نافذة على المجهري : نظم ميكروفلويديك بسيطة لدراسة النقل في وسائل الإعلام الميكروبية المسامية

نوضح من خلال استخدام أجهزة رقائق eco أن الهياكل الفيزيائية ورؤوس الضغط يمكن إبقاؤها ثابتة أو تغييرها. وبينما يتم استقصاء تأثير كيمياء السطح وخصائص السوائل أو خصائص الجزيئات أو الميكروبات بشكل منهجي من خلال تجارب النقل باستخدام سلالة بكتيرية VIO غير ممرضة تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر، فإننا نبين أهمية هيكل الموطن، وظروف التدفق، وحجم اللقاح على ظواهر النقل الأساسية. يقدم برنامج الموائع الدقيقة رؤية مقنعة لعالم خفي.

مرحباً، معكم ديميتري ماركر من معهد فاندربيلت لتعليم ترميم النظم الحيوية التكاملية بجامعة فاندربيلت. وأنا ديفيد شيفر، مهندس بحث وتطوير هنا في مختبرات فيرو. مرحباً، أنا ليزلي شو من قسم الهندسة الكيميائية والمواد والهندسة الجزيئية الحيوية في مركز العلوم والهندسة البيئية بجامعة كونيتيكت، وأنا أدات ديكوت أيضاً من زيبرا.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لإنشاء مصفوفات موائل مائعية دقيقة تركيبية لأبحاث العلوم والهندسة البيئية الأساسية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثيرات الهياكل ذات المقياس الميكرومتري على تفاعلات النقل الميكروبية في الأوساط الحرجية. لذا، فلنبدأ.

تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء جهاز للموائع الدقيقة في رسم مخطط ثنائي الأبعاد للجهاز باستخدام برنامج رسم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). لقد استخدمنا برنامج AutoCAD، ولكن تتوفر برامج رسم أخرى أيضاً، مثل Clue-in أو CorelDRAW. يتيح البرنامج للمصمم تكرار الهياكل الفيزيائية بدقة في مجال عياني، بينما يتم تحديد الميزات الفردية بدقة تقل عن 5 microns.

يتم إنشاء قناع فوتوغرافي بناءً على رسم التصميم بمساعدة الحاسوب (CAD). ونحن نستخدم قناعاً من الكروم مصنعاً بواسطة شركة Advanced Reproductions Corporation في الطرف الشمالي من ولاية ماساتشوستس. وتتم الخطوات التالية من إنتاج الجهاز الموائع الدقيقة داخل غرفة نظيفة لإنشاء القالب الرئيسي.

تُطلى رقاقة سيليكون نظيفة بالمقاوم الضوئي باستخدام جهاز الطلاء الدوراني. أولاً، يتم تثبيت الرقاقة على منصة جهاز الطلاء الدوراني ويُصب بضعة جرامات من المقاوم الضوئي SU 8 20 25 في مركز الرقاقة. ثم يتم تدوير الرقاقة في دورة نشر أولية لمدة 15 ثانية بسرعة 500 RPM، تليها دورة طلاء رقيق بسرعة 4,000 RPM لمدة 35 ثانية.

بعد عملية التدوير، توضع الرقاقة على لوح ساخن لمدة 10 دقائق عند 95 درجة Celsius لتبخير المذيب الزائد. وتتمثل الخطوة الأخيرة في تجهيز الرقاقة في إزالة حافة التراكم (edge bead)، ويتم ذلك عن طريق إعادة الرقاقة إلى جهاز الطلاء بالتدوير وتوجيه تيار مستمر من مزيل حواف SUA إلى الحافة الخارجية للرقاقة المطلية.

تتمثل الخطوة التالية في تشكيل نمط المقاوم الضوئي عن طريق التعريض الانتقائي للأشعة فوق البنفسجية UV. أولاً، يتم وضع الرقاقة المطلية على سطح مستوٍ ويوضع القناع الكرومي مباشرة فوقها. ويقوم فيلم التعمية الأحمر من نوع Rubylith بمنع انتقال الأنماط خارج المنطقة المطلوبة.

بعد ذلك، يتم تسليط جرعة من الأشعة فوق البنفسجية بمقدار 300 mJ/cm² على الرقاقة المطلية عبر القناع باستخدام نظام نقل البقع. وأخيراً، تُخبز الرقاقة لمدة 15 دقيقة عند 95 °C لإحداث تشابك في المناطق المعرضة للضوء من مادة المقاوم الضوئي، مما يجعلها غير قابلة للذوبان. وتتمثل الخطوة الأخيرة في إنشاء القالب الرئيسي في إزالة المناطق غير المتشابكة من المقاوم الضوئي، مما يترك خلفها هياكل بارزة.

