توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

مرحباً، أنا هيلاري كيمب من مختبر سيسيليا أوينز. وأنا سيسيليا أوينز. أنا وهيلاري نعمل في قسم العلوم الأساسية في مركز فريد هتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل.

سنقوم اليوم بعرض تقنية لصنع أجنة أسماك الزيبرا الخيمرية، والمعروفة أيضاً بالفسيفساء الجينية. يسمح لنا هذا الإجراء بتقييم الأساس الخلوي لوظيفة الجينات أثناء النمو. حيث يمكننا البحث فيما إذا كان جين معين يعمل داخل الخلايا ذات النمط الظاهري الطافر، وهو ما يعرف بالوظيفة ذاتية الخلية، أو داخل بيئة تلك الخلايا، وهو ما يعرف بالوظيفة غير ذاتية الخلية.

نقوم بإنشاء هذه الفسيفساء عن طريق نقل الخلايا بين أجنة من النوع البري أو أجنة طافرة، إما في مرحلة البلاستولا أو في مرحلة الجاسترولا المبكرة. ومن ثم نقوم بتقييم وظيفة الجينات من خلال مراقبة النمط الظاهري والنمط الجيني للخلايا المشتقة من المتبرع في بيئتها المضيفة. لذا، فلنبدأ.

في هذا الجزء من البروتوكول، يتم حقن صبغة السلالة في جنين المانح لتمكين تتبع مصير الخلايا المشتقة من المانح بعد عملية الزرع. كما يمكن حقن أي نوع من الأحماض النووية باستخدام هذه التقنية، ومع ذلك، يجب تخطي خطوة التزيين عند حقن DNA. قبل العمل مع الأجنة، قم بتجهيز طبق الحقن عن طريق وضع شريحة زجاجية بزاوية 45 درجة عبر الجزء الأوسع من طبق بتري، بحيث يكون مملوءاً إلى ثلاثة أرباعه بوسط جنيني يحتوي على 1.2%aros و pen strep.

قم بإزالة الشريحة بعد أن يتصلب الآجار لتكوين قناة مائلة. املأ القناة بوسط أجنة pen strep. انتقل الآن إلى مرحلة التزيين الإنزيمي للأجنة في مرحلة خلية واحدة.

يتم تحضين الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة لمدة تتراوح من دقيقة إلى خمس دقائق في محلول Pronase بتركيز 0.5 milligram per milliliter. يجب مراقبة عملية التفاعل بدقة.

بمجرد أن يبدأ الكوريون في الانهيار بشكل مرئي، اغمر الأجنة في مياه النظام. ثم قم بسكب كل الكوريون، مع بقاء الأجنة في الأسفل عند قاع منحنى البيكر. ومن المهم جداً ألا تلامس الأجنة سطح الماء مرة أخرى، وبذلك يكون معظمها قد تخلص من الكوريون، مع بقاء القليل منها تسبح في الخارج دون أن تُزال.

إذا كان أي من الأجنة لا يزال داخل الغشاء الكوريوني، فإن عملية السحب بالماصة بهذه الطريقة ستخرجها ثم تطلق الأجنة بحيث لا تلامس سطح الماء أبدًا. ومن المهم التعامل مع الأجنة المغطاة باستخدام ماصة تمت معالجتها بالصهر الناري لتنعيم حوافها. انقل الأجنة الهشة المغطاة بطبقة dec بلطف إلى حوض طبق الحقن باستخدام ماصة زجاجية ذات فتحة واسعة ومعالجة بالصهر الناري.

بعد ذلك، نقوم بتحميل ملف واحد في هذا الحوض. الآن أصبحت الأجنة جاهزة للحقن بعلامة السلالة باستخدام ماصة حقن زجاجية مسحوبة بدقة ومعايرة، وجهاز حقن بالضغط. سنستخدم طبقاً مملوءاً بوسط الأجنة لكسر الإبرة، وطبقاً مملوءاً بالزيت لمعايرة الإبرة.

هذا مجرد زيت معدني قياسي عادي من الدرجة المختبرية. نستخدم زوجاً من ملاقط الساعات المسنونة، وبينما ننظر عبر العدعيات لتحديد الحجم المناسب، نضع الملاقط على جانبي الإبرة ثم نقوم بكسر الشريحة برفق، وهو أمر لا يمكنني القيام به فعلياً دون النظر. وذلك لتحديد حجم الصبغة أو الريبونوكليوتيد الذي سيتم توصيله قبل البدء.

