تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

يستخدم هذا البروتوكول محفزاً قابلاً للتنظيم يسمح بالتحكم في التعبير البروتيني. في هذه التجربة، نستخدم بلازميد "two micron" عالي النسخ يعبر عن نطاق N two من محفز قابل للكبح بواسطة الميثيونين. ويتم تحويل خلايا الخميرة من النوع البري باستخدام هذا البلازميد.

يتم اختيار البلازميد والمتحولات على أطباق تفتقر إلى uol. وبعد النمو طوال الليل في أوساط انتقائية، يتم مزامنة الخلايا عن طريق توقيف النمو بوساطة الكورتيزول.

أخيرًا، يتم تحفيز التعبير عن طريق نقل الخلايا إلى أوساط تفتقر إلى الميثيونين خلال تجربة السلسلة الزمنية. وتتم مراقبة تركيز البروتين عن طريق لطخة ويسترن، وتطور النمط الظاهري المورفولوجي عن طريق المجهر. مرحبًا، أنا كلوديا من قسم العلوم البيولوجية بجامعة بوردو.

أنا دي باري موجي من مختبر الـ alar ومختبر الـ AL. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحليل تطور النمط الظاهري المورفولوجي كدالة لتركيز البروتين في الجسم المُحفز. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الجوانب المورفولوجية والجزيئية لنمط ظاهري لانقسام الخلايا لوحظ عند التعبير المفرط لنطاق N two لبروتين التكيف الالتقامي absent two.

لنبدأ الآن. يبدأ هذا البروتوكول بإنشاء سلالة من الخميرة تعبر عن البروتين المطلوب دراسته. وفي حالتنا هذه، قمنا بتحويل سلالة الخميرة البرية W 3 0 3 باستخدام DNA بلازميدي عالي النسخ يحتوي على nth two تحت تحكم محفز قابل للكبح بواسطة الميثيونين، حيث يعمل 2 millimolar methionine على تثبيط نشاط محفز met 25.

بينما تسمح الأوساط الخالية من الميثيونين بأقصى قدر من التعبير، اختر ست مستعمرات من طبق يحتوي على خلايا محولة حديثاً وقم بتلقيحها في 50 milliliters من وسط انتقائي يحتوي على 0.2 millimolar ميثيونين في دورق مخروطي، ثم حضنها طوال الليل عند 30 degrees Celsius مع الرج بسرعة 200 RPM. في صباح اليوم التالي، قم بتقدير كثافة الخلايا عن طريق قياس الكثافة الضوئية للمزرعة عند 600 nanometers. انقل ما يعادل 20 OD 600 nanometers لكل milliliter من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم وقم بحصادها عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الخلايا في وسط YPD عن طريق الرج الدوامي لمزامنة الدورة الخلوية بتركيز نهائي قدره 15 micrograms per milliliter من مخزون بتركيز one milligram per milliliter في DMSO. قم بالتحضين لمدة أربع ساعات عند 30 degrees Celsius مع الرج بسرعة 200 RPM. بعد مرور أربع ساعات، تحقق من نسبة الخلايا المتوقفة في مرحلة الانقسام الفتيلي.

انتقل إلى الخطوة التالية بعد الفحص تحت المجهر وعدّ الخلايا التي تحتوي على براعم متساوية الحجم. وفي حال كانت نسبة التوقف عن النمو أكبر من 90% فقط، قم بحصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 2200 RPM لمدة خمس دقائق. وبعد ثلاث غسلات بالماء المثلج، أعد تعليق الراسب في وسط انتقائي يفتقر إلى methionine بكثافة خلوية تبلغ حوالي 0.5 OD 600 nanometers لكل ملليلتر.

انقل نصف حجم الخلايا إلى أنبوب معقم جديد وأضف الميثيونين ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.2 millimolar. سيعمل هذا كعينة ضابطة للتأثيرات الناتجة عن المستويات الأساسية للتعبير البروتيني. أعد كلتا المزرعتين إلى الحاضنة عند درجة حرارة 30 degree Celsius.

يتم تحليل الخلايا لمراقبة تطور النمط الظاهري كل ساعة لمدة ست ساعات عند كل نقطة زمنية. يتم نقل 1 mL من معلق الخلايا من كل مزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (micro fuge tube) معقم، وتُجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم يُسحب الطافي ويُعاد تعليق الراسب في 70 µL من الوسط الغذائي. بعد ذلك، يُضاف 30 µL من ميثيلين الأزرق (methylene blue) من مخزون بتركيز 1 mg/mL في ماء معقم.

