جهاز ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس تركيز البكتيريا في التدرجات مستقرة

يتم إدخال بكتيريا E Coli RP 4 37 في جهاز لقياس الانتحاء الكيميائي حيث تتعرض لتدرجات تركيز مكانية محددة. وعند دخول الخلايا إلى الغرفة، فإنها تصادف نقطة منتصف تدرج التركيز. وبناءً على ما إذا كانت الإشارة قد تم إدراكها كمادة جاذبة أو طاردة، تتحرك البكتيريا بسرعة إما صعوداً أو هبوطاً في تدرج التركيز.

أهلاً بكم، أنا ديريك إنغلر من مختبر التكنولوجيا الحيوية للأنظمة الجزيئية وقسم الهندسة الكيميائية في جامعة تكساس إيه آند إم. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستقصاء الانجذاب الكيميائي البكتيري في جهاز مائع دقيق. نستخدم هذا الإجراء في مختبراتنا لدراسة كيفية هجرة بكتيريا e coli RP 4 37 في تدرج تركيز كبريتات النيكل.

لنبدأ الآن. يتم تصنيع الطبقة المائعية وطبقة التحكم عن طريق القولبة التكرارية لـ Polymethyl SUBOXANE أو PDMS باستخدام قالب SU eight الرئيسي. لبدء هذا الإجراء، اخلط البوليمر الأولي PDMS وعامل الربط التشابكي بنسبة وزنية 10 إلى 1.

قم بإزالة الغازات من الخليط في المجفف لمدة ساعة واحدة حتى يتم التخلص من فقاعات الهواء. عندما يصبح خليط PDMS جاهزاً، ضع قالب SU eight في طبق بتري واسكب الخليط بعناية فوق قالب SU eight حتى الوصول إلى السماكة المطلوبة. سخّن طبق بتري الذي يحتوي على PDMS وقالب SU eight عند 80 °C لمدة ساعتين لمعالجة PDMS.

بعد مرور ساعتين، قم بإزالة قالب SU8 الرئيسي المغطى بـ PDMS المصلد من الصفيحة الساخنة، ثم قم بنزع قالب PDMS عن قالب SU8 الرئيسي. سيكون الهيكل المطلوب مدمجاً في قالب PDMS؛ وباستخدام إبرة ذات طرف غير مدبب بقياس 20 gauge، قم بثقب أربعة ثقوب في قالب PDMS لتوصيل الأنابيب بمولد التدرج، ومدخل الخلايا، ومخرج الخلايا. الآن أصبحنا مستعدين لتجميع جهاز PDMS لربط جهاز PDMS.

أولاً، قم بتنظيف شريحة مجهر زجاجية باستخدام الإيزوبروبانول وجففها باستخدام جهاز Airstream. بعد ذلك، عرض قالب PDMS والشريحة الزجاجية لبلازما الأكسجين في جهاز نقش البلازما لمدة 30 ثانية تقريباً. اجعل قالب PDMS يتلامس مع الشريحة الزجاجية، ثم قم بتسخين الشريحة والقالب المتلامسين إلى 65 °C على لوح تسخين لمدة 15 دقيقة.

لتجميع جهاز PDMS، استخدم شفرة حلاقة لقص الأنابيب بزاوية 45 درجة وبالطول الصحيح المطلوب بناءً على إعدادات المجهر. بعد ذلك، وباستخدام الملقط، أدخل أحد طرفي الأنبوب في إحدى الفتحات الأربع المثقوبة في الجهاز.

أدخل محور إبرة غير مدببة بمقياس 30 في الطرف الآخر من الأنبوب. كرر عملية إدخال الأنبوب ومحور الإبرة في جميع الثقوب المتبقية. اسحب 1 mL من chemo taxes أو المنظم (buffer) أو CB في حقنة سعة 3 mL.

يجب الحرص على إزالة الهواء من المحقنة. أضف CB إلى صرة إبرة المخرج باستخدام ماصة، ثم انقر على صرة الإبرة لإزالة أي فقاعات هوائية. ادفع كمية قليلة من CB من طرف المحقنة سعة 3 mL، ثم قم بتوصيل المحقنة بصرة الإبرة دون حبس الهواء.