قم بقياس حجم البولس (bolus) في طبق يحتوي على زيت معدني. يجب كسر الإبرة بحيث يتم توصيل بولس بحجم 1 nanoliter بنبضة واحدة أو نبضتين من المحقن الدقيق. يمكن حساب حجم البولس من خلال قطره الذي يتم قياسه بواسطة ميكرومتر العدسة العينية.

احقن 1 nanoliter من محلول الديكستران الفلوري بتركيز يتراوح بين 1 إلى 3% مباشرة في صفار الأجنة المغلفة بين مرحلتي الخلية الواحدة والأربع خلايا. ما سأقوم به هو وضع الجنين مباشرة تحت الإبرة، ثم سأغرز الإبرة بلطف في مركز الصفار وأضغط على دواسة القدم.

عند الحقن، من المهم الحقن في تيارات المح، بحيث يتم نقل الصبغة إلى الخلايا. سيكون هذا الحقن كافياً لتتبع الخلايا في الأجنة الخيمرية خلال عدة أيام من التطور. ومن الناحية المثالية، نقوم بذلك قبل أن تصل الخلايا إلى مرحلة الخلايا الأربع. يتم تربية الأجنة المحقونة بكثافة منخفضة في طبق بتري مطلي مملوء بوسط جنيني طازج يحتوي على البنسلين والستربتومايسين.

لاحظ أن الأجنة المحقونة تميل إلى امتلاك معدل نمو أبطأ قليلاً، لذا يتم تحضين الأجنة في درجات حرارة مختلفة، 25 و28 و31 درجة Celsius، وذلك لتعطيل توقيت نموها بالتتابع وزيادة النافذة الزمنية التي يمكن خلالها إجراء عمليات الزرع. يتكون الجهاز المستخدم لزراعة الخلايا في مرحلة البلاستولا لسمكة الزيبرا من حقنة Hamilton يتم التحكم في دفعها، متصلة عبر صنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات بخزان من الزيت المعدني وبحامل للماصة الدقيقة من خلال طول من الأنابيب المرنة. يجب التخلص من جميع فقاعات الهواء من النظام لأنها ستؤثر سلباً على قدرتك على التحكم في الشفط والضغط.

استخدم مجهراً ستيريو يتميز ببصريات عالية الجودة وبقوة تكبير لا تقل عن DX. وللتحكم في وضع حامل الماصة الدقيقة والإبرة، نقترح استخدام جهاز مناولة دقيقة يدوي من نوع NARA shige. تأكد من تثبيته على طاولة العمل باستخدام قاعدة مغناطيسية لمنع انتقال الاهتزازات إلى العينة المزروعة.

تُصنع إبر الزرع من ماصات شعرية زجاجية يتم سحبها لتشكيل استدقاق تدريجي باستخدام قطب كهربائي. راجع بروتوكول JoVE من مختبر ميريام جودمان للحصول على تفاصيل حول سحب الماصات تحت مجهر تشريحي، ثم يتم كسر طرف الإبرة المسحوبة. بالنسبة لعمليات الزرع في مرحلة البلاستولا، يجب أن يتراوح القطر الخارجي للإبرة بين 50 إلى 60 microns تقريبًا، أو من 30 إلى 40 microns لعمليات النقل في مرحلة الجاسترولا.

لإجراء عملية نقل في مرحلة المعدة لتحسين الاختراق، يجب أولاً سحب شوكة حادة عند طرف الإبرة باستخدام فرن دقيق (micro forge)، ثم تنعيم طرف الإبرة عبر تقريبه من فتيل الفرن الدقيق. بعد ذلك، يتم تدوير الإبرة بحيث تلامس الحافة الأمامية للشطب الفتيل. وبمجرد ملامسة الحافة الأمامية للإبرة للفتيل، يتم سحبها بسرعة لتكوين الشوكة.