بعد ذلك، انقل بواسطة الماصة حوالي 6 µL من هذا المعلق إلى شريحة زجاجية نظيفة، وضع غطاء الشريحة فوق القطرة. اضغط على غطاء الشريحة برفق لتشكيل طبقة رقيقة ومنتظمة من الخلايا بين الأسطح الزجاجية. قسّم غطاء الشريحة إلى تسعة أرباع، والتقط ثلاث صور لكل ربع.

يجب ألا يتجاوز عدد الخلايا في كل حقل 30 خلية للسماح بقياس كمي دقيق. قم بعدها عدد الخلايا التي تظهر النمط الظاهري قيد الدراسة، وهي في هذا المثال خلايا خميرة برعمية ذات براعم مستطيلة و/أو متسلسلة تفشل في الانفصال عن بعضها البعض. نقوم أيضاً بعدد الخلايا الميتة التي يتم تحديدها من خلال لونها الأزرق نظراً لخلل انقسام الخلايا الناتج عن nth.

يؤدي الإفراط في التعبير الجيني المزدوج إلى موت الخلايا لتصور العيوب المحددة للنمط الظاهري في كل نقطة زمنية. انقل مقدار 1 mL من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق كتلة الخلايا في 100 µL من محلول calor white بتركيز 1 mg/mL في ماء معقم، واتركها للحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.

يتيح التلوين بـ calcior white رؤية جدار الخلية. اغسل الراسب ثلاث مرات باستخدام 1× PBS. ثم قم بتعليق الراسب النهائي في 100 µL من PBS.

افحص الخلايا تحت المجهر والتقط صوراً بتكبير 100x باستخدام بصريات الأشعة فوق البنفسجية (UV) لتصوير جدار الخلية. ولتصوير بروتين septin المسمى بـ GFP، التقط صوراً باستخدام مرشح FS E. قم بقياس النسبة المئوية للخلايا التي تعاني من عيوب في جدار الخلية أو سوء تموضع لبروتين septin باستخدام الطريقة الموضحة سابقاً، وذلك بتقسيم غطاء الشريحة إلى تسعة أرباع والتقاط ثلاث صور لكل ربع لغرض العد وتصوير فيديو TimeLapse. يتطلب الفحص المجهري لخلايا الخميرة المفردة استخدام وسائط مدمجة في أسِرّة agar؛ ولإعداد سرير agar.

أولاً، قم بتنظيف شريحة زجاجية ذات تجويف مقعر باستخدام 70% alcohol واتركها لتجف في الهواء. وأثناء جفاف الشريحة، قم بغلي 0.06 grams من agros في خمسة milliliters من وسط انتقائي يفتقر إلى methionine في الميكروويف حتى يذوب agros تماماً وبسرعة. ثم انقل 200 microliters من الوسط الذي يحتوي على agros إلى الشريحة باستخدام الماصة.

التجويف، ثم اقلب شريحة زجاجية نظيفة أخرى فوقها، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة بالأسفل. وعندما يتصلب الجل، حرك الشريحة العلوية بسلاسة بعيداً عن شريحة التجويف، مع الحفاظ على توازي سطحيهما في جميع الأوقات. يضمن ذلك أن يكون سطح قاعدة agarose متساوياً مع سطح شريحة التجويف.

قم بتنظيف منطقة الشريحة المحيطة بسرير الـ agros باستخدام منديل ورقي ناعم. تصبح الشريحة الآن جاهزة للاستخدام عند مرور أربع ساعات. انقل 1 mL من الخلايا من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (microfuge tube) معقم، ثم قم بحصدها عن طريق الطرد المركزي.

قم بسحب السائل الطافي وإعادة تعليق الخلايا في 100 µL من وسط انتقائي طازج يفتقر إلى الميثيونين. ضع الفازلين على حواف غطاء الشريحة، ثم ضع قطرة من معلق الخلايا في مركز طبقة الأغاروس، ووزعها بشكل متجانس من خلال الضغط بلطف بغطاء الشريحة فوقها.

أغلق حواف غطاء الشريحة وثبت موقعه عن طريق تبطين الحواف بطلاء الأظافر. بمجرد جفاف طلاء الأظافر، ضع الشريحة على منصة مجهر مسخنة. نحن نستخدم مجهر Zeiss Axio 200 M مجهز بكاميرا Zeiss Axio camm, MRM الرقمية أحادية اللون لاختيار مجال لا يحتوي على أكثر من 10 خلايا متباعدة بشكل كافٍ، لأن المجال سيصبح مزدحماً بمرور الوقت.

أثناء انقسام الخلايا، يتم التقاط صورة للمجال كل خمس دقائق لمدة خمس ساعات تقريبًا. ولتجنب إعادة ضبط التركيز بشكل متكرر، نقوم ببرمجة برنامج الحصول على الصور لالتقاط بضع صور Zack تلقائيًا عند كل نقطة زمنية.

