العزلة والإثراء من خلايا فأر الجذعية الوسيطة (MSCS) والفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة

يتم عزل الخلايا الجذعية الميزنشيمية، والتي تُختصر بـ MSCs، من جرذ أنثى من سلالة rag dolly يبلغ عمرها من ستة إلى ثمانية أسابيع، وتُستنبت في طبق بتري بقطر 10 سنتيمتر حتى تصل درجة تلاقي الخلايا (confluency) إلى حوالي 80%. ولإثراء الـ MSCs، تُصبغ الخلايا بأجسام مضادة أولية مقترنة بالبيوتين، تليها حبيبات مغناطيسية مقترنة بالستريبتأفيدين. ثم تُفصل الخلايا الموصومة إلى جزأين، الجزء السلبي والجزء الإيجابي، عن طريق فرز الخلايا المنشط مغناطيسياً.

بعد ذلك، يُستخدم تحليل قياس التدفق الخلوي للتأكد من تعبير واسمات السطح. وأخيراً، تُستخدم أسطوانات الاستنساخ للحصول على خلايا جذعية ميزنكيمية (MSCs) مشتقة من مستعمرة واحدة. مرحباً، أنا لي من مختبر كريستينا تشانغ في قسم الهندسة الكيميائية وعلم المواد بجامعة ولاية ميشيغان.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل وإثراء الخلايا الجذعية لـ chy، بالإضافة إلى الحصول على خلايا مشتقة من مستعمرة واحدة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة سلوكيات التكاثر والتمايز للخلايا الجذعية الحمراء. لذا، فلنبدأ.

سيتم عزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية أو MSCs من أنثى جرذ من سلالة spra dolly يتراوح عمرها بين ستة إلى ثمانية أسابيع. لبدء هذا الإجراء، يتم قطع عظمي الفخذ والظنبوب من الأطراف الخلفية للحيوان الذي تم قتله رحيمًا. يتم إزالة الجلد والعضلات، ثم توضع عظام الفخذ والظنبوب المستأصلة في 70%isopropanol لبضع ثوانٍ، ثم تُنقل إلى one X-D-P-B-S.

يجب تنفيذ الخطوات التالية داخل كبينة السلامة البيولوجية. أولاً، انقل عظم الفخذ وعظم الظنبوب إلى طبق سعة 10 سنتيمتر يحتوي على DMEM. بعد ذلك، وأثناء تثبيت كل عظمة باستخدام الملاقط، قم بقص الطرفين باستخدام المقص.

قم بتثبيت إبرة بقياس 22 gauge في سرنجة سعة 3 mL واملأها بوسط DMEM. أدخل الإبرة في أحد الطرفين المفتوحين للعظمة واغسل النخاع لجمعه في أنبوب سعة 50 mL. كرر هذه العملية من مرتين إلى ثلاث مرات لكل عظمة حتى يتم الحصول على كامل النخاع.

أعد تعليق الخلايا، ثم مرر معلق الخلايا عبر مصفاة خلايا بمسام 70 ميكرومتر لإزالة حطام العظام وتجمعات الدم. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 GS عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد إزالة السائل الطافي عن طريق الشفط، أعد تعليق الخلايا في 25 ملليلتر من وسط استنبات MSC.

أضف 10 milliliters من معلق الخلايا إلى كل من طبقي زراعة بقطر 10 centimeter. يتم تحضين أطباق الزراعة في حاضنة عند 37 degrees Celsius و5%carbon dioxide لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين. وبمجرد أن تصل خلايا MSCs المستخلصة من الجرذ مسبقاً إلى درجة تلاقي تبلغ حوالي 80%، يتم سحب الوسط وإضافة من أربعة إلى خمسة milliliters من trypsin EDTA إلى كل طبق.

أعدِ الأطباق إلى الحاضنة واتركها لتحضن لمدة خمس دقائق تقريبًا. وللسماح بانفصال الخلايا، أضف كمية مساوية من وسط الزرع لإبطال مفعول التريبسين. اجمع معلقات الخلايا في أنبوب سعة 15 milliliter وقم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 GS في درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة خمس دقائق.

سنقوم الآن بتوضيح كيفية إثراء الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) باستخدام علامتين سطحيين هما CD 54 و CD 90. باستخدام مغناطيس BD I، وهو مغناطيس لفصل الخلايا من إنتاج شركة BD Biosciences. ابدأ بإعادة تعليق كتلة الخلايا في محلول منظم لصبغ الخلايا بتركيز 20 million cells per milliliter.

بعد ذلك، أضف أجساماً مضادة لـ CD 54 مبيوتناً وأجساماً مضادة لـ CD 90 مبيوتناً إلى معلق الخلايا، وامزجهما بلطف. بعد التحضين على الثلج لمدة 15 دقيقة، اغسل الخلايا الموّسمة بحجم زائد من محلول BD IMAG buffer بتركيز one X. قم بطرد الخلايا الموّسمة مركزياً عند 200 GS في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. جهّز حبيبات BD imag streptavidin عن طريق الرج الشديد باستخدام جهاز vortex، ثم أضف 40 µL من الحبيبات لكل 10 مليون خلية.

امزج الجسيمات مع الخلايا الموصومة جيداً، ثم قم بتحضين الخلايا عند درجة حرارة من 6 إلى 12 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة. وخلال فترة التحضين هذه، قم بتمييز أنبوب اختبار مستدير القاع لجمع الجزء الموجب. وعند انتهاء عملية التحضين، اجعل حجم الوسم يصل إلى 20 مليون خلية لكل milliliter.