لتجنب إتلاف الخلايا، يجب أن تكون الشوكة مستقيمة وألا يكون طرف الإبرة منحنياً. بعد تجهيز المنصة وإبر الزرع، تصبح مستعداً لإنتاج أجنة خيمرية. تُستخدم عمليات زرع مرحلة البلاستولا لنقل الخلايا بين الأجنة عندما لا تكون هناك حاجة إلى معلومات دقيقة حول خريطة المصير الخلوي. وباستثناء الخلايا الجرثومية الأولية، فإن معظم الخلايا عموماً لا تكون ملتزمة بمصير محدد في هذه المرحلة.

تكون خريطة المصير في مرحلة البلاستولا بحيث يمكننا التمييز بين الخلايا التي ستعطي منشأً للأديم الظاهر والخلايا التي ستعطي منشأً للأديم المتوسط. تقع الخلايا السلفية للأديم المتوسط والأديم الباطن بالقرب من حافة الجنين في مرحلة البلاستولا، بينما تقع الخلايا السلفية للأديم الظاهر، التي ستعطي منشأً للجهاز العصبي وبشرة السطح، بعيداً عن حافة الجنين. لذا، عندما نقوم بنقل الخلايا إلى أجنة في مرحلة البلاستولا، يمكننا توجيه تلك الخلايا إلى منطقة الأديم المتوسط المفترضة أو إلى منطقة الأديم الظاهر المفترضة.

لكن لا يمكننا توجيه الخلايا إلى أي منطقة محددة من الأديم الظاهر أو الأديم المتوسط لأننا لا نعرف ذلك. في مرحلة البلاستولا حيث يكون الجانب الظهري للجنين، قم بتجهيز أطباق الحقن مسبقاً عن طريق تعويم قالب بلاستيكي يحتوي على صفوف مزدوجة من النتوءات الإسفينية في طبق بتري مملوء إلى النصف بـ 1.2% agar المصهور في وسط جنيني. وبمجرد أن يتصلب الـ agar، قم بإزالة القالب لتترك صفوفاً من الآبار مثلثية الشكل، بحيث يكون كل بئر كافياً بالكاد لاستيعاب جنين واحد.

املأ قالب الزرع بوسط أجنة يحتوي على البنسلين والستربتومايسين، ثم ضع أجنة في مرحلة البلاستولا بشكل فردي في كل بئر باستخدام ماصة زجاجية مصقولة باللهب. انقل الأجنة الآن إلى آبار الزرع مع السماح لها في البداية بالاستقرار على جانبها. رتب الأجنة بحيث توضع أجنة المانح في عمود واحد وأجنة المضيف في العمود المجاور.

ضع الطبق على المنصة بحيث عندما تخترق إبرة النقل الجنين، تدفعه الإبرة باتجاه الجدار الخلفي للفجوة الموجود بها. وباستخدام جهاز التحكم الدقيق، أنزل إبرة النقل في الطبق بزاوية حادة إلى حد ما. ومن المثالي أن تخترق إبرة النقل الجنين بزاوية 45 درجة تقريبًا.

بمجرد أن يصبح طرف الإبرة تحت سطح وسط الأجنة، اسحب كمية صغيرة من وسط الأجنة إلى داخل الإبرة عن طريق تدوير محرك الميكرومتر الذي يتحكم في سرنجة Hamilton. ولتحقيق أدق تحكم، يجب أن يظل السطح الفاصل بين الزيت المعدني ووسط الأجنة في الجزء المستدق الرفيع من الإبرة، وليس قريباً جداً من الطرف. قم بتوجيه الجنين المانح بلطف باستخدام الإبرة، ثم اسحب الإبرة للخلف وأدخلها في غطاء البلاستولا للجنين عند الموضع المطلوب.

ستؤدي ضربة سريعة وقوية إلى اختراق الجنين دون التسبب في تدحرجه. اسحب الخلايا المانحة ببطء وعناية إلى داخل الإبرة لتجنب تمزيق الخلايا. تجنب سحب مح الصفن إلى داخل الإبرة بعد سحب العدد المطلوب من الخلايا.

اعكس الضغط قليلاً لإيقاف عملية السحب ثم اسحب الإبرة لوضع الجنين المضيف في الموضع المناسب. ومن خلال تحريك طبق الزرع، يمكن إجراء تعديلات طفيفة على وضع الجنين المضيف عبر تدويره بلطف باستخدام إبرة الزرع، مع الحرص التام على عدم لمس المح. وعند دفع الخلايا المانحة إلى الجنين المضيف، تجنب سحب أي من المح إلى داخل الجنين لأن ذلك سيؤدي إلى تلف وقتل الخلايا المانحة؛ ويمكن زرع الخلايا من جنين مانح واحد في عدة مضيفين بعد اكتمال عمليات نقل الخلايا.