سيتم اختيار الصورة ذات التركيز الأفضل لاحقاً لتجميع المقطع المرئي؛ ومن أجل ضمان توفير حرارة كافية للخلايا، يمكن استخدام مصدر حرارة خارجي بالإضافة إلى المنصات المسخنة عن طريق ترك الضوء الأبيض النافذ للمجهر مضاءً طوال مدة التصوير. ويمكن دراسة تراجع النمط الظاهري عن طريق تجميع الصور في مقطع مرئي باستخدام برنامج Image J. نعرض هنا نتائج نموذجية للتعبير المفرط للبروتين محل الاهتمام. رقم اثنين.

أولاً، تم تحديد التعبير البروتيني لـ nth two خلال المجرى الزمني للتجربة؛ حيث حُللت نواتج تحلل الخلايا التي تعبر عن HA nth two عن طريق لطخة ويسترن باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة لـ HA. وكما يظهر في اللطخة المناعية، فإن الخلايا التي نمت في وجود 0.2 millimolar من الميثيونين أظهرت تعبيراً بروتينياً أدنى. ومع ذلك، فإن الخلايا التي نمت في أوساط تفتقر إلى الميثيونين أظهرت ارتفاعاً مستمراً في تركيز S two على مدار المجرى الزمني للتجربة.

بعد ذلك، تم تحليل الخلايا التي نمت في وجود أو غياب الميثيونين لمدة ست ساعات، وذلك لأن التركيز المنخفض لـ nth two غير قادر على تحفيز نمط انقسام خلوي أو موت خلوي فقط. تظهر نسبة منخفضة من الخلايا الميتة كما يتضح من لونها الأزرق بعد الصبغ بميثيلين الأزرق. وبالمثل، كان عدد النوى في كل خلية، وتنظيم جدار الخلية والسبتين طبيعياً كما هو متوقع.

وفي المقابل، يؤدي الإفراط في تعبير M two إلى خلل جسيم في انقسام الخلايا وموتها، كما يتضح من السلاسل الطويلة من البراعم المستطيلة المتصلة التي تحتفظ باللون الأزرق عند صبغها بصبغة ميثيلين الأزرق. وتكون معظم الخلايا ذات النمط الظاهري متعددة النوى كما يشير صبغ DPI. كما يظهر صبغ Calcior white تراكمات لرقع جدار خلوي غير طبيعية.

بالإضافة إلى ذلك، يظهر البروتين septin بشكل غير منظم وفي مواقع خاطئة تماماً. يوضح هذا الرسم البياني التقدير الكمي للنمط الظاهري كدالة في الزمن، حيث تمثل الدوائر المفتوحة تركيز 0 millimolar من الميثيونين، بينما تمثل الدوائر المغلقة تركيز 0.2 millimolar من الميثيونين. ونلاحظ هنا أنه مع تراكم تركيز nth two في الخلايا بمرور الوقت، تزداد أيضاً نسبة الخلايا التي تظهر النمط الظاهري لانقسام الخلايا.

تظهر الخلايا الضابطة التي نمت في 0.2 Milli methionine أن تطور النمط الظاهري هو دالة لارتفاع تركيز البروتين وليس بسبب ظروف المزرعة الخلوية. وأخيرًا، تم رصد تطور النمط الظاهري عند زيادة تعبير nth two بواسطة المجهر الفيديو الزمني.

بعد أربع ساعات من nth، تظهر خليتان من الخلايا ذات التعبير المفرط نمطاً ظاهرياً طفيفاً في انقسام الخلايا المورفولوجي. ومع تقدم الفيديو، نلاحظ فترات غير طبيعية وممتدة من نمو البرعم القمي، مما يؤدي إلى ظهور براعم مستطيلة للغاية. كما نلاحظ أيضاً حالات لظهور براعم جديدة قبل حدوث عملية انفصال الخلايا.

بالإضافة إلى ذلك، يُلاحظ بروز براعم من مناطق عدة في خلية الأم، مما يؤدي إلى ظهور شكل متفرع. لقد عرضنا لكم للتو كيفية توصيف وتحليل تطور النمط الظاهري المورفولوجي كدالة لتركيز البروتين في الخميرة البرعمية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر معالجة الخلايا بسرعات الطرد المركزي الموصى بها، حيث إن السرعات الأعلى قد تؤدي إلى تلف الخلايا.

من المهم أيضاً تذكر إضافة methylene blue والكلوريد قبل التصوير مباشرةً، نظراً لسميتهما للخلايا. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.