تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي

يوضح هذا الفيديو إجراءً لتحفيز وصبغ الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي أو pbmc. ولإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان، يتم وضع pbmc المعزولة من الدم الكامل في أطباق زراعة الأنسجة. يتم تحفيز الخلايا كيميائياً أو بيولوجياً لإنتاج استجابة مناعية.

بعد التحفيز، يتم إضافة مزيج من الأجسام المضادة لتحديد أنواع الخلايا بناءً على الواسمات السطحية المعبر عنها. ثم يتم نفاذ الخلايا وإضافة مزيج مختلف من الأجسام المضادة للكشف عن تعبير السيتوكينات داخل الخلايا، ثم تُحلل الخلايا بواسطة جهاز التدفق الخلوي (FACs) لتحديد ملفات السيتوكينات لمجموعات فرعية محددة من خلايا pbmc. مرحباً، أنا إيمي كورتني من مختبر الدكتور جاغان ساس في قسم المناعة بمركز MD Anderson للسرطان التابع لجامعة تكساس.

مرحباً، أنا هونغ أيضاً من المختبر. سنعرض لكم اليوم تحليلاً للتدفق الخلوي المتعدد لاستجابات الخلايا التائية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الاستجابات المناعية الخلوية في Reus Maca.

لنبدأ الآن. ابدأ هذا البروتوكول باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لتحديد عدد الخلايا الحية للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) المستخلصة من Maca Reuss باستخدام طريقة استبعاد صبغة Trypan Blue. يتم العمل داخل غطاء تدفق رقائقي (laminar flow hood) Reuss.

قم بتعليق الخلايا في وسط كامل بتركيز 10 ملايين خلية لكل ميليلتر للتحفيز غير النوعي، وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من معلق الخلايا في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الـ 96 بئراً. ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على PMA وCIN ليصل الحجم الإجمالي إلى 0.2 ميليلتر بتركيز نهائي قدره 50 نانوغرام لكل ميليلتر من PMA و500 نانوغرام لكل ميليلتر من CIN؛ أما بالنسبة لآبار الضابط السالب، فأضف 100 ميكرولتر من الوسط الكامل وحده إلى كل بئر. قم بتحضين الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون لمدة 1.5 ساعة.

أضف felden A إلى المزرعة ليكون التركيز النهائي 10 micrograms per milliliter واحضنها لمدة 4.5 hours إضافية. يُضاف felden A إلى trapp cytokines في جهاز gold G لزيادة الوضوح عند التلوين المناعي، وبعد التحفيز، يتم إجراء الطرد المركزي لإزالة الوسط، ثم الغسل بإضافة 200 microliters من flow wash buffer البارد والطرد المركزي بسرعة منخفضة. كرر عملية الغسل هذه، ثم أعد التعليق في 50 microliters من flow wash buffer.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة لصبغها من أجل الكشف عن تعبير الواسمات السطحية في كل بئر من الخلايا التي تمت إعادة تعليقها. أضف 1 µL من صبغة تفاعلية فلورية مائية قابلة للتثبيت لتمييز الخلايا الحية والميتة (live dead fixable aqua fluorescent reactive dye)، مُحضرة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تُحضن الخلايا عند 4 °C في الظلام لمدة 30 دقيقة أثناء عملية التحضين.

قم بتحضير محاليل الصبغ التي ستُستخدم في الأنابيب الدقيقة. أولاً، قم بتحضير مزيج الصبغ بحيث يتضمن المكونات التالية بشكل مناسب: الأجسام المضادة أحادية النسيلة الموصومة بالفلورسنت والمنقحة، anti CD three PE SCI seven، و anti CD eight Alexa 700، و anti CD 28 per CCP SCI 5.5، و anti CD 95 A PC، و anti CD four Pacific Blue، بالإضافة إلى Inflow Wash Buffer.

بعد ذلك، قم بتحضير ضوابط التعويض، والتي ستُستخدم لتحديد معاملات التداخل (spillover coefficients) لكل صبغة فردية في الكواشف الأخرى، وذلك من خلال تحضير أنبوب لكل جسم مضاد مقترن بفلوروفور بشكل منفصل كصبغة لون واحد. وأخيراً، قم بتحضير صبغات "الفلوريسنس ناقص واحد" أو FMO عن طريق دمج جميع الكواشف باستثناء الكاشف المراد دراسته؛ وسيُستخدم ذلك لتحديد الحد الفاصل بين الجمهرة الإيجابية والسلبية من خلال تكرار مستويات التألق الذاتي والبيانات الموجودة في العينات المصبوغة بالكامل.