انقل أزواج المانح والمضيف إلى الآبار المطلية في طبق يحتوي على 24 بئرًا لمتابعة عملية التطور. الاستثناء الوحيد للقاعدة التي تنص على أن الخلايا لا تكون ملتزمة بمصائر محددة في مرحلة البلاستولا هي الخلايا الجرثومية البدائية. يتم تحديد الخلايا الجرثومية البدائية في وقت مبكر جدًا من التطور وتكون ملتزمة بمصير حالتها كخلايا جرثومية بدائية.

تستقر الخلايا الجرثومية الأولية في مرحلة مبكرة جداً بالقرب من حافة البلاستولا والجنين في مرحلة الجاسترولا. لذا، إذا كان الهدف من تجربة الزرع هو نقل الخلايا الجرثومية الأولية، فمن المهم جداً تحديد مكان مصدر هذه الخلايا في الجنين المانح، بينما لا يهم مكان استقرارها في الجنين المضيف. أما القاعدة بالنسبة للخلايا الجسدية، فهي أن مكان استقرارها في الجنين المضيف هو الذي يحدد مصيرها.

أما في حالة الخلايا الجرثومية البدائية، فمن المهم معرفة مصدرها في جنين المتبرع لأن مصيرها يكون محدداً بالفعل. فإذا كان الهدف هو نقل الخلايا الجرثومية البدائية، فعندئذٍ يجب سحب هذه الخلايا من حافة جنين المتبرع، وهي تقع بالقرب من حافة الجنين في أربع مجموعات صغيرة، تحتوي كل منها على ثلاث أو أربع خلايا في مرحلة التوتيا أو مرحلة التطور المبكرة هذه. ويجب سحبها بحذر شديد لتجنب شفط المح، عن طريق الخطأ.

حسناً، هذا ما قمتُ به، وأنتقل الآن إلى جنين مضيف. ستتوجه الخلايا الجرثومية البدائية الآن نحو منطقة العرف التناسلي في أي جنين توضع فيه. لذا، لا داعي لنقل هذه الخلايا الجرثومية البدائية إلى الحافة، فهي ستصل إلى هناك بنفسها.

لذا، سأقوم بمجرد نقل الخلايا وإعادتها إلى أي مكان في الجنين بعد مرحلة التكون. إن المفتاح لعمليات نقل الخلايا الجنسية، وهو أمر معاكس تماماً لأي نوع آخر من عمليات النقل، هو أن مصدر الخلايا المانحة يشكل أهمية كبيرة. إذ يتيح نقل الخلايا إلى مضيف في مرحلة التكون المعدي الباحث من الاستفادة من خريطة مصير سمكة الزيبرا التي تظهر عندما يصبح الدرع الجنيني مرئياً.

يصبح من الممكن تمييز أنواع الأنسجة المختلفة بالإضافة إلى النطاقات الموجودة داخل الجهاز العصبي المركزي المفترض. عند نقل الخلايا بين الأجنة في مرحلة الجاسترولا، تكون هناك بعض الاختلافات في البروتوكول، ولكن الإجراء العام مشابه للعمل مع البلاستولا لتثبيت الجاسترولا. أولاً، يتم وضع شريط رأسي من Methylcellulose في تجويف شريحة زجاجية مجوفة، ثم يُغمر بكمية وفيرة من وسط أجنة pen strep باستخدام ماصة نقل مصقولة بالنار.

يتم نقل متبرع واحد وثلاثة مضيفين في مرحلة الدرع (shield stage) إلى شريحة التثبيت. يتم اختيار أجنة متبرعة تكون أصغر سناً بقليل من الأجنة المضيفة. يتطلب التعامل مع غراء الجاسترولا أداة جديدة، وهي عبارة عن إدخال طرفي قطعة قصيرة من خيط صيد مختبر بوزن 2 رطل في نهاية أنبوب شعري.

