قياس معاملات إنتشار عبر ثنائي الفوتون الاسترداد بعد الإسفار Photobleaching

يمكن توضيح إجراء استعادة الفلورة متعددة الفوتونات بعد التبييض الضوئي بسهولة باستخدام عينة من جزيئات صبغة فلورية تنتشر بحرية. أولاً، يتم إرسال شعاع ليزر منخفض الكثافة إلى العينة لتوليد مستوى مرجعي من الفلورة من جزيئات D الموجودة ضمن الحجم البؤري لليزر.

بعد ذلك، يتم إرسال ومضة ليزر قصيرة عالية الكثافة لإزالة اللون الضوئي لجزء من جزيئات الصبغة داخل الحجم البؤري. وأخيراً، يتم تخفيف شعاع الليزر إلى مستوى الكثافة المنخفضة السابق ومراقبة الفلورة بينما تنتشر الجزيئات التي تمت إزالة لونها ضوئياً نحو الخارج وتُستبدل بجزيئات لا تزال فلورية من خارج الحجم البؤري. يتم تحليل منحنى الفلورة الناتج كدالة في الزمن لاستخراج معامل الانتشار.

مرحباً، أنا كيلي سوليفان من مختبر إدوارد براون في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة روتشستر. سنوضح لكم اليوم كيفية إجراء عملية استعادة الفلورة متعددة الفوتونات بعد التبييض الضوئي. نستخدم هذه التقنية في مختبرنا لدراسة الانتشار في الأنظمة البيولوجية سواء في المختبر (in vitro) أو في الجسم الحي (in vivo).

لنبدأ الآن. في البداية، قم بضبط الطول الموجي المطلوب لليزر، ثم ضع المرشح المناسب أمام أنبوب التضاعف الضوئي أو PMT. بعد ذلك، ولتجنب إتلاف خلية pcal، اضبط قدرة الليزر على 200 milliwatts أو أقل.

توجد مرآتان موجهتان على شكل الرقم أربعة (4) في المسار قبل خلية pcal. هاتان المرآتان ضروريتان وكافيتان لمحاذاة شعاع الليزر عبر خلية pcal. اضبط إزاحة الجهد في وحدة التحكم في انحياز خلية pcal على الصفر، ثم قم بتعديل مسار الليزر عبر خلية pcal بحيث يكون الليزر متمركزاً في النافذتين الأمامية والخلفية.

استخدم المرآة الموجودة في بداية مسار الشكل 4 لتمركز الحزمة في النافذة الأمامية، والمرآة الموجودة في نهاية مسار الشكل 4 لتمركز الحزمة في النافذة الخلفية. الآن، اضبط الجهد الكهربائي عبر بلورة خلية pcal على القيمة القصوى. تعتمد القيمة المناسبة على الأطوال الموجية ويمكن العثور عليها في دليل تعليمات خلية pcal.

قم بضبط المرايا الموضحة في الشكل 4 قبل خلية pcal حتى يتم الوصول إلى أقصى قدرة خارجة من خلية pcal. الآن، اجعل الجهد عبر البلورة صفراً وقم بضبط إزاحة الجهد في وحدة التحكم في الانحياز لتقليل القدرة الخارجة من خلية pcal إلى الحد الأدنى. أعد قدرة الليزر الساقطة على خلية pcal إلى القيمة المطلوبة للتجربة.

بالانتقال الآن إلى المجهر، قم بضبط التركيز البصري بدقة على عينة فلورية قياسية. نستخدم هنا حبوب لقاح فلورية مثبتة. وبمجردما يتم التركيز، أغلق المجهر بإحكام، ثم اضبط قدرة الليزر إلى المستوى المناسب لتصوير العينة عن طريق تغيير الجهد الكهربائي عبر كريستالة خلية pcal.

أخيراً، أطفئ الأنوار وقم بتشغيل الـ PMT. ابدأ بمسح صوري متكرر للعينة القياسية واضبط المرايا الموجودة بعد خلية الـ pcal حتى يتم الحصول على صورة حادة للعينة. والآن، دعنا ننتقل إلى تحديد مستويات قدرة المراقبة الآمنة لتركيز البؤرة داخل العينة.

لأغراض هذا الفيديو، سنستخدم عينة من صبغة مائية موضوعة داخل تجويف في شريحة زجاجية ومغطاة بغطاء شريحة. قم بتخفيف شدة الليزر إلى قدرة منخفضة ولكنها كافية لتوليد الفلورة داخل العينة. أغلق المجهر بإحكام، وقم بتوجيه المخرج من أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) إلى عداد الفوتونات.

أطفئ الأنوار وقم بتشغيل أنبوب التضاعف الضوئي (PMT) وابدأ في إجراء مسح نقطي (point Scan) باستخدام برنامج المجهر. اضبط عداد الفوتونات للتكامل على مقياس زمني أطول بكثير من وقت استعادة الفلورة المتوقع، وسجل عدداً مناسباً من نقاط البيانات. زد القدرة ثم التقط سلسلة أخرى من بيانات عد الفوتونات.

