التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

مرحباً، أنا أندريا بالبو. أعمل في مجموعة بيتر شوكس في المعاهد الوطنية للصحة. سنقوم في هذا الفيديو بشرح إجراءات تجميع وتحميل ومحاذاة الدوار لخلية عينة في جهاز الطرد المركزي الفائق التحليلي.

لنبدأ الآن. إليكم مكونات خلية عينة جهاز الطرد المركزي الفائق التحليلي. توجد داخل غلاف الخلية قطعة مركزية من مادة الإيبون بقطاع مزدوج ومجال فحم مقاس 12 مليمتر، والتي ستوضع بين مجموعتين من النوافذ. وتتكون كل مجموعة نافذة من حشية النافذة، وبطانة النافذة، ونافذة مثبتة داخل حامل النافذة.

سيتم بعد ذلك إنزلاق هذه القطع داخل مبيت الخلية عن طريق محاذاة مجاري المفاتيح الخاصة بها مع المفتاح الموجود داخل أسطوانة المبيت، ثم وضع حشية المبيت، وإغلاق خلية العينة باستخدام حلقة لولبية بضغط عزم يتراوح بين 120 و 140 inch pounds. بعد تحميل العينة، يتم استخدام حشيتي سدادة المبيت وختم سدادة المبيت لإغلاق فتحات التحميل في الخلية لتجنب ظهور شوائب في المسح، أو حدوث تسريبات، أو كسر أثناء التجارب؛ ومن الضروري أن تكون جميع المكونات نظيفة وجافة وخالية من الغبار وفي أفضل حالة ممكنة، ويجب فحصها بشكل متكرر واستبدالها عند الضرورة. ستحتاج أيضاً إلى ما يلي: جهاز طرد مركزي فائق تحليلي (analytical ultracentrifuge)، ودوار تيتانيوم رباعي الفتحات، وميزان مختبري، ومفتاح عزم مزود بمقياس قابل للقراءة وقاعدة عزم، وثقل موازن وأوزان موازنة، ومفك براغي مسطح الرأس، وملقط، وماصة سعة 200 µL مزودة بطرف ماصة طويل ومستدق، وأدوات محاذاة، ومزلق للطلاء الدوراني.

نبدأ بإنشاء خلية العينة من خلال تجميع مجموعتين من النوافذ. أولاً، ضع حاشية النافذة في الجزء السفلي من حامل النافذة. بعد ذلك، قم بوضع بطانة النافذة، والتي تسمى أحياناً وسادة النافذة، داخل حامل النافذة بحيث تكون فتحة البطانة مقابلة لمجرى تعشيق الحامل وبزاوية طفيفة.

بعد ذلك، ضع النافذة في الحامل، مع محاذاة علامة التحديد الموجودة على النافذة مع المجرى الرئيسي لحامل النافذة. اضغط لأسفل برفق عند الحواف القصوى على كلا جانبي النافذة. ولضمان الإحكام المناسب والضبط الدقيق لخلية العينة، نقوم بطلاء حشية المبيت في الحلقة اللولبية بطبقة خفيفة.

باستخدام مادة تزليق الطلاء الدوراني، وزع كمية صغيرة جداً من مادة الطلاء الدوراني بين إبهامك وسبابتك. غلف سنون الحلقة اللولبية بطبقة رقيقة وغير مرئية من مادة الطلاء الدوراني. وبالمثل، غلف حشية المبيت.

امسح أي مادة تشحيم مرئية. لبدء تجميع خلية العينة، قم بإزلاق إحدى مجموعات النوافذ، بحيث تكون النافذة مواجهة للأعلى باتجاهك، داخل مبيت الخلية من خلال محاذاة المجرى الرئيسي مع مفتاح المبيت.

قم بمحاذاة مجرى مفتاح القطعة المركزية مع مفتاح المبيت، واتركها تسقط برفق فوق مجموعة النافذة داخل المبيت. لا تستخدم أبداً أي نوع من الأدوات لدفع القطعة المركزية داخل مبيت الخلية، لأن ذلك قد يتسبب في تلف دائم للقطعة المركزية، مما يؤدي إلى حدوث تسريبات في التجارب المخزنة.

أدر تجميعة النافذة الثانية بحيث تكون النافذة مواجهة للقطعة المركزية وبعيدة عنك. قم بمحاذاة المجرى مع مفتاح المبيت، ثم مرره لأسفل فوق القطعة المركزية. ضع حاشية المبيت في الأعلى.

ثم يتم وضع حلقة لولبية بحيث تكون كلمة out ظاهرة، وذلك باستخدام الأصابع. بعد ذلك، وباستخدام أداة المحاذاة، يتم ربط الحلقة اللولبية يدويًا.

