أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

مرحباً، أنا بروس دريبر من جامعة كاليفورنيا ديفيس، قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية، وأنا سيسيليا مونس من قسم العلوم الأساسية في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل. سنقوم اليوم، أنا وسيسيليا، بشرح بروتوكول الحفظ بالتجميد لنطاف سمك الزيبرا، وهو نسخة معدلة من بروتوكول برايان هارفي الأصلي. سنوضح لكم أنه من خلال العمل في فرق مكونة من شخصين، يمكن حفظ نطاف 100 ذكر بشكل فردي بالتجميد في أقل من ساعتين.

بينما يوجد نطاق واسع من الخصوبة عند الإذابة، فإننا نحصل في المتوسط على خصوبة بنسبة 25%، وهذا من مكتبة تم حفظها بالتجميد لأكثر من سبع سنوات. لذا، فلنبدأ. قبل تنفيذ هذا الإجراء، قم أولاً بتحضير محاليل تجميد الحيوانات المنوية.

يتم تحضير محلول جينسبورج رينجر للأسماك طازجاً كل ثلاثة أيام، بينما يتم تحضير وسط التجميد طازجاً وبشكل يومي، مع وبدون إضافة الميثانول. يمكن العثور على تركيب هذه المحاليل في المعلومات التكميلية المتاحة عبر الإنترنت والمرفقة بهذا البروتوكول. يمكن أن تؤثر المواد المستخدمة في هذا الإجراء على معدل التجميد والإذابة، وهو ما قد يؤثر بدوره على خصوبة الحيوانات المنوية المجمدة.

لهذا السبب، تم توفير قائمة بالمواد الموصى بها كمعلومات إضافية عبر الإنترنت. ويُفضل تجميد الحيوانات المنوية باستخدام الثلج الجاف المسحوق ناعماً بدلاً من حبيبات الثلج الجاف. ومن الطرق البسيطة لسحق الثلج الجاف لفه في منشفة ثم تفتيته باستخدام مطرقة.

تتمثل الطريقة الأكثر كفاءة في استخدام مطحنة الثلج الجاف، مثل طراز claws and model RE two، لتجميد نطاف أسماك الزيبرا. أولاً، قم بتمييز أنابيب شعيرية سعة 10 µL باستخدام قلم مختبري عند مستوى 3.33 µL أو حوالي 16.7 mm من القاع. ولتخدير الذكور، ضع من اثنين إلى أربعة ذكور في دورق يحتوي على محلول trica المخفف في مياه الأسماك. يمكن العثور على التركيبة في كتاب أسماك الزيبرا.

بمجرد تخدير الأسماك، ارفعها من المخدر باستخدام ملعقة بلاستيكية وجففها برفق عن طريق التربيت عليها بمناديل ورقية. أولِ اهتماماً خاصاً بتجفيف الجانب البطني. بما أن الماء ينشط الحيوانات المنوية، فمن الضروري تجفيف المنطقة المحيطة بفتحة المذرق تماماً.

ضع السمكة على حامل الإسفنج بحيث يكون الجانب البطني للأعلى. إذا كانت المنطقة المحيطة بالزعانف الحوضية لا تزال رطبة، جففها برفق باستخدام منديل Kim wipe. ضع الأنبوب الشعري المحدد في محول ماصة فموية مطاطي مرفق مع الأنابيب الشعرية.

المحول عبارة عن خرطوم مطاطي يحتوي على قطعة فموية في أحد طرفيه وحامل للشعيرة في الطرف الآخر. بدلاً من ذلك، يمكن توصيل الأنبوب الشعيري بمحقنة هاميلتون سعة 50 microliter. وباستخدام قطعة قصيرة من أنابيب "تيجون" ذات القطر المناسب، ضع الذكر تحت المجهر واكشف عن الفتحة البولية التناسلية عن طريق مباعدة الزعانف الحوضية بعناية.

باستخدام طرف الأنبوب الشعري، قم باستخراج الحيوانات المنوية عن طريق مسح جانبي السمكة برفق باستخدام ملقط ناعم، أو عن طريق الضغط برفق على جانبي السمكة باستخدام إصبعي السبابة والإبهام، ثم اجمع الحيوانات المنوية في أنبوب شعري أثناء خروجها باستخدام شفط خفيف. تجنب البراز الذي قد يخرج مع الحيوانات المنوية. الحجم المستهدف من الحيوانات المنوية هو 3.3 microliters.

