تحليل الردود من الخلايا العصبية الحسية الشمية ماوس باستخدام تسجيل Electroolfactogram الهواء المرحلة

يتم تثبيت تحضير من الظهارة الشمية على طبق ووضعه في تيار من الهواء المرطب. وباستخدام مجهر تشريحي، يتم توصيل قطب مرجعي كهربائياً بالنسيج من خلال محلول منظم. ثم يوضع قطب تسجيل على سطح الظهارة الشمية.

يتم تحفيز الظهارة الشمية بواسطة نفثات من المواد الشمية يتم التحكم فيها حاسوبيًا وتُقدم ضمن تيار من الهواء المرطب، والذي ينقل المواد الشمية إلى الظهارة الشمية. وتُنقل إشارات تخطيط كهربائية الشم (EOG) عبر مضخم ومحول رقمي إلى جهاز الكمبيوتر الخاص بالتسجيل. مرحباً، أنا كاثرين سيار من مختبر النظافة XO في قسم الأحياء بجامعة جونز هوبكنز.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتسجيل مخطط استجابة الشم الكهربائي (electro olfactogram) من الفئران. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة استجابات العصبونات الحسية الشمية للروائح. لذا، لنبدأ.

يتكون جهاز التسجيل من قطب تسجيل، وقطب مرجعي، وأنبوب لتوصيل الهواء، ومنصة للعينات، ومجهر تشريحي، وجميعها مثبتة على طاولة هوائية داخل قفص فاراداي. تُستخدم المناورات الدقيقة لوضع الأقطاب الكهربائية في أنبوب توصيل الهواء. ويتم تمرير تيار هوائي مستمر عبر ماء مقطر لإضافة الرطوبة قبل مروره عبر أنبوب توصيل الهواء وفوق العينة.

يُستخدم طبق زراعة بقطر 60 مليمتر مملوء بـ agar بسمك يتراوح من ستة إلى ثمانية مليمترات كسطح تثبيت للعينة. ويتم تفريغ بئر وقناة من الـ agar في طبق التثبيت، وذلك لتوفير وسيلة لتوصيل القطب المرجعي كهربائياً بالعينة عبر محلول ringer المعدل.

يتم توصيل قطبي التسجيل والمرجع بمضخم إشارات. تُرسل الإشارات من المضخم إلى جهاز رقمي (digitizer) ومن ثم إلى جهاز الكمبيوتر. يُستخدم برنامج XI graph للتحكم في بروتوكول التحفيز، وتسجيل الإشارة، وتحليل الاستجابات.

يتم توصيل جهاز راسم الإشارة (oscilloscope) بعد المضخم للمراقبة الفورية للجهد الكهربائي أثناء وضع قطب التسجيل، وكذلك أثناء تسجيلات تخطيط كهربائية العين (EOG). ويتم التحكم في تقديم محفزات الروائح بواسطة بخاخ دقيق (pico spritzer)، والذي يكون متصلاً بنفس الكمبيوتر المستخدم في اكتساب الإشارة مباشرة قبل تقديم محفز الرائحة.

يتم توصيل مخرج جهاز الرش المجهري (pico spritzer) بزجاجة رائحة تحتوي على مادة عطرية سائلة. ثم يتم توصيل الزجاجة بأنبوب توصيل الهواء. لننتقل الآن إلى كيفية تحضير الأقطاب الكهربائية لتجارب التسجيل.

قطب التسجيل عبارة عن سلك فضة كلوريد موجود داخل أنبوب شعري زجاجي مسحوب مملوء بمحلول رينجر المعدل. أما قطب المرجع فهو سلك فضة كلوريد. ابدأ بتحضير كلا القطبين عن طريق تركيب سلك فضة في حامل القطب.

بالنسبة لقطب التسجيل، يجب أن يبرز من سنتيمتر واحد إلى سنتيمترين من السلك من نهاية حامل القطب. ويمكن ترك طول أكبر من السلك لقطب المرجع. ولإضافة طبقة كلوريد الفضة، ضع السلك في محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.1 molar وقم بتوصيل حامل القطب بالطرف الموجب لمصدر طاقة تيار مستمر بجهد يتراوح من 1.5 إلى 9 فولت.

يجب توصيل الطرف السالب لمصدر الطاقة كهربائيًا بمحلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.1 مولار. اترك تفاعل الكلوريد يستمر لمدة 10 دقائق لمعادلة أي شحنة استاتيكية بين قطب التسجيل والقطب المرجعي. المس القطبين ببعضهما لفترة وجيزة قبل تركيبهما في جهاز التسجيل.

بعد ذلك، اسحب شعيرية زجاجية باستخدام جهاز سحب الماصات الدقيقة. يجب أن يكون قطر الفتحة عند طرف الشعيرية حوالي 5 إلى 10 ميكرونات. استخدم قلمًا ماسيًا لخدش وكسر الطرف غير المدبب من الشعيرية بحيث تكون أطول من السلك الفضي بحوالي سنتيمترين.

استخدم مشعل بوتان لصقل طرف القطع بالصهر، ثم قم بصهر 0.5% agros في محلول رينجر المعدل. استخدم ماصة نقل لسحب كمية صغيرة من محلول agro المنصهر إلى طرف القطب الكهربائي باستخدام حقنة تم تسخينها وسحبها ليكون لها طرف طويل ورقيق. املأ الشعيرة المسحوبة إلى منتصفها تقريبًا.