أولاً، تُعاد الرقاقة مرة أخرى إلى جهاز الطلاء الدوراني ويتم تغطيتها بمحلول المظهر. يُترك المظهر على الرقاقة المطلية لمدة خمس دقائق تقريباً ثم يتم إزالته بالتدوير، مما ينتج عنه نمط واضح وجلي على الرقاقة. يتم غسل أي بقايا متبقية عن طريق رش الكحول الإيزوبروبيلي على الرقاقة أثناء دورانها.

نستخدم سرعة دوران تبلغ 2200 RPM لهذه الخطوة لمدة تتراوح من خمس إلى 10 ثوانٍ تقريبًا. وأخيرًا، يتم تجفيف القالب الرئيسي المكتمل باستخدام تيار من غاز النيتروجين ويُحفظ في طبق حتى يحين وقت استخدامه في صب الجهاز. نقوم بتصنيع الأجهزة الموائعية الدقيقة باستخدام المطاط السيليكوني polymethyl alane.

أولاً، يتم وضع المادة الأساسية وعامل المعالجة في كوب بلاستيكي بنسبة وزنية تبلغ 10 إلى 1. بعد ذلك، يتم خلط المزيج. وتمت إزالة الفقاعات باستخدام خلاط التكييف Thinky AR 100.

بمجرد اكتمال الدورة، يُصب PDMS السائل بالتساوي فوق القالب الرئيسي. ثم يوضع الطبق الذي يحتوي على القالب الرئيسي و PDMS غير المعالج في غرفة تفريغ لإزالة الغازات. وتظهر فقاعات البوليمر على الفور تقريبًا.

تستمر عملية إزالة الغازات حتى تختفي جميع الفقاعات. يُوضع الطبق في فرن مستوٍ عند درجة حرارة 65 °C لمدة أربع ساعات على الأقل للسماح بالتشابك البوليمري الكامل. ثم يُزال PDMS المعالج بعناية من القالب الرئيسي القابل لإعادة الاستخدام.

تُقص الحواف الأربع الأولى خارج المنطقة المنقوشة جيداً باستخدام المشرط، ثم يُنزع الجهاز عن الرقاقة المنقوشة باستخدام الملاقط. يمكن تشذيب حواف الجهاز باستخدام المقص إذا لزم الأمر. كما يمكن فصل جزء فرعي من الجهاز عن بقية جهاز PDMS المصبوب.

بعد ذلك، يتم ثقب فتحات الوصول عبر الـ PDMS. نستخدم أدوات ثقب الخزعات المتاحة تجارياً بمقاسات مختلفة ومثبتة على محور صغير. ثم تُزال نوى الـ PDMS المضغوطة باستخدام الملاقط.

أخيراً، يتم تنظيف الجهاز المقصوص والمثقوب باستخدام كحول الإيزوبروبيل ومسحة بولي بروبيلين ذات رأس رغوي. يُجفف الجهاز باستخدام النيتروجين ثم يوضع في الفرن لإزالة كافة آثار المذيب. وتتمثل الخطوة الأخيرة في تصنيع الجهاز الموائع الدقيقة في ربط الـ PDMS بركيزة من شريحة زجاجية، ثم ملئه بالسائل أولاً.

يتم وضع جهاز PDMS وشريحة زجاجية في جهاز تنظيف بالبلازما مع توجيه أسطح الربط إلى الأعلى. في هذه التجربة، استخدمنا جهاز تنظيف بالبلازما من نوع PDC 32 G herrick. وبمجرد إنشاء الفراغ وظهور بلازما باللون الأزرق البنفسجي، يتم ضبط المؤقت لمدة 30 ثانية.

يتم إيقاف تشغيل مولد البلازما. ثم يُعاد ضغط الغرفة، ويُخرج الجهاز والمنزلق منها، وتوضع أسطح الربط في حالة تلامس. ومن المهم التحرك بسرعة عند إخراج المكونات المنشطة من الغرفة لضمان بقاء الأسطح في حالتها المنشطة.

يساعد الضغط الخفيف في ضمان تكوين رابطة جيدة. ويتم التحقق من جودة الرابطة عن طريق سحب إحدى الزوايا باستخدام الملاقط. بعد ذلك، يمكن ملء الجزء الداخلي المحب للماء بسهولة بمحلول مائي مثل الوسائط المنظمة أو الماء منزوع الأيونات.

