عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

لإجراء التشابك، يليه الترسيب المناعي. تُحضن الخلايا عند كثافة 80 إلى 90% مع 1 mM من DSP المبرد بالثلج في PBS، أو الكالسيوم، أو المغنيسيوم، أو DMSO فقط.

مجموعة التحكم بالمركبة. يعتبر DSP رابطًا تشابكيًا متجانسًا ثنائي الوظيفة، نفاذًا عبر الغشاء وقابلًا للاختزال، حيث يربط الجزيئات الحرة التي تقع ضمن مسافة 12 angstroms من بعضها البعض. وبعد عملية الربط التشابكي، يتم تحلل الخلايا وإجراء عمليات الترسيب المناعي باستخدام ضوابط قياسية.

يتم بعد ذلك فصل المعقدات البروتينية بواسطة الفصل الكهربائي للهلام بوجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS page) المختزل، حيث تقوم العوامل المختزلة بشطر مادة DSP، مما يسمح بتحديد البروتينات الفردية عن طريق اللطخة المناعية. مرحبًا، أنا ستيفاني إيك من مختبر الدكتور فيكتور فوندي في قسم بيولوجيا الخلية بجامعة إيموري. وأنا بيرل رايدر، أيضًا من مختبر فوندي.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل المعقدات البروتينية باستخدام الربط التشعبي المتحكم به، يليه الكروماتوغرافيا المتقاربة المناعية المغناطيسية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعلات البروتينية العابرة وغير المستقرة. لذا، فلنبدأ.

ابدأ بتسمية الجزء السفلي من أطباق الخلايا للإشارة إلى نوع الخلية والظروف التجريبية المحددة. يشير الرمز الموجب هنا إلى المعاملة بـ DSP، مع تضمين ضابط مركبة سلبي يحتوي على DMSO فقط. أضف الوسط الغذائي إلى الأطباق لتحضيرها لعملية استزراع الخلايا.

تم استزراع خلايا HEK بتخفيف يتراوح من واحد إلى خمسة للسماح بعزل 500 micrograms من البروتين لكل تفاعل في أنبوب قياسي. قد يكون أنبوب واحد كافياً لتحديد شركاء الارتباط المفترضين لبروتين معين عن طريق اللطخة المناعية من تحليل مطيافية الكتلة. قم بزيادة عدد التفاعلات القياسية بمقدار 10 مرات على الأقل.

قم أيضاً بتجهيز مخزونات لمعظم المحاليل المستخدمة في تجربة التشبيك. وتشمل هذه المحاليل محلول PBS المضاف إليه 0.1 millimolar من كلوريد الكالسيوم وone millimolar من كلوريد المغنيسيوم، والذي يُسمى PBS calcium magnesium. وتعد إضافة أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم أمراً بالغ الأهمية لالتصاق الخلايا بطبق الزرع.

خلال فترة التجربة، يُحفظ المحلول عند درجة حرارة 4 °C. وتشمل المخزونات الأخرى محلول إخماد عامل الربط التشعبي، ومزيج مثبط البروتياز الكامل بتركيز 50X، والذي يتم رجّه بواسطة جهاز المرج (vortex) كل 20 دقيقة حتى تذوب الكتلة المترسبة. بالإضافة إلى Triton X 100 بتركيز 20%، والذي يُحفظ عند درجة حرارة 4 °C ويجب استخدامه خلال شهر واحد، ومحاليل Buffer a بتركيز 10x و1x.

قم بتحضير وتخزين جميع المحاليل كما هو مفصل في البروتوكول المكتوب المرفق. وأخيراً، قم بتحضير محلول التحلل (lysis buffer) المكون من محلول منظم بتركيز 1X مضافاً إليه 0.5% TRITTON X 100، ومحلول الترسيب المناعي المغناطيسي (immuno magnetic precipitation buffer) أو محلول الترسيب المناعي (IP buffer) المكون من محلول منظم بتركيز 1X.

أضف 0.1% TRITTON X 101، وبعد يومين من الزراعة، تصل الخلايا إلى درجة تلاقي بنسبة 80 إلى 90%، وهي الدرجة المثالية للربط التشابكي. وفي حالات التلاقي العالية، تميل الخلايا إلى التراكم فوق بعضها البعض، مما يؤدي إلى انخفاض وصول الرابط التشابكي النفاذ للخلايا إلى جميع الخلايا. ضع الأطباق مرة أخرى في المحضنة حتى يحين وقت الربط التشابكي.

قم بتحضير محلول الرابط المتقاطع DSP مباشرة قبل تطبيقه على الخلايا. يتميز DSP بكونه كارهاً بشدة للماء، ولذلك يتم إذابته في DMSO بتركيز 100 millimolar قبل تخفيفه في محلول PBS calcium magnesium buffer. ولتعزيز عملية تخفيف DSP في محلول PBS calcium magnesium buffer بشكل أكبر، قم بتدفئة الحجم المناسب، ثم أضف 10 µL من المحلول المخزون لـ DSP وDMSO.

