تصنيع وتشغيل إدخال الأوكسجين للثقافات الخلوية منتسب

يحتوي جهاز الإدخال الخاص بنقص الأكسجة على ست دعامات تستقر داخل آبار طبق سداسي الآبار. يتدفق الغاز عبر الشبكة الموائع مجهرية الموجودة في قاعدة الدعامة، ويمكنه الانتشار عبر غشاء PDMS النفوذ للغاز، والذي يفصل بين شبكة الغاز وأوساط الزرع. يعمل هذا الجهاز على تقليل طول مسار الانتشار بين مصدر الأكسجين، والشبكة الموائع مجهرية في قاعدة الدعامة، والخلايا، مما يسمح بموازنة تركيز الأكسجين بشكل أسرع.

يسمح الجهاز أيضًا بتحكم أكبر بكثير في النمط المكاني للأكسجين الذي تتعرض له الخلايا، والذي يتم تحديده بواسطة تصميم شبكة الغازات الموائع دقيقة القياس التي تم تصنيعها باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية القياسية بواسطة أقنعة ضوئية. مرحباً، أنا شون آرد من مختبر الدكتور ديفيد إيدينجتون في قسم الهندسة الحيوية بجامعة إلينوي في شيكاغو. مرحباً، أنا إيلي أيضاً من مختبر إيدينجتون.

سنوضح لكم اليوم كيفية تصنيع وجهاز مخصص والتحقق من صحته واستخدامه لتعريض المزارع الخلوية في المختبر (in vitro) في طبق سداسي الفجوات لتركيزات مختلفة من الأكسجين. لقد استخدمنا هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثير الأكسجين على التئام الجروح، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية، والهجرة الخلوية. لذا، فلنبدأ.

لبدء تصنيع قطعة الإدخال المؤكسجة، قم بتحضير Polymethyl Sloane أو PDMS بنسبة 10 إلى 1 بين البوليمر الأولي وعامل المعالجة. وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة، يُضاف خليط PDMS إلى قالب Dell ran تم تشغيله مسبقاً ليكون بنمط يحاكي شكل طبق زراعة قياسي مكون من ستة آبار. وبمجرد المعالجة عند 75 درجة Celsius طوال الليل، ستشكل مصفوفة الركائز المصبوبة الناتجة المكون الأول من المكونات الثلاثة التي تتألف منها قطعة الإدخال المؤكسجة، وذلك من أجل تصنيع المكون الرئيسي الثاني لقطعة الإدخال المؤكسجة.

يتم تحضير قالب SU 8 الرئيسي أولاً عن طريق طلاء SU 8 21 50 بالدوران. يتم وضع قناع ضوئي على رقاقة السيليكون، ثم تعريض SU 8 للأشعة فوق البنفسجية عبر القناع الضوئي لإنشاء قالب رئيسي بسمك قناة دقيقة يبلغ 300 micrometers. يُصب PDMS فوق قالب SU 8 الرئيسي ويُعالج لمدة ساعتين عند 75 °C للحصول على قالب موجب سيشكل في النهاية القنوات الدقيقة في قاعدة كل ركيزة.

يتم تصنيع المكون الثالث للجهاز عن طريق تدوير PDMS على رقاقة سيليكون بسرعة 500 RPMs لمدة 10 ثوانٍ، تليها سرعة 900 RPMs لمدة 30 ثانية للحصول على غشاء بسماكة 100 micrometer. وبما أن PDMS نفاذ للغازات، يمكن إيصال الأكسجين إلى القنوات الدقيقة مباشرة عبر هذا الغشاء. وبمجرد تحضير جميع المكونات، يخضع كل سطح ربط لمعالجة ببلازما الأكسجين لمدة دقيقة واحدة.

باستخدام جهاز بلازما يدوي، قم أولاً بربط مكونات القنوات الدقيقة الست بمصفوفة الركائز، ثم اثقب ثقبين في كل ركيزة ليعملا كمنافذ دخول وخروج الغاز. وأخيراً، قم بربط الغشاء بأسفل القناة الدقيقة لتسهيل عملية الربط وطرد أي فقاعات. تُضغط الأسطح المعالجة بالبلازما معاً لمدة دقيقة تقريباً باستخدام طرف ملقط، مع الانتظار لمدة ساعة بين كل عملية ربط لضمان ارتباط الجهاز تماماً وإمكانية معايرته.

بمجرد تصنيع الجهاز بالكامل، يجب معايرة مستوى الأكسجين الذي تتلقاه الخلايا عند استخدام قطعة الإدخال الموكسجة في التجارب الفعلية. ولأغراض المعايرة، استخدم مستشعر أكسجين فلوري أو شريحة foxy، والتي تحتوي على طلاء من صبغة الروثينيوم الفلورية التي يتم إخمادها بواسطة الأكسجين. يتم قص شرائح foxy مسبقاً لتناسب قاع طبق يحتوي على ست آبار.