استمر في زيادة القدرة حتى يبدو أن الزيادة في عدد الفوتونات قد تضاءلت بشكل ملحوظ. وبالنسبة لمخطط زيادة القدرة، يمثل الرسم البياني لوغاريتم عدد الفوتونات كدالة في لوغاريتم القدرة. ويشير أي انحراف عن ميل مقداره اثنان إلى حدوث بهتان (bleaching).

أثناء المراقبة، اختر قدرة مراقبة مناسبة تكون أقل من هذه القيمة الحدية. والآن دعونا نحدد معاملات الإدخال للمقياس متعدد القنوات ومولد النبضات. في مولد النبضات.

اضبط وقت التعليم المسبق (pre-teach time) ليكون أكبر بمرة إلى مرتين من نصف وقت الاستعادة المتوقع، واضبط وقت التبييض (bleach time) ليكون عُشر نصف وقت الاستعادة المتوقع على المقياس (scaler). اضبط عرض الفئة (bin width) ليكون تقريباً نصف مدة التبييض، واضبط عدد الفئات لكل سجل، بحيث يكون حاصل ضرب عرض الفئة المختار في عدد الفئات لكل سجل أكبر من وقت الاستعادة الكامل المتوقع. بالإضافة إلى أوقات التعليم المسبق والتبييض، ارجع إلى مولد النبضات واضبط تردد تسلسل التعليم المسبق والتبييض ليكون مساوياً لقيمة أقل بقليل من مقلوب حاصل ضرب عرض الفئة في عدد الفئات لكل سجل.

أخيرًا، قم بتحديد عدد السجلات لكل مسح في المقياس (scaler) بناءً على شدة الإشارة عند قدرة المراقبة المختارة. الآن، اضبط قدرة المراقبة على مستوى آمن، واضبط قدرة التبييض لتكون أعلى بنحو 200 milliwatts من حد قطع التبييض الذي تم تحديده أثناء اختبار تبييض المراقبة. يتم تعيين هاتين القدرتين كجهدين مختلفين عبر ختم بلورة خلية al، ثم قم بإطفاء أضواء المجهر.

قم بتشغيل أنبوب التضاعف الضوئي (PMT). ابدأ عملية المسح النقطي باستخدام برنامج التصوير. بعد ذلك، قم بتشغيل مولد النبضات والمقياس (scaler).

لتحليل منحنى الاستعادة الناتج، حدد ثلاث نقاط مهمة: الفلورة قبل الإزالة الضوئية، والفلورة فور حدوث الإزالة الضوئية، والفلورة في نهاية مجموعة البيانات. استخدم قيم الفلورة قبل الإزالة الضوئية وفور حدوثها لتقدير وقت نصف الاستعادة بشكل أدق.

الآن، استخدم القواعد الموضحة في الخطوات السابقة لتحديث قيم التبييض المسبق (preble bleach) ومدد عرض البداية. خذ منحنى جديداً واستمر في ضبط المعاملات حتى يُظهر المنحنى الناتج تبييضاً قوياً واستعادة سلسة. تحقق من تشبع الإثارة عن طريق رسم لوغاريتم معامل عمق التبييض كدالة في لوغاريتم القدرة.

يشير أي انحراف عن ميل قدره اثنين إلى حدوث تشبع في الإثارة. اختر قدرة تبييض تؤدي إلى تبييض قوي ولكن لا تسبب التشبع. وأخيرًا، بعد تحديد المعلمات المناسبة، استمر في أخذ منحنيات استعادة الفلورة متعددة الفوتونات بعد التبييض الضوئي (MP FP) للعينة المراد دراستها.

سنعرض الآن النتائج التمثيلية لكل من بيانات MP frap الخام ومنحنى MP F wrapp الموحد الذي تم استيفاؤه لتقدير معامل الانتشار؛ حيث تظهر بيانات MP F frap الخام عملية تبييض قوية وتعافيًا سلسًا. وقد تم تسجيل التعافي الكامل للنصف الثاني من البيانات لغرض استيفاء البيانات. نقوم أولاً بتوحيد التعافي بالنسبة لمتوسط الفلورة قبل التبييض، ثم نجري استيفاءً بطريقة المربعات الصغرى غير الخطية.

فيما يتعلق بالنموذج المناسب. تم الحصول على كلتا مجموعتي البيانات في الفلوريسين المائي والتي أنتجت معاملات الانتشار. تماشياً مع الأدبيات العلمية، لقد أوضحنا لكم للتو كيفية إجراء تجربة استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي متعدد الفوتونات.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توخي الحذر وتحديد المعلمات التجريبية، وبشكل خاص مدة التبييض وقدرة التبييض والمراقبة، ضمن الحدود الآمنة المحددة في البروتوكول. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.