منها في الشريط المعدني بواسطة المغناطيس الموجود في قاعدتها. سيحدد ارتفاع طرف أنبوب التدفق الخارج عمق محلول الملح الفسيولوجي (PSS). يجب توخي الحذر للتأكد من أن التدفق الخارج يقوم بالفعل بإزالة محلول PSS، حيث إنه قد لا يفعل ذلك في بعض الأحيان.

اضبط درجة الحرارة في وحدة التسخين في البداية لتصل إلى درجة الحرارة المطلوبة والتي تتراوح بين 33 و 35 °C. اترك النسيج ليتوازن لمدة 10 دقائق على الأقل باستخدام عدسة شيئية ذات قوة تكبير منخفضة، 10 أو 20 مرة.

استخدم الفلورة فوق المجهرية (epi fluorescence) أو التحفيز بضوء أزرق لرؤية العضلات الملساء وتحديد المنطقة المناسبة للمراقبة. وبما أن التعرض لإضاءة التحفيز سيؤدي إلى تبييض المؤشر ضوئياً، فتجنب استخدامه لأكثر من بضع ثوانٍ في المرة الواحدة.

تجنب المواقع ذات البنى الساطعة لأنها قد تتسبب في ظهور عدد كبير من النتائج الإيجابية الكاذبة في خوارزمية اكتشاف الصور. حاول اختيار موقع يتميز بأقل قدر من الحركة وعدد كبير من خلايا العضلات الملساء في المجال. بمجرد اختيار الموقع المراد تصويره، انتقل إلى عدسة شيئية ذات قوة تكبير أعلى مثل 40 x.

قم بتدوير المنصة أو المحور البصري بحيث تكون خلية أو خلايا العضلات الملساء في وضع أفقي، أي موازية لمحور المسح السريع. وبذلك تصبح خلايا العضلات الملساء جاهزة للتصوير باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy).

في هذا البروتوكول، نستخدم مجهراً بؤرياً قائماً من طراز Leica SP two. يتم إغلاق الثقب (pinhole) ليكون بمقدار قرص هوائي واحد (one airy disc). اضبط قدرة الليزر بين 25 و 35% باستخدام مرشح custo optic القابل للضبط.

تعد هذه القيمة بمثابة توازن بين السطوع والابيضاض الضوئي. وللتحضير لتحليل البيانات، قم بتنزيل وتثبيت برنامج ImageJ. قم بتنزيل الإصدار الخاص بنظام التشغيل لديك، ثم حدّثه إلى أحدث إصدار عن طريق تنزيل أحدث ملف jar لبرنامج ImageJ لاستبدال الملف القديم. بعد ذلك، قم بتنزيل ملف jar الخاص بـ Excel writer وتثبيته في دليل plugins jar.

انسخ هذه الملفات إلى دليل الملحقات (plugins directory). ثبّت كل سيناريو من هذه السيناريوهات باستخدام وحدات الماكرو الخاصة بالملحقات. ثبّت وظيفة Image J. يُسمى البرنامج الخاص بمجهر Leica SP2 confocal الذي نستخدمه بـ Leica.

يقوم نظام LCS بحفظ الإطارات الفردية لكل سلسلة كملف منفصل. لإعادة بناء السلسلة، تأكد من وجود جميع الإطارات المراد إعادة بنائها في مجلد واحد.

على سبيل المثال، مجلد بيانات tiffs. ثم اختر ماكرو Leica SP two stacker من قائمة plugins macros. اختر الدليل الرئيسي، وهو في هذه الحالة مجلد البيانات.

اختر المجلد المطلوب من القائمة المنسدلة. في هذه الحالة، حدد دليل إخراج لملفات tiffs أو أنشئ دليلاً جديداً. على سبيل المثال، مجلد data stacks.

بعد ذلك، سيقوم البرنامج بإعادة بناء السلاسل من الإطارات الفردية لتصحيح الحركة. نحن نستخدم خوارزمية متاحة مجانًا تقوم بمحاذاة أو مطابقة الإطارات ضمن سلسلة المجلدات التي تم تنزيلها، وهي rig و turbo reg. انسخ الملفات الخاصة بكل منهما إلى مجلد stacks.

قم بتحميل مجموعة الصور المراد معالجتها، ثم انتقل إلى إطار يُظهر بوضوح مجال الاهتمام؛ حيث سيتم محاذاة الإطارات الأخرى وفقاً لهذا الإطار المرجعي. بعد ذلك، انتقل إلى قائمة plugins stacks.

تسجيل المكدس. جرب كل تحويل من التحويلات المختلفة لتحديد الأكثر فعالية لكل موقع. ستتفاوت العوامل المصورة التي تؤثر على اكتشاف العبورا الكالسيومية من خلال قياس خصائص معينة ومعلمات الجسيمات لكل موقع.