يجب قص الشريحة الزجاجية بحيث تغطي أكبر قدر ممكن من سطح البئر. وبما أن سمك الشريحة يبلغ حوالي 1 mm، فقم بتعديل الجهاز للحفاظ على المسافة المطلوبة لضمان انتشار الغشاء بشكل مناسب.

تعتمد هذه المسافة على التجربة، ولكن في معظم الحالات يجب أن تكون أقل من 1 mm باستخدام جهاز البلازما المحمول. يتم لصق أربعة دعامات من الزجاج بسماكة 1 mm، وبطول 6 mm وعرض 4 mm تقريباً، في الجزء السفلي من الجهاز. سيستقر الجهاز على هذه الدعامات فوق الشريحة المقطوعة.

يمكن استخدام شرائح غطاء زجاجية أيضاً لإنشاء فجوة انتشار تبلغ 0.17 millimeters للتحقق من استهلاك الأكسجين. يتم وضع ثلاثة milliliters من الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة داخل آبار طبق الستة آبار حيث سيتم قياس الأكسجين. ضع الجهاز في الطبق، وباستخدام برنامج metamorph، حدد عدد ومواقع المواضع المطلوبة على مستشعر foxy.

قم بتحريك الشريحة لقياس تركيزات الأكسجين. صِل أنابيب مسدس تاي بين خزان غاز الأكسجين وجهاز الإدراج ناقص الأكسجين. يُستخدم منظم تدفق دقيق مضبوط على معدل تدفق يتراوح من 50 إلى 100 milliliters per minute للتحكم الدقيق في الغاز الموصل.

التأكد من إغلاق منظم التدفق الدقيق. يتم فتح المنظم العلوي للخزان أولاً، يليه المنظم الدقيق. يتم خفض معدل التدفق إلى ما بين 10 إلى 20 في الدقيقة بعد مرور 15 دقيقة.

لتجنب تكوين فقاعات في الماء، راقب قيمة معدل التدفق بدقة خلال الساعة القادمة وأجرِ التعديلات اللازمة، حيث سيتغير انخفاض الضغط أثناء توازن النظام، مما يؤدي إلى تغيير معدل التدفق لالتقاط صور للصفيحة ومستشعرات foxy. يتم استخدام مجهر Olympus IX 71 مزود بفلورة، وكاميرا ذات جهاز شحن مقترن (CCD) من Q Imaging Tiga، وبرمجيات الحصول على الصور SRV وMetamorpho. المجهر مجهز بفلتر فلوري Olympus 3 1 0 2 0 متوافق مع foxy بطول موجي للإثارة يبلغ 475 nanometers وطول موجي للانبعاث يبلغ 600 nanometers.

لاختبار زمن الاتزان ومدى الأكسجة للجهاز، اختر ثلاث نقاط على شريحة foxy لقياس تركيز الأكسجين. التقط صورة للشريحة مباشرة قبل البدء في تدفق الغاز. التقط صوراً بفاصل زمني قدره 10 ثوانٍ على مدار 30 دقيقة أثناء تدفق الغاز عبر الجهاز لاختبار عدم التجانس وإمداد الأكسجين.

قم بتحديد نقاط متعددة على فترات فاصلة تبلغ 1 mm تغطي عرض القناة، وقم بقياس تركيز الأكسجين عند سطح البئر باستخدام برنامج metamorph. قم بتصدير متوسط كثافة الصورة لكل موضع، ثم ارسم منحنى تركيز الأكسجين كدالة تعتمد على كثافة الفلورة. قم بإنشاء منحنى معايرة عن طريق ملاءمة منحنيات خطية للخط من 0 إلى 10% والخط من 10 إلى 21% لربط كثافة الفلورة بتركيز الأكسجين. بالنسبة لكل موضع تم قياسه، يمكن تصدير بيانات الكثافة الخام من برنامج metamorph وتحليلها بشكل أكبر باستخدام Microsoft Excel أو أي برنامج إحصائي آخر.

بمجرد معايرة الجهاز، يمكن البدء في تجارب مثل فحوصات التئام الجروح؛ قم بتعقيم القطعة المُدخلة التي تمت معايرتها باستخدام الموصدة (autoclave) عند 121 درجة Celsius لمدة 15 دقيقة خلال 24 ساعة قبل التجربة، واعمل بها داخل غطاء تدفق صفائحي للزراعة لمنع التلوث اللاحق. انقع القطعة المُدخلة من PDMS المعقمة في وسط خالٍ من المصل لمدة 24 ساعة لمنع تكون فقاعات غازية عند إدخالها في آبار الطبق، ثم ازرع خلايا MDCK أو أي خلايا ملتصقة أخرى حتى تصل إلى نسبة تلاقي 100% في طبق ذي ستة آبار، وقم بعمل خدوش مستقيمة في الطبقات الأحادية باستخدام طرف ماصة P 200. تحاكي هذه الخدوش الجروح في الطبقة الأحادية الملتصقة.