وبذلك يتم تكوين حلقة صغيرة. استخدم الحلقة لدحرجـة الأجنة المانحة والمستقبلة برفق إلى أعلى شريط الـ Methylcellulose، ثم ادفعها لأسفل داخل الـ Methylcellulose حتى تستقر. قم بدحرجتها بحيث تكون المنطقة المستهدفة في الأعلى.

بما أن الإبرة ستدخل الجنين بشكل مماسي أثناء عملية الزرع لإيصال الخلايا المانحة دون إتلاف الـ ylk، فمن الأفضل إجراء عمليات الزرع في مرحلة الـ Gastro باستخدام مجهر مركب ذو منصة ثابتة. استخدم أدوات التحكم في الملاعب الدقيق (micro manipulator) لضبط تركيز طرف إبرة الزرع.

ضع حامل الماصة الدقيقة والإبرة بزاوية ضحلة إلى حد ما، بحيث تكون الإبرة في أقرب وضع أفقي تسمح به حافة التجويف الموجود على الشريحة. بعد ذلك، قم بثقب الجنين المانح. وإذا كان مثبتًا بشكل صحيح، فلن يتدحرج عند دخول إبرة النقل، إلا إذا كان الجنين مسنًا جدًا بحيث لا تسمح حالته باختراق الإبرة له بسهولة.

لتجنب ثقب المح، يجب أن تدخل الإبرة في الجنين عند مستوى بؤري يكون أعمق قليلاً من مستوى EDL. وبمجرد الثقب، يمكن سحب عدد كبير من الخلايا من المتبرع لإجراء ما يصل إلى ثلاث عمليات حقن في الخلايا المضيفة. وعند سحب الخلايا، تجنب سحب المح عن طريق تحريك الإبرة أثناء سحب الخلايا إذا رغبت في ذلك.

يمكن جمع أجنة إضافية للحصول على المزيد من الخلايا باستخدام الإبرة نفسها قبل حقن الخلايا في المضيف، وأثناء عملية حقن الخلايا في الجنين المضيف، يتم دفع الخلايا بينما يتم سحب الإبرة عبر المنطقة المستهدفة، بدلاً من ترسيب الخلايا في كتلة واحدة. سيزيد هذا من احتمالية مساهمة الخلايا المانحة في تكوين النسيج المطلوب. وبمجرد اكتمال عمليات نقل الخلايا، توضع الشريحة بأكملها في طبق بتري ويتم غمرها بعناية في وسط pen strep embryo.Medium.

خلال الساعات القليلة القادمة، ستذوب مادة الميثيل سليلوز مما يؤدي إلى تحرير الأجنة. ويعتمد عدد الخلايا التي يتم نقلها على الهدف المحدد من التجربة. ويمكن نقل الخلايا من متبرع واحد إلى ثلاثة أو أربعة مضيفين في صباح اليوم التالي لعملية الزرع.

يمكن فحص المضيفين لتحديد ما إذا كان استهداف الخلايا المانحة قد تم بنجاح. تؤدي عملية الزرع الناجحة للخلايا الجرثومية الأولية من مرحلة البلاستولا إلى ظهور خلايا معلمة فلوريسنتياً، متمركزة ظهرياً بالقرب من الوصلة بين الـ ylk وامتداد الـ ylk. وبذلك نكون قد أوضحنا لكم كيفية إجراء عمليات الزرع في مرحلتي الجاسترولا والبلاستولا.

عند تنفيذ هذه التقنية، من المهم اختيار النوع المناسب من طريقة الزرع للنسيج المستهدف الذي ترغب في استهدافه بخلاياك. لذا، فإن الزرع في مرحلة البلاستولا كافٍ لتحديد ما إذا كانت الخلايا تتوجه إلى الأديم المتوسط مقابل الأديم الظاهر. ويمكنك أيضاً استخدام هذه التقنية لاستهداف الخلايا الجرثومية الأولية.

إذا كنت ترغب في إجراء تخطيط أدق، فمن الأفضل استخدام طعم لجنين في مرحلة Gastros حيث يكون الجانب الظهري قد تحدد بالفعل. وبذلك، يمكنك باستخدام هذه التقنية استهداف الخلايا في أجزاء مختلفة من الجهاز العصبي، وبشكل خاص الدماغ الأمامي، والدماغ المتوسط، والدماغ الخلفي والنخاع الشوكي. هذا كل شيء.

شكراً جزيلاً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في جميع تجاربكم.