في بعض الأحيان، قد لا ينزلق الجزء المركزي بسهولة داخل أسطوانة المبيت. يمكنك محاذاته أولاً، ثم وضع مجموعة النافذة الثانية فوقه، مع تطبيق ضغط خفيف إلى الأسفل على مجموعة النافذة.

يمكنك إدخال كليهما في مبيت الخلية في وقت واحد. وبهذه الطريقة، نتجنب الضغط مباشرة على القطعة المركزية. هذا هو الوقت المناسب لفحص الخلية بحثاً عن الغبار أو الوبر أو بصمات الأصابع.

ستلاحظ أيضاً ظهور حلقات نيوتن التي تشير إلى وجود هواء بين القطعة المركزية والنوافذ. ستختفي هذه الحلقات بعد الربط باستخدام حلقة اللولب حتى يصبح لفظ "out" مرئياً. ضع خلية العينة بالكامل في الأسفل داخل الخلية.

قم بتركيب الخلية في ظرف حامل العزم. ثبت الخلية في مكانها عن طريق تطبيق ضغط مستمر على مقبض حامل العزم. وفي حركة واحدة مستمرة، قم بربط الحلقة اللولبية بعزم يتراوح بين 120 و140 inch pounds.

حرر مقبض حامل عزم الدوران وأزل خلية العينة بعناية. نقوم عادةً بتحميل حجم 400 µL في كل قطاع من القطعة المركزية قياس 12 mm. باستخدام ماصة 200 µL، ضع خلية العينة بحيث تكون فتحات التحميل في الأعلى وكلمة out ظاهرة على الحلقة اللولبية.

أدخل طرف الماصة حتى المنتصف في قطاع المركز الأيسر عبر فتحات التحميل، ثم قم بتفريغ 200 µL من المحلول المرجعي ببطء. كرر العملية مرة واحدة ليصل الإجمالي إلى 400 µL باستخدام طرف الماصة نفسه وباتباع ذات التقنية بعناية وبطء. املأ قطاع المركز الأيمن بـ 400 µL من محلول العينة.

من الضروري مطابقة أحجام المحاليل المرجعية ومحاليل العينات بدقة قدر الإمكان. إن تركيب طرف الماصة بإحكام على الماصة، وسحب وتفريغ المحاليل ببطء، وتجنب تكون فقاعات أثناء السحب، واستخدام طرف الماصة نفسه لكلا المحلولين، كلها إجراءات تساعد في الحفاظ على تساوي الأحجام لإغلاق الخلية.

ضع حاشيتين لسدادة الهيكل باللون الأحمر بإحكام في كل فتحة تحميل، مع التأكد من وضعهما بعناية بين القطعة المركزية والهيكل المصنوع من الألومنيوم. قم بتغطية كل فتحة تحميل بسدادة هيكل وأحكم ربطها يدويًا باستخدام مفك براغي صغير برأس مسطح. قبل تحميل الدوار، تأكد من أن وزن ثقل الموازنة والخلية التي ستكون مقابلة لثقل الموازنة متقاربان بفرق لا يتجاوز 0.5 grams.

ابدأ بضبط الميزان عند الصفر. أولاً، زن خلية العينة التي ستوضع في الموضع المقابل للثقل الموازن. قم بتصفير الميزان لطرح وزن خلية العينة.

ثم قم بوزن ثقل الموازنة. نجد هنا أن ثقل الموازنة أخف من خلية العينة بمقدار 4.193 grams. اختر ثقلاً للموازنة بوزن أربعة grams وقم بربطه في فتحة تثبيت ثقل الموازنة، مع التأكد من عدم بروزه من الأعلى.

قم بوزن الثقل الموازن للتأكد من أن الوزن النهائي ضمن نطاق 0.5 grams. وباستخدام دوّار ذي أربعة ثقوب، ضع الثقل الموازن في الموضع الرابع بحيث يكون السهم الأبيض مرئياً وموجهاً في اتجاه القوة الطاردة المركزية. وباستخدام أداة محاذاة، تأكد من دفع الثقل لأسفل تماماً داخل الدوّار.

ضع خلية عينة التوازن بحيث تكون سدادات الغطاء مواجهة لمركز الدوار وكلمة out واضحة على الحلقة اللولبية. وباستخدام أداة المحاذاة مرة أخرى، تأكد من دفع الخلية بالكامل إلى داخل الدوار. انظر من أسفل الدوار.

قم بمحاذاة الجانب الداخلي. باستخدام أداة محاذاة، قم بوضع علامة بالقلم المعدني على العلامة الأقرب إلى مركز الدوار مع علامة القلم المعدني الموجودة على ثقل الموازنة. وبنفس الطريقة، قم بمحاذاة خلية العينة في الموضع الثاني.

بعدما يتم محاذاة جميع الخلايا، يصبح الدوّار جاهزاً للوضع في غرفة جهاز الطرد المركزي.