قم بشفط الوسط الخلوي دون تعريض الطبقة أحادية الخلايا للاهتزاز، ثم اشطفها بخمسة ملليترات (5 mL) من الوسط. اشفط الوسط مرة أخرى ثم املأ الآبار بثلاثة ملليترات (3 mL) من وسط خالٍ من المصل. أدخل الجهاز برفق في الطبق، مع التأكد من تجنب تكون الفقاعات.

يساعد إمالة الجهاز أثناء الإدخال على طرد الفقاعات من أحد الجوانب. يجب توخي الحذر لتجنب تسليط ضغط زائد على الجهاز، مما قد يؤدي إلى تشويه مادة PDMS بدرجة كافية لسحق الخلايا الموجودة أسفلها. ضع الطبق والجهاز على منصة مجهر مسخنة عند 37 degree Celsius وقم بتوصيل الأنابيب من خزان الغاز المصدر إلى منافذ الدخول والخروج في الجهاز.

يجب أن تحتوي حاضنة المزارع على فتحة تسمح بدخول الأنابيب، ويجب توصيل هذه الأنابيب. بعد وضع الجهاز داخل الحاضنة، اتبع نفس الإجراء الموصوف سابقاً لبدء تدفق الغاز لتقييم التئام الجروح. قم بالتقاط صور بفاصل زمني للخلايا كل 20 دقيقة لمدة تتراوح من 15 إلى 18 ساعة باستخدام المعدات وبرامج التصوير الموصوفة سابقاً. يمكن استخدام خوارزمية قياس لخدش الجروح لتحليل مساحة السطح غير الملتئمة بعد المدة التجريبية المطلوبة. أوقف تدفق الغاز، وأخرج الطبق، ثم انتقل إلى المزيد من معالجة الخلايا إذا رغبت في ذلك. يتطلب جهاز الإدراج الناقص الأكسجة أقل من دقيقتين للاستقرار عند مستوى 0.5% oxygen كما هو موضح هنا.

كان حجم الفجوة في قاع بئر غشاء الجهاز عاملاً حاسماً في تحديد كفاءة التوازن، حيث تطلبت الفجوات الأكبر حجماً وقتاً أطول للوصول إلى قيم تركيز الأكسجين في الحالة المستقرة. كما يتيح الجهاز قدراً كبيراً من التحكم في الأكسجة المكانية داخل البئر الواحد، مما يسمح بتكوين ظروف متعددة وحتى توليد ملف أكسجين دوري عبر سطح البئر. عُرّضت طبقات أحادية من خلايا MDCK لأكسجين بنسبة 10% أو 21%، وتم تحليل مساحة سطح الجرح بمرور الوقت باستخدام خوارزمية MATLAB Ts لتتبع جرح الخدش.

بعد مرور 11 ساعة من إجمالي 17 ساعة، بقي 6.87% من الجرح الأصلي عند التعريض لـ 10% أكسجين، بينما بقي 64.4% من الجرح تحت 21% أكسجين. وكما هو موضح هنا، فإن تركيزات الأكسجين ترتبط ارتباطاً عكسياً بمساحة الجرح المفتوحة لكلا التركيزين. وطوال مدة التجربة، قمنا بتوضيح كيفية تصنيع جهاز الإدخال لنقص الأكسجة والتحقق من صحته واستخدامه في مقايسة التئام جروح الخدش. ويوفر هذا الجهاز عدداً من المزايا مقارنة بأنظمة الأكسجة الأخرى، مثل صغر المساحة المختبرية التي يشغلها والتحكم الأكبر بكثير في الأكسجة المكانية والزمانية عند سطح الخلية.

يمكن استخدام هذا الجهاز من قبل أي مختبر يدرس تأثير الأكسجين أو الغازات الأخرى مثل ثاني أكسيد الكربون على المزارع الخلوية في المختبر (in vitro). عند إجراء هذا الإجراء، من المهم نقع الجهاز المعقم وأوساط الزراعة طوال الليل، وتقليل تكوين الفقاعات أثناء التجربة. بالإضافة إلى ذلك، اترك النظام حتى يتوازن قبل بدء التجربة.

وذلك لأن معدل التدفق يتغير عندما يتساوى الضغط في النظام. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.