تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

تبدأ هذه العملية بجمع الأجنة على أطباق عصير العنب الطازج لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة. بعد إخراج الطبق من القفص المائي، يتم التقاط الأجنة باستخدام فرشاة مبللة ووضعها على شريط لاصق مزدوج. يتم دحرجة جنين واحد برفق فوق الشريط باستخدام أحد طرفي الملقط حتى ينفتح الغشاء الكوريوني.

التقط الجنين وضعه برفق على الغطاء. ثم ضع فوقه طبقة من صمغ het. كرر هذه العملية حتى يتوفر لديك العدد الكافي من الأجنة.

بعد عملية التجفيف، تصبح الأجنة جاهزة للحقن. مرحباً، أنا إنغريد بروس موشر من مختبر الدكتور جوناثان سكولي في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية بجامعة كاليفورنيا ديفيس. سنعرض لكم اليوم إجراءً للحقن المجهري لأجنة ذبابة الدروزيوفيلا في المرحلة المدمجة.

نستخدم هذا الإجراء لدراسة دور الأنيبيبات الدقيقة والمحركات القائمة على الميتوسين في الانقسام الفتيلي. على سبيل المثال، نقوم بحقن الأجسام المضادة أو مثبطات أخرى لبروتينات انقسامية محددة مجهرياً. ومن خلال تحليل تأثير المثبط على الانقسام الفتيلي، نتمكن من تحديد وظيفة البروتينات المستهدفة.

لنبدأ الآن. لبدء التحضيرات قبل التجربة بيومين إلى ثلاثة أيام، قم بتجهيز قفص وضع البيض عن طريق صنع ثقبين صغيرين بمساحة سنتيمتر مربع واحد تقريبًا على جانبين متقابلين من زجاجة بلاستيكية. املأ الثقوب بقطعة من القطن، بما يسمح بتدفق الهواء.

انقر على الذباب لإدخاله في الزجاجة، ثم قم بتغطيتها بطبق عصير العنب. في حالة استخدام الخميرة، احتفظ بقفص الأرجل في درجة حرارة الغرفة؛ حيث سيضع الذباب البيض لمدة تصل إلى 10 أيام، وذلك قبل يوم واحد على الأقل من التجربة. اسحب الإبر المخصصة للحقن واحتفظ بها في درجة حرارة 4 °C.

في يوم التجربة، قم بتجهيز الإبر وتحميلها. أولاً، أخرج التوبولين (tubulin) المسمى من المجمد وضعه على الثلج لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بتخفيفه باستخدام محلول GPEM المنظم، ثم قم بطرد المركز لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة بسرعة 13,000 RPM عند درجة حرارة 4 °C.

وأخيراً، يتم تحميل 1-2 µL في الإبرة وتحفظ عند درجة حرارة 4 °C، وذلك لمنع البلمرة الناتجة عن تغير درجة الحرارة داخل الإبرة. وقبل تجهيز الشريحة الغطائية، يتم تحضير غراء الهيبتان عن طريق لف شريط لاصق مزدوج الوجه ووضعه في زجاجة سعة 100 mL.

أضف حوالي 50 milliliters من الهبتان، وأغلق الزجاجة بإحكام ورجّها لعدة أيام. قبل تحضير الأجنة، قم بإنشاء غرفة تجفيف توضع فيها الأجنة قبل الحقن. وللقيام بذلك، ضع جزءاً من طبق بقطر 35 millimeter داخل طبق بتري بقطر 100 millimeter لإنشاء منصة، ثم أضف مادة مجففة، وهي كبريتات الكالسيوم اللامائية، حولها بحيث لا يتجاوز ارتفاع المادة المجففة مستوى المنصة والغطاء.

لبدء تحضير الأجنة، قم أولاً بجمعها من القفص البحيري عن طريق تغيير طبق عصير العنب مع الخميرة كل ساعة؛ ويجب تصوير الأجنة بعد حوالي ساعتين من بدء عملية الجمع. ولتحضير شريحة التغطية، ضعها على أحد جانبي شريحة المجهر وثبت الزوايا الأربعة بشريط لاصق لضمان عدم تحركها. وباستخدام مسحة قطنية، ضع طبقة واحدة من غراء الهبتان على شكل خط فوق شريحة التغطية.

يجب ألا يكون الغراء لزجاً وأن يجف خلال ثوانٍ قليلة. وإذا كان كثيفاً جداً، أضف المزيد من heptane. وأخيراً، ضع قطعة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه على الشريحة بجانب الغطاء.