باستخدام محلول رينجر المعدل، قم بالنقر بلطف على الشعيرية لإخراج أي فقاعات هوائية. احفظ القطب المملوء في وعاء التخزين الذي يحتوي على كمية صغيرة من محلول رينجر المعدل في القاع حتى يحين وقت الاستخدام. وبمجرد تجهيز عينة النسيج لتصبح جاهزة للتسجيل، قم بتركيب الشعيرية المملوءة فوق سلك قطب التسجيل مع تجهيز الأقطاب.

لنلقِ نظرة على تجربة تسجيل لبدء تحضير الأنسجة من أجل التسجيل. قم بإزالة الجلد الذي يغطي جمجمة الفأر المضحى به، ثم اقسم الرأس طولياً من المنتصف، وثبّت نصف الرأس على طبق التثبيت بحيث يكون الجانب الإنسي للأعلى. قم بإزالة الحاجز الأنفي بعناية للكشف عن القرينات الأنفية.

ضع الطبق الذي يحتوي على النسيج المثبت على منصة التسجيل. قم بمحاذاة المنصة بحيث يكون موقع التسجيل على القرينات الأنفية متمركزاً تحت المجهر. الآن، قم بتشغيل خزان الهواء لتوصيل هواء مرطب بمعدل 600 milliliters per minute تقريباً إلى سطح القرينات الأنفية.

ضع أنبوب توصيل الهواء بحيث يكون على بُعد 10 مليمتر تقريباً من موقع التسجيل. اضبط المضخم على وضع DC، حيث أن تضخيم AC سيؤدي إلى ظهور تداخلات (artifacts) في إشارة EOG. قم بالتحصيل باستخدام مرشح تمرير منخفض بتردد 1 كيلوهرتز وكسب قدره 100 x.

الآن، قم بتثبيت أقطاب التسجيل والمرجع على المناورات الدقيقة. اخفض القطب المرجعي داخل البئر الموجود في طبق التثبيت وغطّه بمحلول رينجر المعدّل بحيث يكون متصلاً كهربائياً بالأنسجة. ثم اخفض قطب التسجيل بعناية فوق سطح القرنية الأنفية 2B أو 3.

يجب أن يلامس القطب الكهربائي سطح الظهارة الشمية بالكاد. وعندما يتصل القطب بالظهارة، سيظهر خط أساس مستقيم على جهاز رسم الاهتزازات (الأوسيلوسكوب). الآن، قم بتوصيل زجاجة المادة العطرية بالمنفذ الجانبي الموجود في أنبوب توصيل الهواء المتصل بالحاسوب.

ابدأ بروتوكول التحفيز. يجب أن يكون معدل أخذ العينات لاستحواذ البيانات 2 kHz أو أعلى. سيقوم البرنامج بتفعيل نبضة الرائحة وبدء التسجيل.

قد يكون بروتوكول التحفيز النموذجي عبارة عن نبضة واحدة مقترنة بمدة 100 millisecond، أو نبضات مدتها 100 millisecond يفصل بينها فاصل زمني مدته ثانية واحدة، أو نبضة مستمرة لمدة عشر ثوانٍ. وللحد من التكيف، اترك فترة تتراوح من دقيقة واحدة إلى خمس دقائق بين البروتوكولات بعد تقديم تركيزات عالية من الروائح. قد تتبقى روائح متبقية في الأنبوب، لذا اغسل أنبوب الهواء بـ 95%ethanol وجففه قبل المتابعة مع عينات أنسجة إضافية.

يوفر برنامج Axo graft أدوات لقياس المعلمات الرئيسية لإشارة EOG. وتشمل هذه المعلمات سعة الاستجابة، وفترة الكمون، والزمن اللازم للوصول إلى الذروة، وثوابت زمن الإنهاء. وتعد عدة معلمات من EOG مفيدة بشكل خاص لمقارنة الاستجابات المعيارية بين الفئران، بما في ذلك سعة الاستجابة، وزمن صعود فترة الكمون، والزمن اللازم للوصول إلى الذروة، وثابت زمن الإنهاء.

تظهر هنا الـ OGs من فأر استجابةً للتحفيز بتركيزات متزايدة من أسيتات الأميل السائلة. يشير الخط الأسود في الأعلى إلى توقيت ومدة التحفيز بالرائحة. نرى هنا علاقة الاستجابة للجرعة كمتوسط لخمسة فئران، وتمثل أشرطة الخطأ فواصل ثقة 95%.

غالباً ما يُلاحظ انخفاض في سعة الذروة عند تركيزات الروائح العالية جداً. يظهر مثال على تخطيط كهربية الشم (EOG) استجابةً لتحفيز نبضي مزدوج، حيث تستحث نبضة قصيرة واحدة من المادة الشمية حالة من التكيف تستمر لعدة ثوانٍ. وموضح هنا تخطيط كهربية الشم (EOG) استجابةً لتحفيز شمّي مستمر لمدة 10 ثوانٍ.

يُظهر تخطيط كهربية الشم (EOG) فقدان الحساسية أثناء العرض المستمر للمادة الشمية. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تسجيل تخطيط كهربية الشم من الفئران. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر وضع القطب الكهربائي على سطح الظهارة فقط وعدم اختراقه تحت السطح.

قم دائمًا بالتسجيل من نفس الجانب من الرأس وتجنب إجراء تعديلات على الإعداد لتقليل التباين، حافظ على رطوبة النسيج، ولكن دون تجميع قطرات سائلة؛ إذ إن وضع النسيج تحت الهواء المرطب مباشرة بعد التشريح سيبقي النسيج في أفضل حالة للتسجيل. هذا كل شيء. شكرًا للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.