لكل مليلتر واحد من محلول PBS الكالسيوم والمغنيسيوم الدافئ، أضف المحلول المخزون من D-S-P-D-M-S-O قطرة تلو الأخرى مع الخلط المستمر حتى يذوب كل الـ DSP. كما يجب تحضير محلول تحكم ناقل يتكون من 10 ميكرولتر من DMSO لكل مليلتر من محلول PBS الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد تخفيف DSP، احتفظ بجميع محاليل PBS الكالسيوم والمغنيسيوم في حمام مائي مبرد بالثلج لمدة لا تتجاوز 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بتجهيز حمام مائي مثلج يتسع لجميع الأطباق المستخدمة في التجربة. ثم انتقل إلى إخراج أطباق المزرعة التي تحتوي على الخلايا من الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C وضعها فوراً في الحمام المائي المثلج. اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول PBS calcium magnesium مبرد بالثلج، مع استخدام نفس الأحجام التي تم تحضيرها مسبقاً للتحضين مع الرابط التشابكي؛ بالنسبة للأطباق ذات الست فتحات، احسب 2 mL لكل فتحة وهكذا.

بعد عملية الغسيل الثانية، أضف إما ضابط الناقل (vehicle control)، وهو DMSO المذاب في المحلول المنظم، أو محلول منظم الربط التشابكي DSP إلى الخلايا، ثم قم بالتحضين على الثلج لمدة ساعتين، مع التحقق كل 20 دقيقة تقريباً للتأكد من أن جميع الخلايا مغطاة بالمحلول. وفي حال انكشاف بعض الخلايا، قم بإمالة الطبق وتدويره لتغطيتها بشكل متساوٍ مرة أخرى؛ ومن الطبيعي أن يترسب مقدار صغير من DSP.

أثناء فترة الحضانة لمدة ساعتين مع الخلايا، وقبل انتهاء هذه الفترة، قم بتحضير محلول إخماد DSP بتركيز 1X عن طريق تخفيف المادة الأصلية في محلول PBS يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. احتفظ بالمحلول على الثلج حتى يحين استخدامه لإيقاف تفاعل الربط التشابكي من خلال تثبيط جزيئات DSP التي لم تتفاعل. عند اكتمال الساعتين، قم بإزالة محلول التحكم في المركبة ومحاليل الربط التشابكي من الخلايا.

أضف محلول إخماد DSP المبرد بالثلج واتركه في الحاضنة على الثلج لمدة 15 دقيقة. في هذه الأثناء، خفف مخزون كوكتيل مثبط البروتياز الكامل بنسبة 1 إلى 50 في محلول تحلل الخلايا. بمجرد انتهاء الـ 15 دقيقة، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS calcium magnesium.

ثم أضف محلول التحلل (lysis buffer) الذي يحتوي على مثبطات البروتياز إلى الخلايا، وقم برجها عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد مرور 30 دقيقة من تحلل الخلايا، استخدم كاشطة الخلايا لجمع الخلايا من الطبق. تأكد من الاحتفاظ بالتحللات على الثلج لتقليل نشاط البروتياز إلى أدنى حد.

قم بطرد محللات الخلايا مركزياً لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius في جهاز طرد مركزي صغير مكتبي وبأقصى سرعة تصل إلى 15,000 Gs. انقُل السائل الطافي بواسطة الماصة إلى أنبوب جديد وتخلص من الراسب. قم بتحليل مستويات البروتين باستخدام مقايسة Bradford ثم ابدأ بعملية الترسيب المناعي. ابدأ في التحضير للترسيب المناعي فور البدء في تفاعل الربط التشابكي الذي يستغرق ساعتين في أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات غطاء لولبي.

اخلط 30 µL من حبيبات anti IgG المناعية المغناطيسية مع 500 µL من منظم IP. أضف الجسم المضاد الخاص بالهدف المراد دراسته. يجب تحديد الكمية المناسبة من الجسم المضاد لكل مستضد على حدة.

في التجارب الأولية، تشمل الضوابط السلبية المحتملة للحبيبات عدم استخدام الأجسام المضادة، أو استخدام الحبيبات فقط، أو حبيبات تحتوي على جسم مضاد ضابط من النوع النظيري لربط الجسم المضاد لعملية الترسيب المناعي (IP) بالحبيبات المغناطيسية. يتم التحضين في هزاز دوراني لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. وفي نهاية فترة التحضين، يتم تدوير الأنابيب بسرعة قصيرة ثم إدخالها في الحامل المغناطيسي، حيث ستتجمع الحبيبات عند جانب المغناطيس.

قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة غير المرتبطة واغسل الخرزات فوراً لمنع جفافها. بعد غسلتين، أضف 500 µL من مستخلص خلوي DSP سلبي أو DSP إيجابي بتركيز 1 µg/mL إلى الأنابيب المناسبة. يمكن إعداد ضابط سلبي لمنافسة الببتيد في هذه المرحلة عن طريق إضافة الببتيد المولد للمناعة بتركيز تم تحديده في تجارب أولية إلى خليط الخرزات والمستخلص.

من الممكن أيضاً تحضير ضابط سلبي آخر في هذه المرحلة، وهو عبارة عن تفاعل يحتوي على المنظم فقط أو تفاعل خالٍ من المستخلص، وذلك عن طريق إضافة 500 microliters من منظم التحلل فقط إلى الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات برفق للتفاعلات التجريبية وتفاعلات الضابط. لا تستخدم جهاز الرج vortex لأن ذلك سيؤدي إلى تكسر الحبيبات، ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع تدوير الأنابيب بشكل رأسي (end over end rotation) لمدة ساعتين.

بعد مرور ساعتين، قم بإزالة المادة المستخلصة (lysate) باستخدام الحامل المغناطيسي. قم بإجراء دورة طرد مركزي سريعة واغسل الخرزات ست مرات إجمالاً باستخدام 1 mL من منظم الترسيب المناعي (IP buffer)، مع تحضين كل غسلة عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق.

لإخراج المعقدات المرتبطة، أضف واحد x من منظم عينة الهلام إلى أنبوب الترسيب المناعي (IP) فوق كتلة الخرز مباشرةً. ولتجميع الخرز في قاع الأنبوب، قم بالنقر بلطف على قاع الأنبوب لضمان إعادة تعليق جميع الخرزات في منظم عينة الهلام. بدلاً من ذلك، بالنسبة للعزل المناعي، أضف 30 microliters من المنظم أ المضاف إليه الببتيد المولد للمناعة إلى الخرز.

يتم تحديد التركيز المطلوب للببتيد المناعي تجريبياً. بعد اختبار نطاق يتراوح من 10 إلى 200 micromolar، تُحضن الخرزات عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة ساعتين، مع نقر الأنابيب كل 30 دقيقة. استخدم الحامل المغناطيسي لإزالة 30 microliters التي تحتوي على المعقدات المستخلصة وحفظها في أنبوب نظيف، ثم اغسل الخرزات باستخدام IP buffer وقم بحفظها.

أضف مقدار 1x من محلول عازل عينات الهلام (gel sample buffer) إلى الخرزات لكلتا طريقتي الاستخلاص. قم بتسخين خرزات المناعة المغناطيسية المعاد تعليقها في محلول عازل عينات الهلام عند 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، بالإضافة إلى مسخ البروتينات. ستعمل هذه الخطوة أيضاً على شطر جزيء DSP، مما يسمح بفصل البروتينات الفردية في المعقد أثناء التشغيل.

العينات على هلام SDS page من أجل لطخة ويسترن. يمكن طرد خرزات المناعة المغناطيسية الفارغة عن طريق الطرد المركزي وإزالتها من العينة باستخدام حامل مغناطيسي قبل التحميل. إذا كانت وحدة EUA ذات الألفة المناعية خالية من IgG، سواء عن طريق صبغ البروتين في SDS page أو عن طريق اللطخات المناعية، فإنها تكون مناسبة لمطياف الكتلة.

هنا مثال على تحليل لطخة غربية (western blot) لمواد مستخلصة من تحللات خلوية مرتبطة تشابكياً وغير مرتبطة تشابكياً، تلاها ترسيب مناعي مغناطيسي باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة ضد الوحدة الفرعية AP three. يتيح الربط التشابكي الكشف عن البروتينات المتفاعلة التي لا تظهر في العينات غير المرتبطة تشابكياً أثناء عمليات العزل المناعي المغناطيسي. لم تظهر الضوابط السلبية أي سحب بروتيني محدد باستخدام عينات خالية من الأجسام المضادة أو ضوابط مطابقة لنوع الجسم المضاد باستخدام IgG موجه ضد مستقبل الترانسفيرين لكل من العينات غير المرتبطة تشابكياً والمرتبطة تشابكياً.

في هذا المثال، تم استخدام شطف الببتيد ذو الألفة لاستعادة البروتينات المرتبطة بجسم مضاد الترسيب المناعي (IP). لاحظ أن الجسم المضاد المناعي غائب في جزء السائل الطافي ويظل في جزء الخرز أثناء شطف الببتيد. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية عزل معقدات MultiPro غير المستقرة باستخدام الرابط الكيميائي المتقاطع DSP، متبوعاً بالتنقية المناعية بالتقارب المغناطيسي.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على تبريد محلول الخلايا والمحللات الخلوية للحفاظ على التفاعلات غير المستقرة أثناء التشابك وتقليل نشاط البروتياز. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.