ضع مسحة باستخدام فرشاة مبللة. ارفع الأجنة بعناية من طبق عصير العنب وضعها على الشريط اللاصق مزدوج الوجه الموجود على الشريحة. بعد ذلك، استخدم طرف ملقط لدحرجة الأجنة فوق الشريط اللاصق مزدوج الوجه حتى ينفتح الغشاء السلوي.

التقط الجنين عن طريق دحرجته بلطف فوق سطح الكوريان حتى يلتصق بالملقط، ثم ضعه على غراء الهبتان الموجود على الشريحة الغطائية. مرر الشريحة بحيث يكون الجانب الطولي للجنين موازياً للجانب الطولي للشريحة الغطائية. ضع من 10 إلى 20 جنيناً في صف واحد.

قم بإزالة غطاء الشريحة ووضعه في غرفة التجفيف لمدة تتراوح من ثلاث إلى ثماني دقائق. يعتمد الوقت على الرطوبة المحلية والكمية المراد حقنها. بعد ذلك، ضع غطاء الشريحة على غرفة معدنية تحتوي على شحم تفريغ الهواء.

أخيرًا، قم بتغطية الأجنة بزيت الهالو كربون لتجنب المزيد من الجفاف. الأجنة الآن جاهزة للحقن. أولاً، حدد موقع الأجنة باستخدام عدسة شيئية بقوة 16 x.

حرك الأجنة بعيداً وحدد موقع الإبرة دون تغيير المستوى البؤري. قم بتوسيط الإبرة ثم حركها للأعلى دون تحريكها في اتجاه X أو Y. لفتح الإبرة، ضع حافة شريحة التغطية في مجال الرؤية، ولكن بعيداً عن موقع الإبرة.

ثم اخفض الإبرة إلى نفس المستوى البؤري. حرك غطاء الشريحة بحذر شديد حتى تلامس الإبرة وتؤدي إلى كسرها برفق. بعد ذلك، ارفع الإبرة للأعلى.

الآن، اجعل الأجنة تظهر في مجال الرؤية. أخفض الإبرة في الزيت، وتأكد من الحصول على قطرات سائلة جيدة من الإبرة. حرّك الجنين بثبات نحو الإبرة، وحقن قطرة داخل الجنين، ثم حرّك الجنين بعيداً.

بعد الانتهاء من حقن جميع الأجنة، تصبح جاهزة للفحص باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) مع عدسة شيئية بقوة 60 أو 100x. يجب أن يبدو الجنين الضابط مثل الذي يظهر في هذا المقطع. هذا جنين يعبر عن GFP tubulin و RFP histone تم تصويره بعدسة شيئية 100x باستخدام مجهر بؤري ذو قرص دوار (spinning disc confocal microscope).

الوقت الإجمالي الموضح هو ثماني دقائق. وتعد مخططات المسافة من القطب إلى القطب قابلة للتكرار بشكل كبير وتعتبر مقياساً موثوقاً للنجاح في أجنة المجموعة الضابطة. ويجب أن تبدو مثل تلك الموضحة هنا للدورات من 11 إلى 13.

يظهر في هذا المقطع جنين تحكم آخر، يعبر هذا الجنين عن KLP 61 FGFP وقد حُقن بـ r Domine tubulin. تم تصوير هذا الجنين أيضاً باستخدام عدسة شيئية بقوة 100 x على مجهر بؤري دوار (spinning disc confocal)، والمدة الزمنية الإجمالية هي سبع دقائق.

تم الحصول على هذا المقطع المرئي مباشرة بعد الحقن المجهري، حيث يظهر تدرج تركيز r Domine tubulin بوضوح في بداية المقطع. يمكن استخدام هذه الأجنة لدراسة تثبيط Klp 61 F بعد الحقن المجهري للأجسام المضادة لـ Klp 61 F. ونلاحظ هنا فقدان Klp 61 FGFP من المغازل.

لقد شرحنا لك للتو كيفية إجراء الحقن المجهري لأجنة ذبابة الفاكهة (drosophila) في المرحلة المقطعية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء الضوابط، والتدرب أولاً على حقن المحلول المنظم أو الروتين وحده، والتأكد من أن الانقسام الميتوزي يسير بشكل طبيعي عبر المراحل الخلوية. وبمجرد أن تصبح جميع عمليات الحقن موثوقة ولا تسبب أي ضرر، يمكنك حقن المثبط ودراسة تأثير ذلك التثبيط المحدد.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.