ادفع الـ CB عبر الجهاز حتى تمتلئ جميع موزعات الإبر المتبقية بالـ CB. من شأن هذه الخطوة أن تزيل غالبية فقاعات الهواء. بعد ذلك، املأ محقنتين سعة 500 microliter بـ CB يحتوي على التركيزات المناسبة من المؤثر الكيميائي الجاري اختباره.

تجنب تكون فقاعات الهواء عن طريق دفع قطرة صغيرة من محتويات السرنجة ولمس قطرات السائل في محور الإبرة، ثم توصيل السرنجة لتحضير بكتيريا عالية الحركة. ولإجراء تجربة الانتحاء الكيميائي، يتم استنبات مزرعة ليلية من بكتيريا e coli RP 4 37 التي تعبر عن GFP باستخدام بلازميد في مرق التريبتون أو TB عند درجة حرارة 32 درجة Celsius مع الرج في اليوم التالي. استخدم المزرعة الليلية لتلقيح مزرعة سعتها 20 milliliter من TB في دورق إرلنماير سعة 250 milliliter حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 nanometers إلى حوالي 0.05.

قم بتنمية المزرعة عند 32 degrees Celsius مع الرج عندما تكون الخلايا عند OD 600 يتراوح بين 0.35 إلى 0.45 تقريبًا. يتم حصادها عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة، ثم تُعلق الخلايا لتصل إلى OD 600 يبلغ حوالي 0.35 في وسط CB يحتوي على المؤثر الكيميائي بالتركيز المتوقع في منتصف القناة. وأخيرًا، أضف خلايا ميتة مُعلمة بـ RFP عند OD 600 يبلغ حوالي 0.35 إلى الخلايا الحية التي تعبر عن GFP.

ستعمل هذه الخلايا الميتة كضابط داخلي لضمان أن أي هجرة ليست ناتجة عن تأثيرات التدفق. أصبح معلق الخلايا الآن جاهزاً للتحميل في الجهاز الموائع الدقيقة من أجل تجربة الانجذاب الكيميائي. لبدء تجربة الانجذاب الكيميائي، قم بإزالة كمية من CB من محور إبرة مدخل الخلايا وأعد ملأه بمعلق الخلايا.

املأ محقنة سعة 50 microliter بلطف بالخلايا التي تمت إعادة تعليقها. قم بذلك ببطء لأن السوط قد يتعرض للقص، مما سيؤدي إلى تقليل الحركة. قم بتوصيل المحقنة سعة 50 microliter بمحور إبرة المدخل كما هو موضح سابقاً، وذلك عن طريق دفع قطرة صغيرة من محتويات المحقنة ولمس القطرة بالسائل الموجود في محور الإبرة ثم توصيل المحقنة، وضع الجهاز على منصة مجهر فلوري مجهز بكاميرا عالية السرعة لالتقاط الصور.

ضع كِلا محقنتي المدخل في مضخة المحاقن وابدأ التدفق بحيث يتشكل التدرج وتتدفق الخلايا عبر الأنابيب. وبمجرد دخول الخلايا إلى غرفة الانجذاب الكيميائي، انتظر لمدة 20 دقيقة تقريبًا حتى يستقر النظام. وقبل التصوير، قم بالتقاط صور فلورية للخلايا الحية (باللون الأخضر) والخلايا الميتة (باللون الأحمر) في مواقع مختلفة على طول غرفة التفاعل.

عادةً ما نقوم بجمع 100 صورة عند كل موقع بفاصل زمني قدره ثلاث ثوانٍ. يمكن تحليل صور الفلورة التي تم الحصول عليها باستخدام أي برنامج لتحليل الصور متاح تجاريًا مثل Image J أو metamorph، أو باستخدام أكواد بسيطة مكتوبة بلغة matlab. في هذا المثال، سنستخدم أكواد MATLAB.

ابدأ بإزالة بكسلات الخلفية من الصورة من خلال ضبط عتبة كثافة البكسل، وقم بإزالة جميع البكسلات التي تقل كثافتها عن هذه العتبة، وذلك لتقليل الضوضاء. وفي مرحلة التحليل، استخدم موقع الخلايا الميتة لتحديد مركز الصورة.