بعد تحضين الخلايا في صبغة تحديد الخلايا الحية والميتة، اغسلها مرة واحدة باستخدام محلول غسيل التدفق البارد لإزالة الصبغة الزائدة، ثم اسحب محلول الغسيل. بعد ذلك، أضف محاليل التلوين المُحضرة. حضّن الخلايا عند درجة حرارة 4 °C في الظلام لمدة 30 دقيقة.

اغسل الخلايا المصبوغة بمحلول غسيل التدفق البارد لإزالة الأجسام المضادة الزائدة. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول التثبيت والنفاذية BD لمدة 10 دقائق على الأقل. تُحفظ الخلايا عند درجة حرارة 4 °C في الظلام لمدة تصل إلى 24 ساعة حتى يتم استخدامها، أو استمر في عملية وسم السيتوكينات داخل الخلوية لوسم السيتوكينات داخل الخلوية.

أولاً، يتم نفاذ الخلايا في 100 µL من محلول غسيل النفاذية (perm wash buffer) بتركيز 1X، ثم تُحضن لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C في الظلام أثناء حضن الخلايا. يتم تحضير أجسام مضادة للتلوين وعينات ضبط التعويض (compensation controls) وعينات ضبط الوسيط المفقود (FMO controls) في محلول غسيل النفاذية بتركيز 1X كما سبق.

بعد تحضين الخلايا لمدة 10 دقائق، يتم إجراء عملية الطرد المركزي ثم إزالة محلول غسيل النفاذية (perm wash buffer) بتركيز 1x. أضف الأجسام المضادة المناسبة للتلوين. بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا والأجسام المضادة لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C في الظلام.

اغسل الخلايا مرتين بمحلول النفاذية. بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا في Paraform aldehyde بنسبة 1% في DPBS لتثبيت الخلايا. تُحفظ الخلايا في درجة حرارة أربع درجات مئوية في الظلام حتى وقت استخدامها ولمدة تصل إلى 24 ساعة.

بمجرد صبغ الخلايا، استخدم جهاز قياس التدفق الخلوي LSR II أو جهاز قياس التدفق الخلوي CytoDP لإجراء تحليل FACS. ثم قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo أو برنامج مشابه. تم تحديد تكوين PBMC في Maca باستخدام تحليل FACS.

يوضح هذا الشكل مخطط تحديد البوابات (gating scheme) المستخدم لتحليل المجموعات الفرعية المختلفة من الخلايا التائية من حيوان ممثل. تم أولاً تحديد بوابات الخلايا اللمفاوية عبر التشتت الأمامي FSC مقابل التشتت الجانبي SSC، ثم تم تحديد الخلايا اللمفاوية الحية بناءً على SSC والمجتمع السلبي لـ AQUA. بعد ذلك، تم تحديد الخلايا التائية من خلال تعبير CD3، كما تم تحديد المجتمعات الإيجابية لـ CD4 والسلبية لـ CD8، والسلبية لـ CD4 والإيجابية لـ CD8 ضمن مجتمع الخلايا التائية الإيجابية لـ CD3.

تم تمييز الخلايا التائية CD4 الموجبة والخلايا التائية CD8 الموجبة بشكل أكبر إلى مجموعات فرعية مختلفة بناءً على تعبير CD28 وCD95 كخلايا ساذجة وخلايا ذاكرة مركزية وخلايا ذاكرة مستجيبة. يوضح هذا الشكل إنتاج interferon gamma وIL-2 في الخلايا التائية CD4 الموجبة ومجموعاتها الفرعية غير المحفزة وتلك المحفزة بواسطة pma وCIN.

لاحظ ملامح السيتوكينات المتميزة التي نتجت عن التحفيز في كل مجموعة فرعية. سنقوم بتوضيح كيفية إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي المتعدد للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc).

عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر إعداد ضوابط تعويض اللون الواحد وضوابط الفلورسنت ناقص واحد. كلا هذين الضابطين ضروريان للتحليل السليم لبيانات قياس التدفق الخلوي. يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب للحصول على مزيد من المعلومات حول اختيار ضوابط التعويض.

كذلك، يرجى تذكر أنه عند استخدام أجسام مضادة مُوسومة بفلوروسنت، من المهم تغطية العينات لحمايتها من التعرض للضوء. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.