يتم إدخال السائل المائي في كل بئر مصدر ومن خلال خلية التدفق ذات المسام الدقيقة المقابلة. وبمجرد امتلاء جميع الحجرات، توضع طبقة رقيقة من PDMS المعالج فوق الجهاز بالكامل للمساعدة في تقليل التبخر والحفاظ على التعقيم. ولمعايرة التدفق المدفوع بالضغط في الجهاز، يتم ملء خلايا التدفق ذات البنية المجهرية مسبقاً بالماء منزوع الأيونات، ثم يوضع نموذج التدفق، الذي يعمل كواجهة لتوصيل السوائل وسداد معقم في الجزء العلوي من الجهاز.

يمكن استخدام وحدة التدفق هذه بمفردها أو توصيلها بخزان سوائل خارجي، مثل حقنة بلاستيكية. قم بتوصيل خزان يحتوي على سائل، مثل حقنة بلاستيكية أو وحدة التدفق، بالمدخل العلوي. حافظ جيداً على ارتفاع السائل في الخزان ليكون أعلى من مستوى المخرج السفلي.

يُحدد الفرق في الارتفاع بين الخزان العلوي وكل بئر مخرج سفلي القوة الدافعة للتدفق المدفوع بالضغط من أجل قياس معدلات التدفق عبر الأجهزة. وتُستخدم إبرة ذات نهاية غير مدببة بقياس 25 gauge لجمع العينات من الآبار السفلية على فترات منتظمة. فعلى سبيل المثال، نقوم بجمع العينات كل 15 إلى 20 دقيقة مع تدوين الوقت الفعلي المنقضي بين العينات بدقة.

يتم تسجيل وزن المحقنة قبل وبعد أخذ العينات باستخدام ميزان تحليلي. ويتم رسم مخطط للعلاقة بين حجم المجموعات مقابل وقت المجموعات، حيث يمثل الميل متوسط معدل التدفق الكتلي. كما يساعد المقطع العرضي الكبير لخزان المدخل مقابل آبار المخرج في منع تغير معدلات التدفق بشكل كبير أثناء تحرك السائل عبر الأجهزة؛ قم برسم الحجم الذي تم أخذ عيناته على المحور Y مقابل وقت أخذ العينات على المحور x.

في برنامج رسم بياني بسيط مثل Excel للحصول على ميل الخط، يُستخدم الميل لتحديد متوسط معدل التدفق الحجمي. ويُستخدم محلول مخفف من حبيبات اللاتكس الفلورية بتركيز 3 micromolar، ذات أسطح كربوكسيلية، وYG، وYG سادة، لتصور التدفق ودراسة التفاعلات السطحية. أولاً، يتم تحضير محلول من الحبيبات في ماء منزوع الأيونات بتركيز 0.01% من المواد الصلبة.

يُضاف المحلول إلى الآبار العلوية، ثم يُعاد توصيل وحدة التدفق. يتم رصد تدفق الحبيبات على مدار ساعة واحدة، وتسجيله كل 10 دقائق تقريباً باستخدام مجهر فلوري من نوع Zeiss AIOt 25، مجهز بكاميرا أحادية اللون من نوع MITx BCEB 0 1 3 U. يتم التقاط إطارات فردية في تتابع سريع وتجميعها في مقاطع فيديو باستخدام برنامج برمجيات مثل Image J، مع استخدام الإضاءة الفلورية والإضاءة النافذة.

تظهر كل من الخرزات والهياكل بوضوح. وعند حجب الضوء النافذ، تظهر الخرزات الفلورية الساطعة فقط. كما تظهر الخرزات الساكنة المترسبة على طول السطح السفلي أو الملتصقة بالمجمعات في جميع أنحاء الجهاز.

بالنسبة للتجارب التي تستخدم بكتيريا حية، مثل مزارع أنواع Vibrio، يتم تحضير بكتيريا غير ممرضة تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر. أولاً، يتم إخراج مزارع مخزنة من التجميد العميق، ثم تُلقح قارورة تحتوي على وسط نمو LB معقم بالمزارع المخزنة.