باستخدام منظم Expedia I mag. انقل الخلايا الموصومة إلى أنبوب تجميع الجزء الموجب. ضع أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس BDI واتركه لمدة ست دقائق.

بعد ذلك، وبينما لا يزال أنبوب الجزء الموجب على مغناطيس BDI، قم بإزالة الطافي باستخدام ماصة باستير زجاجية. بعد ذلك، ارفع أنبوب الجزء الموجب عن مغناطيس BDI وضعه على الثلج. أضف 1 mL من منظم XBDI mag buffer المبرد على الثلج وأعد تعليق الخلايا عن طريق المزج اللطيف.

أعد الأنبوب إلى مغناطيس BDI واتركه لمدة تتراوح من دقيقتين إلى أربع دقائق. قم بإزالة السائل الطافي باستخدام ماصة باستير زجاجية جديدة. كرر عملية الغسيل كما هو موضح سابقاً.

مرة أخرى. وأخيراً، قم بإزالة السائل الطافي باستخدام ماصة باستير زجاجية جديدة. ثم قم بإزالة الأنبوب من حامل المغناطيس BDI.

قم بتعليق الخلايا في 1 milliliter من وسط الزرع وانقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 50 milliliter يحتوي على 25 milliliters من وسط الزرع. دورق مربع بمساحة 75 centimeter square للحفاظ على الخلايا. وطبق قطر 10 centimeter لتحليل التدفق الخلوي.

لبدء إجراء فصل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) المشتقة من مستعمرة واحدة، يتم استزراع الخلايا بكثافة تتراوح بين 50 إلى 100 خلية لكل طبق قطر 10 centimeter، وتُحضن في حاضنة بدرجة حرارة 37 degree Celsius و5% carbon dioxide لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين. خلال هذه الفترة (أسبوع إلى أسبوعين)، يتم فحص المستعمرات المعزولة جيداً باستخدام مجهر مقلوب. وبمجرد وصول المستعمرات إلى حجم كافٍ يتجاوز 100 خلية في كل مستعمرة، يتم تحديد هذه المستعمرات باستخدام قلم تحديد دائم في الجزء السفلي من الطبق.

عند اختيار مستعمرة لتمييزها، تأكد من عدم وجود مستعمرات محيطة قريبة منها. اشفط الوسط واغسل الطبق مرة واحدة باستخدام one X-D-P-B-S بواسطة الملقط. التقط أسطوانة استنساخ معقمة وضعها برفق حول المستعمرة المميزة.

كرر هذه العملية حتى يتم وضع أسطوانة استنساخ فوق كل مستعمرة محددة. أضف 100 microliters من tripsin EDTA إلى كل أسطوانة استنساخ وأعد الطبق إلى الحاضنة. بعد خمس دقائق، افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت بدأت في التكور.

عندما تنفصل الخلايا، أضف كمية مساوية من وسط الزرع لتعطيل تأثير التربسين. اخلط معلق الخلايا باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر وانقل معلق الخلايا إلى طبق قطر 60 مليمتر يحتوي على ثلاثة مليلتر من وسط زرع مسبق التدفئة. قم بتسمية الأطباق ثم أعدها إلى الحاضنة بعد عزل الخلايا الملتصقة بالبلاستيك.

يجب أن تكون الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) مرئية في اليوم التالي لعملية الزراعة. ومع استمرار تكاثر الخلايا، يجب أن تبدو الخلايا الملتصقة (Confluence cells) مثل الخلايا الموضحة في صورة تباين المرحلة هذه، حيث يكون معظمها شبيهاً بالمغازل أو النجوم. وتكون الزراعة مناسبة عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80% من الالتصاق (co fluency).

بعد عملية التريبسين (trypsinization)، يجب أن تبدو الخلايا المنفصلة مستديرة وعائمة في الوسط. وبمجرد إثراء الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) عن طريق فرز الخلايا المغناطيسي، يتم إجراء قياس التدفق الخلوي للتحقق من تعبيرات العلامات السطحية. إذا كان الإثراء جيداً، يجب أن تظهر الخلايا صبغاً إيجابياً ضد علامات MSCs، وهما CD 54 و CD 90، ولكن صبغاً سلبياً ضد علامة HSC وهي CD 45؛ وتستخدم عناصر التحكم في النمط المناعي IgG two A و IgG one كعناصر تحكم سلبية.

عندما يتم توزيع الخلايا بكثافة نسيلية مناسبة، يجب أن تنمو المستعمرات من خلايا مفردة كما هو موضح في هذا المثال. يمكن بعد ذلك استخدام أسطوانات الاستنساخ لفصل المستعمرات، ومن ثم زراعة الخلايا المشتقة من هذه المستعمرات بشكل منفصل. في هذين المثالين، تبدو الخلايا المشتقة من إحدى المستعمرات مغزلية الشكل، بينما تبدو الخلايا المشتقة من مستعمرة أخرى مستديرة.

لقد أوضحنا لكم كيفية عزل وإثراء الخلايا الجذعية العشوائية والشائعة، وكذلك كيفية الحصول على خلايا مشتقة من مستعمرة واحدة. وأثناء هذه العملية، من المهم تذكر التخلص من تخثرات الدم وبقايا العظام أثناء العزل. كما يجب استخدام الكمية المثلى من الأجسام المضادة أثناء الإثراء، وتمييز المستعمرات المعزولة جيداً أثناء عملية فصل المستعمرات.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.