تختلف أقل كمية مقبولة من الحيوانات المنوية بناءً على جودتها؛ حيث تكون الحيوانات المنوية الجيدة بيضاء ومعتمة، بينما تبدو الحيوانات المنوية الفقيرة مائية. وبشكل عام، فإن الحد الأدنى المقبول من الحيوانات المنوية هو 1 µL من الحيوانات المنوية الجيدة أو ثلث الكمية المستهدفة، و 2 µL من الحيوانات المنوية الفقيرة أو ثلثي الكمية المستهدفة.

إذا لم يصل حجم الحيوانات المنوية إلى الحجم المستهدف وهو 3.3 microliters، فمن الضروري ضبط الحجم ليصل إلى علامة القلم باستخدام وسط التجميد الخالي من الميثانول. أما إذا كان حجم الحيوانات المنوية قد وصل بالفعل إلى علامة القلم على الأنبوب الشعري أو تجاوزه، فيتم الانتقال إلى الخطوة التالية. الآن، قم بإضافة المادة الواقية من التجميد إلى الحيوانات المنوية.

اسحب وسط التجميد المحتوي على الميثانول حتى العلامة البرتقالية. الحجم الإجمالي التقريبي الآن هو 20 microliters. أفرغ خليط الحيوانات المنوية والمادة الواقية من التجمد على منطقة نظيفة من زجاجة الساعة، واخلطها برفق عن طريق السحب والطرد بالماصة حوالي أربع مرات مع تجنب إدخال فقاعات هوائية.

قم بتجزئة الحيوانات المنوية إلى أنبوبي تجميد عن طريق نقل 10 µL من محلول الحماية من التجميد الخاص بالحيوانات المنوية إلى قاع كل أنبوب مُسمى. قم بتغطية الأنابيب بسرعة ثم ضع كل أنبوب تجميد في أنبوب فالكون سعة 15 mL منفصل. وفي درجة حرارة الغرفة، أغلق أنابيب الفالكون وأدخلها في ثلج جاف مسحوق بدقة.

يجب إدخال الأنابيب بعمق كافٍ بحيث تظهر الأغطية فقط لتسهيل تتبع أنابيب فالكون. قم بترقيمها وتسجيل الوقت الذي وُضع فيه كل أنبوب في الثلج الجاف. اترك الحيوانات المنوية تتجمد في الثلج الجاف لمدة 20 دقيقة.

بعد تجميد الحيوانات المنوية، انقل الأنبوبين المبردين إلى دورق يحتوي على النيتروجين السائل. للتخزين المؤقت، ضع صندوق التجميد في حمام من النيتروجين السائل لضمان عدم ارتفاع درجة حرارة العينات.

استخدم ملاقط معدنية طويلة لاستخراج الأنابيب من دورق ديوار، وتناولها باستخدام قفازات التجميد العميق. وبدلاً من ذلك، يمكن نقل أنابيب التجميد العميق مباشرة من الثلج الجاف إلى المجمد. أما إذا كان صندوق التجميد محفوظاً مغموراً في النيتروجين السائل داخل حاوية من البوليسترين للتخزين طويل الأمد، فضع أنابيب التجميد العميق في مجمد النيتروجين السائل المخصص للتجميد العميق.

للحفاظ على حيوية الحيوانات المنوية، من الضروري تخزين القوارير مغمورة في النيتروجين السائل، حيث أن القوارير المخزنة في الطور البخاري قد تفقد حيويتها بمرور الوقت. كما تعد السرعة عاملاً حاسماً في الحفاظ على حيوية الحيوانات المنوية؛ لذا يجب ألا يتجاوز الوقت الفاصل بين إضافة المادة الواقية من التجميد ووضع قوارير الحيوانات المنوية على الثلج الجاف 30 ثانية في عملية الإخصاب المختبري.

يُفضل استخدام الحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد بواسطة شخصين؛ حيث يقوم أحدهما باستخراج البويضات من الإناث، بينما يقوم الآخر بإذابة الحيوانات المنوية. اضبط الحمام المائي على درجة حرارة 33 °C.