يمثل هذا الموضع النقطة التي دخلت منها الخلايا إلى حجرة الانجذاب الكيميائي، وهي النقطة التي سيتم رصدها فيها في حالة عدم حدوث أي هجرة. بعد ذلك، حدد موقع الخلايا الحية في الصورة، وقسم الصورة إلى قنوات، ثم حدد عدد الخلايا الحية في كل قناة. في عملنا السابق، تم تقسيم حجرة الانجذاب الكيميائي التي يبلغ عرضها 50 micrometer إلى 64 قناة، يبلغ عرض كل منها حوالي 16 micrometers.

بعد تكرار هذه الخطوات لجميع الصور، يتم جمع إجمالي أعداد الخلايا لكل قناة عبر جميع الصور. يعطي هذا إجمالي عدد الخلايا المكتشفة في كل قناة على مدار فترة التجربة. احسب معامل التجزئة للانجذاب الكيميائي أو CPC، والذي يمثل اتجاه الهجرة.

من خلال تنفيذ الخطوات التالية، يتم تعيين معامل ضرب بقيمة موجب واحد وموجب واحد لكل خلية تقع في الجانب ذي التركيز العالي (الأيمن) وسالب واحد لكل خلية في الجانب ذي التركيز المنخفض (الأيسر) من الخلايا الميتة على التوالي. يتم جمع كافة القيم المضروبة ثم تطبيعها وفقاً للعدد الإجمالي للخلايا المكتشفة. بعد ذلك، يتم حساب معامل الانجذاب الكيميائي أو معامل الهجرة (CMC)، والذي يوازن هجرة الخلايا بناءً على المسافة المقطوعة.

تُمنح الخلية التي تتحرك إلى أبعد موضع ذو تركيز عالٍ في القناة 64 عامل وزن قدره +1، بينما تُمنح الخلية التي تتحرك إلى منتصف جانب التركيز الأعلى عامل وزن قدره +0.5. أما الخلية التي تتحرك إلى أبعد موضع ذو تركيز منخفض فيُعطى وزنها -1. يتم جمع كافة أعداد الخلايا الموزونة وتطبيعها بالنسبة لعدد الخلايا لإنتاج CMC.

يوضح هذا الرسم البياني تدرجاً أو ملفاً خطياً للتركيز تم تكوينه في الجهاز الموائع الدقيق باستخدام fluorescein isothiocyanate. ويظهر في هذا الشكل تكوين تدرج التركيز باستخدام صبغات ملونة باللونين الأزرق والأصفر. كانت فتحة دخول الخلايا مغلقة (CA) بحيث لا يكون هناك تدفق من خلالها، ويمكن ملاحظة تكون نطاق من الألوان بين الأزرق والأصفر.

فيما يلي صور بألوان زائفة من تجربة نموذجية للانجذاب الكيميائي، حيث تعرضت بكتيريا e coli RP 4 37 لتدرج يتراوح من 0 إلى 100 µM من L aspartate أو من 0 إلى 225 µM من كبريتات النيكل في الجهاز. وقد تم تصوير هجرة البكتيريا الحية الخضراء باتجاه L aspartate أو بعيداً عن النيكل كل 2.5 ثانية لمدة 30 دقيقة. أما البكتيريا الميتة الموضحة باللون الأحمر فقد استُخدمت كعينة ضابطة لآثار التدفق داخل الجهاز.

يوضح هذا الرسم البياني التوزيع المكاني لسلالة RP 4 37 في جهاز الموائع الدقيقة في غياب التدرج، وذلك بالمقارنة مع استجابتها لتدرج الأسبارتات وتدرج كبريتات النيكل. لقد عرضنا لكم للتو كيفية مراقبة الانجذاب الكيميائي لبكتيريا e coli RP 4 37 في تدرج من كبريتات النيكل. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تقليل عملية الخلط الدوامي للخلايا لضمان إمكانية استخدام مجموعة فرعية ذات حركية عالية.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.