تغليف الخلوية في الهلاميات المائية للهندسة الأنسجة 3D

تبدأ العملية المرحلية لتغليف الخلايا بتحضير وتعقيم قوالب الهيدروجيل والمواد الأخرى، يلي ذلك عزل الخلايا إلى مجموعات فردية في أنابيب مخصصة لكل مجموعة هيدروجيل. ثم يتم إجراء عملية التغليف بوجود الخلايا، تليها فترة حضانة في المختبر أو داخل الجسم الحي. وقد يشمل التحليل اللاحق لسلوك الخلايا اختبارات الحيوية، والمورفولوجيا، والتكاثر، والتمايز.

أهلاً بكم، أنا أميديو كان من مختبر الدكتور جيسون بيرديك في قسم الهندسة الحيوية بجامعة بنسلفانيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً للتغليف الخلوي في الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد (3D hydrogels) لأغراض هندسة الأنسجة. نحن نستخدم هذا الإجراء لدراسة تأثيرات تركيب وبنية الهيدروجيل على سلوك الخلايا المغلفة.

لنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير محلول بتركيز 0.5% وزنًا من البادئ الضوئي air cure 2 9 5 9 أو I 2 9 5 9 في PBS. اخلط المحلول واحضه لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في الظلام عند درجة حرارة 37 °C.

عندما يصبح المحلول جاهزاً، استخدم مرشح سرنجة لتعقيمه ثم قم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، استخدم برنامج جداول بيانات مثل Microsoft Excel لحساب كمية البوليمر والعامل الرابط المتقاطع المطلوبة كما هو موضح. يظهر هنا حمض الهيالورونيك الوظيفي بمجموعات أكريلات تفاعلية.

احسب أيضاً كمية الببتيد الخماسي الذي يحتوي على النطاق اللاصق الوظيفي المكون من الأحماض الأمينية cystine وarginine وglycine وaspartate. يُستخدم الـ cystine للربط بالبوليمر. بعد تحديد الكميات المطلوبة من الرابط التشابكي للبوليمر والببتيد الخماسي، قم بوزنها ووضع كل منها في أنبوب einor.

قم بتعديل جدول بيانات الحسابات وفقاً لذلك. وبالنسبة للكتلة الفعلية للبوليمر التي تم الحصول عليها، انتقل إلى تحضير قوالب الهلام. استخدم شفرة حلاقة لقص أطراف الأنابيب المعقمة المغلفة بشكل فردي.

محاقن تستخدم لمرة واحدة سعة ملليلتر واحد. تأكد من إجراء قطع مسطح للقوالب التي ستُستخدم لأنماط الصور في الهلام. وأخيراً، قم بتعقيم قوالب المحاقن وأنابيب EOR مع ترك أغطيتها مفتوحة وأي مواد أخرى ضرورية عن طريق وضعها تحت مصدر ضوء مبيد للجراثيم مدمج في كابينة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة.

بمجرد اكتمال عملية التعقيم، ابدأ في تحضير الخلايا بعد تعقيم المعدات التجريبية. اعمل داخل كابينة التدفق الصفحي وأضف TEA المعقم إلى البوليمر المستخدم في الربط التشابكي من النوع الميكالي، وأضف PBS المعقيم إلى البوليمر المستخدم في الربط التشابكي بالجذور الحرة. أضف المحلول المنظم المطابق إلى أنابيب الشق المعلق وقم بعمل خلط دوامي (vortex).

لإذابة الجزء المتدلي، يرتبط هذا الجزء بحمض الهيالورونيك المألكل عبر مجموعة ثيول من مجموعة INE الموجودة على الببتيد لربط الجزء المتدلي بالبوليمر، أضفه إلى محلول البوليمر وأغلقه بإحكام. باختصار، يتم الرج باستخدام جهاز الفورتكس والتحضين عند 37 درجة مئوية مع الخلط. وأثناء تحضير الخلايا، وبينما يتم ربط الجزء المتدلي، يتم تحضير الخلايا المراد تغليفها، سواء كانت خلايا جذعية ميزنكيمية بشرية أو HMCs، وذلك بغسلها باستخدام PBS.

بعد ذلك، يتم التحضين باستخدام trypsin لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم يُزال trypsin ويُحضن العينة لمدة خمس دقائق إضافية عند 37 درجة. ثم يُضاف HMSC growth media لمعادلة trypsin وتحرير الخلايا من سطح الطبق. وتُحسب الخلايا باستخدام hemo cytometer.

قم بتقسيم الخلايا التي تم عدها إلى حصص تحتوي على العدد المناسب لكل مجموعة من الهلامات. بالنسبة لمجموعة مكونة من ثلاثة هلامات بحجم 50 microliter وبكثافة 10 مليون خلية لكل milliliter، افصل 1.5 مليون خلية في أنبوب مخروطي فردي. لا تقم بتحضير أكثر من أربعة هلامات في المجموعة الواحدة نظرًا للتوقيت الخاص بعملية التثبيت.

بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 RCF لمدة ست دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة وأثناء عملية الترسيب المركزي للخلايا، قم بتحضير خليط البلمرة للربط التشابكي بإصدار mical. أضف المنظم إلى عامل الربط التشابكي للوصول إلى التركيز المناسب.

بالنسبة للربط التشابكي للجذور الحرة المستحث بالضوء، أضف محلول I 2 9 5 9 الذي تم تحضيره مسبقاً إلى محلول البوليمر. بنسبة 10% من إجمالي حجم الهلام المتصلب للحصول على تركيز نهائي للمبادئ يبلغ 0.05% وزناً. الآن أصبحت الخلايا ومزيج البلمرة جاهزين للتغليف داخل الهيدروجيل.