تزداد حساسية وخصوصية الكشف. وبناءً على ذلك، سنقوم بحساب عتبة لكل موقع، وهي العتبة المطروحة للنسبة وعتبة حافة الخلية. للبدء، انتقل إلى plugins، ثم macros، ثم install واختير jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. بعد ذلك، انتقل إلى plugins ثم macros ثم load stack.

اختر سلسلة واحسب معاملات الجسيمات التالية. لحساب عتبة الطرح، حدد منطقة اهتمام مستطيلة فوق ما تعتقد أنه قياس الخلفية، ثم سجل المتوسط. ولحساب عتبة النسبة، حدد منطقة اهتمام مستطيلة حول منطقة مسطحة بصرياً من خلية أو خلايا العضلات الملساء.

قم بقياس وتسجيل المتوسط والانحراف المعياري. كرر هذه العملية مرتين إضافيتين، أو يمكنك رسم ثلاثة مربعات في آن واحد بالضغط على مفتاح shift. احسب وسجل القيمة الحدية للنسبة.

احسب قيمة الانحراف المعياري مقسوماً على (المتوسط زائد واحد)، ثم اضرب النتيجة في 32. وعند حساب متوسط القيم من المكررات الثلاثة، يكون عامل الضرب 32 ضرورياً لمراعاة خوارزمية النسبة حيث يتم تعيين عدم التغير عن الإطار السابق بقيمة صحيحة تبلغ 32. ويوفر ذلك نطاقاً ديناميكياً جيداً للكشف عن الزيادات والنقصان في النسبة.

بالنسبة لصورة ثمانية البتات، اختر "ضبط عتبة الصورة" (image adjust threshold). ثم اختر "الأبيض والأسود". حدد الحد العلوي للمنزلق وسجل القيمة المقابلة.

يوجد هذا إلى يمين المنزلق. سيتم حساب الأحداث التي تقع في المناطق السوداء فقط. انقر فوق إعادة الضبط.

بعد حساب حد الطرح بالنسبة المئوية وحد حافة الخلية، يمكننا الآن تحليل مجموعات الصور. حدد موقع المجموعات المراد تحليلها. اختر سلسلة واحدة فقط في هذه المرحلة.

هذا هو الملف الأول، ويجب أن يكون الملف الأخير مماثلاً له. بعد ذلك، حدد موقعاً لإخراج ملفات البيانات والمجموعات. على سبيل المثال، مجلد إخراج البيانات.

أدخل قيم العتبة للطرح، وعتبة النسبة، وعتبة حافة الخلية. اترك الإعدادات الأخرى على قيمها الافتراضية. سينتج الخوارزمية نافذة ذات جزءين، حيث تظهر السلسلة المعالجة على اليسار والأصلية على اليمين.

افتح هذا الملف من مجلد المخرجات وراجعه بدقة لتقييم عدد الإيجابيات الكاذبة والحالات التي لم يتم فيها اكتشاف أحداث مرئية بالعين المجردة. بالنسبة لكل سلسلة، يُنتج الخوارزم ملف Excel يفصل خصائص الحدث المكتشف مثل السعة والمساحة والموضع؛ ويمكن إزالة الإيجابيات الكاذبة يدوياً من ملف Excel هذا من خلال مراجعة ملفات الصور التي يخرجها الخوارزم، على أن تتبع معايير صارمة عند القيام بذلك.

هذا مقطع فيديو يوضح عابرية الكالسيوم في العضلات الملساء. في هذا المثال، يتكون المقطع من 100 إطار فردي تم التقاطها بتردد خمسة هرتز. نقوم بالتقاط العديد من هذه المقاطع في التجربة الواحدة عند استقصاء تأثير عقار معين على تردد عابرية الكالسيوم، على سبيل المثال.

نرى هنا العديد من العوابر الكلسية التلقائية في خلايا العضلات الملساء. تظهر هنا نتيجة خوارزمية الكشف عن الجسيمات. وبالنسبة لكل سلسلة، تنتج الخوارزمية ملف Excel يفصل خصائص الحدث المكتشف مثل السعة والمساحة والموقع.

لقد استعرضنا طريقة لتصوير انتقالات الكالسيوم في الأعضاء ذات العضلات الملساء مثل المثانة البولية، كما استعرضنا وسيلة لتحليل تلك الانتقالات الكالسيومية باستخدام خوارزمية قمنا بتطويرها في المختبر. ومن المهم تذكر ضرورة تحضير النسيج جيداً للتصوير الكالسيومي؛ ففي حالة النسيج الذي استعرضناه اليوم، يتضمن ذلك إزالة الأنسجة الضامة وإزالة أي دهون قد تحجب مجال الرؤية.

من المهم أيضاً تثبيت النسيج في شكل ورقة مسطحة. حسناً، نتمنى لكم التوفيق في تجاربكم وشكراً لكم على المشاهدة.