باستخدام حلقة تلقيح تستخدم لمرة واحدة، يتم تحضين القارورة طوال الليل مع الرج للحصول على مزرعة في طور الثبات بتركيز يصل إلى 10⁹ خلية لكل ملليلتر تقريباً. واعتماداً على التطبيق، يمكن تقدير التركيز الأولي للبكتيريا بدقة أكبر. ثم يتم تحضير جهاز ميكروفلويديك مملوء بمحلول منظم معقم.

بعد ذلك، يتم تفريغ السائل المعقم من الآبار العلوية واستبداله بـ 20 µL من مستنبت البكتيريا. وباستخدام ماصة، يتم استزراع البكتيريا داخل الجهاز عن طريق سحب لطيف باستخدام حقنة في الآبار المخرجة. وبعد فترة الحضن، يمكن تحديد كمية البكتيريا في الآبار عن طريق قياس شدة الفلورة لكل بئر بعد الاستعمار. ثم يتم تفريغ بئر المدخل العلوي كما في السابق واستبداله بمحلول منظم مُشبع بـ 25 جزء في الألف من الأملاح.

يتم تطبيق ضغط خفيف لمياه البحر الاصطناعية على الآبار العلوية باستخدام حقنة لشطف خلايا التدفق الفردية بـ 20 إلى 40 µL من المحلول المنظم. يمثل هذا تقريبًا 100 إلى 200 ضعف حجم المسام في جزء التربة الموائع دقيقياً من خلية التدفق بعد عملية الشطف الأولية. ويتم تحقيق التروية طويلة الأمد للبكتيريا عبر الأوساط المسامية باستخدام وحدة التدفق تمامًا كما تم توضيحه سابقًا.

يمكن قياس الصور الفلورية وصور الضوء الأبيض لنمو البكتيريا وانتقالها بمرور الوقت. في هذه التجربة، تُلتقط الصور كل 15 إلى 20 ساعة لمدة سبعة أيام باستخدام كاميرا CCD مبردة ملونة من شركة Q imaging ink. يمكن استخدام أجهزتنا أيضاً لبحث تأثيرات بنية الموئل الفيزيائية في توفير ملجأ للبكتيريا من افتراس الأوليات.

تظهر هنا بكتيريا في خلية تدفق مسامية دقيقة مع ظهور البروتوزوا المهدبة eulo الأكبر حجماً بكثير داخل الجهاز وهي تتغذى على البكتيريا. ومن خلال تحليل تدفق السوائل في الجهاز الموائع الدقيق، وجدنا أن متوسط معدل التدفق يبلغ 0.71 microliters per minute عند رأس ضغط قدره 40 millimeter. وبزيادة رأس الضغط إلى 60 millimeters، ارتفع معدل التدفق بشكل تناسبي ليصل إلى 1.04 microliters per minute.

عند استخدام حبيبات ذات كيمياء سطحية متنوعة في الجهاز، نلاحظ تراكمًا أكبر للحبيبات غير الكربوكسيلية عند أسطح الجهاز. وفي حين أن الحبيبات التي يتراوح قطرها بين 6 إلى 10 مليمتر كانت أكثر عرضة للانحصار في فتحات المسام الأصغر. أدت معدلات التدفق الأسرع الناتجة عن زيادة الضغط الهيدروستاتيكي إلى انخفاض في احتجاز الحبيبات وانحصارها، كما هو متوقع لتحليل النمو البكتيري في جهاز eco chipp للموائع الدقيقة.

نلاحظ وجود اختلافات نوعية في كثافة الصورة في قطاعات مختلفة من الجهاز. ويمكن قياس شدة الفلورة كمؤشر للكتلة الحيوية الميكروبية في القناة. وفي التجارب الجارية، نلاحظ أن قوى القص المستمرة في ظروف التدفق المنخفض يبدو أنها تسبب تجمع البكتيريا وتكوين ندف كما هو واضح في هذه الصور. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إنشاء واستخدام أجهزة مائعية دقيقة بسيطة لقياس حجم الجسيمات، أو انتقال التصادم عبر الأوساط المسامية، أو لبحث التفاعلات الميكروبية في الموائل ذات البنية الدقيقة.

عند إجراء الدراسات باستخدام خلايا التدفق، من المهم مراعاة قوة طفو الخرزات والكيمياء السطحية للغرويات والمجمعات. وعند تقليص الحجم للوصول إلى نظام الموائع الدقيقة، يمكن للتأثيرات السطحية أن تهيمن على الظواهر الملحوظة. ومن الناحية العملية، يمكن دمج أي هيكل فيزيائي تقريباً في تصميم خلية تدفق الموائع الدقيقة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.