ابدأ بشفط السائل الطافي من الخلايا التي تم طردها مركزياً. انتظر حتى يستقر السائل بعد عملية الشفط الأولية، ثم أعد الشفط مرة أخرى لإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط الغذائي دون خلخلة كتلة الخلايا المترسبة. قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا باستخدام محلول البوليمر لمنع تكون فقاعات الهواء.

قم بسحب المحلول وإطلاقه ببطء باستخدام الماصة نحو 10 مرات، وهو ما يجب أن يكون كافياً لتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ. بالنسبة لتفاعل الإضافة من النوع الميكالي، استخدم رأس ماصة بفتحة واسعة لإضافة الحجم المناسب من محلول الرابط المتقاطع إلى خلية البوليمر. اخلط المزيج. اضبط الماصة على حجم الهلام الفردي المطلوب.

قم بسحب المحلول وإطلاقه باستخدام الماصة لضمان التجانس، ثم صبه في قوالب رؤوس المحاقن. نفذ هذه الخطوة بسرعة لضمان توزيع متساوٍ للخلايا، واتركها لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة في حاضنة الزرع لإتمام عملية التشابك. وبالنسبة للتشابك الجذري الحر المحفز بالضوء.

قم بتوزيع الحجم المناسب في قوالب رؤوس المحاقن. عرض المحاقن للأشعة فوق البنفسجية لإتمام عملية التشبيك الجذري عبر التعريض لمدة 10 دقائق لطول موجي 365 nanometer. ويعد استخدام ضوء فوق بنفسجي بكثافة 4 milliwatts per centimeter squared شائعاً للبوليمرات الوظيفية من نوع ACRL.

قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة لتقليل ترسب الخلايا قبل التعرض للأشعة فوق البنفسجية UV. بعد عملية الربط التشابكي، اغمر الهلامات في آبار طبق زراعة الأنسجة الذي يحتوي على الوسط الغذائي لغرض التحضين والتحليل. كما يمكن إجراء الربط التشابكي للهيدروجيل بشكل متسلسل.

أولاً، أضف صبغة metholated rumine الوظيفية بتركيز نهائي قدره 20 nanomolar في الهلام. تساعد هذه الصبغة في تصور النمط نظراً لأنها تندمج بشكل تفضيلي في المناطق ذات التشابك الجذري في الهلام. ثم ابدأ بتفاعل بلمرة من نوع mic الذي ينتج جزءاً من الروابط التشابكية النظرية لما يلي.

بالنسبة للربط التشابكي بالجذور الحرة، سيتعين استخدام قناع مصمم في برنامج مثل Adobe Photoshop أو Illustrator ومطبوع مباشرة على أقنعة شفافة. يجب أن تتطابق أبعاد القناع مع الجزء العلوي المستدير للمحقنة. استخدم ملاقط معقمة لوضع قناع معقم مباشرة على سطح الهلام، ثم عرضه للضوء لإتمام عملية الربط التشابكي للهلام.

يُظهر الشكل هنا أيضاً خلايا غمد ميزنكيمية (HMCs) داخل هيدروجيلات قائمة على حمض الهيالورونيك (HA) بعد ساعة واحدة من التغليف. وبما أن الهيدروجيلات المُصنعة تكون شفافة عادةً، فيمكن تصور الخلايا لمعرفة المورفولوجيا باستخدام المجهر الضوئي. كما تم تصور الخلايا نفسها لتقييم الحيوية بعد 24 ساعة من التغليف باستخدام طقم صبغ الفلورسنت للتمييز بين الخلايا الحية والميتة.

استخدمنا calcium M للكشف عن الخلايا الحية وatherium homodimer للخلايا الميتة، ولوحظ أن الحيوية كانت أكبر من 95%. كما استخدمنا مقايسة alamar blue لتحديد مستوى تكاثر الخلايا، والذي يُقاس بمدى قدرة الخلايا على استقلاب كاشف المقايسة مما يؤدي إلى تغير في اللون. تم إجراء صبغ الخلايا على H HMCs بعد سبعة أيام من التغليف داخل هيدروجيل قائم على HA قابل للتحلل والالتصاق، وذلك باستخدام إجراءات التثبيت والنفاذية القياسية.

يمكن رؤية خيوط الأكتين الخلوية باستخدام الفالين المسمى بالفلورسين، بينما يتم تحديد النوى باستخدام dpi. ويُستخدم التلوين المناعي ضد cullin لتصور الالتصاقات البؤرية داخل مصفوفة الهيدروجيل. يتم إجراء التلوين النسيجي بعد عملية التجفيف، والتضمين في البارافين، وتقطيع الهيدروجيلات باستخدام البروتوكولات القياسية لهيدروجيلات HA المغلفة بـ HMSC والتي تم بلمرتها جذرياً.

بعد أسبوع واحد من الزرع، تم صبغها باستخدام الهيماتوكسيلين لتمييز النوى، وASIN لتمييز الأنسجة الضامة A، والصبغات الزرقاء للجليكوزامينوجليكانات. يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Realtime PCR) لتقدير تمايز الخلايا الجذعية المغلفة. وبعد طرح الخلفية، يتم تحديد مستوى تعبير الجين المستهدف من خلال عدد الدورات التي تم عندها الوصول إلى عتبة الفلورية مقارنة بإشارة مرجعية سلبية، وهي جين تدبير منزلي نشط بنيوياً. وبذلك نكون قد عرضنا لكم كيفية تغليف الخلايا في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد ودراسة سلوك الخلايا داخل الهلام.

عند استخدام هذه الإجراءات، من المهم ضمان التعقيم الكامل للمواد، إما عن طريق حفظ المحاليل المنظمة والكواشف المعقمة لفترة طويلة أو التعقيم باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية (UV) المبيد للجراثيم. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.