أخرج أنبوبة تجميد من مجمّد النيتروجين السائل وانقلها إلى وعاء أو قارورة تحتوي على النيتروجين السائل حتى يحين وقت الإذابة. اعصر البيض من الإناث المخدرة في طبق بتري بلاستيكي بقطر 35 مليمتر. تم وصف هذه العملية بالتفصيل في بروتوكول JoVE الذي يحمل عنوان Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure، والذي يقدم وصفاً تفصيلياً لأسماك الزبرا.

في عملية الإخصاب المختبري، تحتوي المجموعة الجيدة من البيوض على أكثر من 150 بيضة متجانسة وذات لون مائل للاصفرار. ويشير وجود أي بقايا بيضاء إلى حدوث تحلل. إذا كان ذلك ممكناً، حاول الحصول على ثلاث مجموعات من البيوض ودمجها في طبق واحد.

إذا لم يتم الحصول على ثلاث مجموعات جيدة من الحيوانات المنوية في غضون دقيقة واحدة من المجموعة الأولى، فانتقل إلى الخطوة التالية. أبقِ الطبق مغطى أثناء إذابة الحيوانات المنوية. في هذه الأثناء، أخرج القارورة من النيتروجين السائل وانزع الغطاء.

اغمر الأنبوب بسرعة حتى منتصفه في حمام مائي عند درجة حرارة 33 °C لمدة تتراوح بين 8 إلى 10 ثوانٍ. أضف بسرعة 70 µL من محلول ملح هانكس المنظم (Hank's buffered salt solution) في درجة حرارة الغرفة إلى الأنبوب، واخلطه عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم أضفه فوراً إلى البيوض في طبق بيتري واخلط بلطف باستخدام رأس الماصة. بعد ذلك، قم بتنشيط الحيوانات المنوية والبويضات فوراً بإضافة 750 µL من مياه الأسماك، ثم قم بالتدوير للمزج والتحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور خمس دقائق، املأ الطبق بالأسماك والماء، ثم قم بالتحضين عند 28 درجة مئوية. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات، قم بعدّ ونقل الأجنة القابلة للحياة إلى أطباق بحجم 100 مليمتر، بمعدل 50 جنيناً لكل طبق. قم أيضاً بعدّ البيض المخصب بحيث يمكن تحديد خصوبة عينة الحيوانات المنوية.

تتمثل خصوبة الحيوانات المنوية في نسبة الأجنة القابلة للحياة إلى العدد الإجمالي للبويضات التي استُخدمت في عملية الإخصاب في المختبر. يمكن فرز البويضات في أي وقت يتراوح من ساعتين إلى ست ساعات بعد عملية الإخصاب في المختبر. وعندما يكون من السهل تمييز البويضات غير الخصبة عن الأجنة القابلة للحياة، تظهر البويضات غير الخصبة شفافة وغير منقسمة.

عند الفحص باستخدام الإضاءة النافذة (trans illumination) تحت مجهر ستيريو، تتفاوت متوسطات خصوبة الحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد بشكل كبير. ومع ذلك، ينبغي أن يكون من الممكن تحقيق متوسط خصوبة بنسبة 25% يظل مستقراً لعدة سنوات. يوضح هذا الرسم البياني متوسط النسبة المئوية لخصوبة الحيوانات المنوية المجمدة بين عامي 2001 و2003 والتي تم فحصها في وقت قريب من عام 2008.

لقد استعرضنا للتو طريقة عالية الإنتاجية للحفظ بالتجميد لنطاف أسماك الزيبرا. عند تنفيذ هذا البروتوكول، من المهم استخدام جميع الأدوات البلاستيكية والمعدات الموصى بها، بالإضافة إلى استخدام الثلج الجاف المسحوق بدلاً من حبيبات الثلج الجاف. من الضروري استخدام نطاف وبويضات عالية الجودة، وفي حالة البويضات عند إجراء الإخصاب في المختبر بعد إذابة النطاف، من المهم استخدام أكبر عدد ممكن من البويضات لزيادة عدد الأجنة الخصبة التي يتم الحصول عليها في النهاية، وهو ما قد يتطلب ثلاث إلى أربع إناث، أليس كذلك؟

ثمة عنصر رئيسي آخر في البروتوكول وهو السرعة؛ إذ يجب ألا تستغرق العملية أكثر من دقيقة تقريبًا منذ لحظة استخراج الحيوانات المنوية من الذكر وحتى وضعها في الثلج الجاف. حسنًا، أعتقد أن هذا كل شيء.

بالتوفيق في تجاربكم.