الحمض النووي القائم على تحديد الأنواع السمكية البروتوكول

يعد نظام تحديد أنواع الأسماك طريقة بسيطة وسريعة ودقيقة تعتمد على الحمض النووي DNA لتحديد أنواع الأسماك الموجودة في عينة معينة. تُعالج عينات الأسماك باستخدام إنزيم proteinase K لتحرير الأحماض النووية في المحلول. بعد ذلك، يتم عزل الحمض النووي الجينومي للأسماك وتضخيمه بواسطة تقنية PCR باستخدام بادئات ترتبط بتسلسلات موجودة في جميع جينومات الأسماك.

يتم بعد ذلك هضم نواتج الـ PCR باستخدام ثلاثة إنزيمات قطع مختلفة، ثم يتم تحليلها باستخدام جهاز Agilent 2100 bioanalyzer. ويمكن استخدام أطوال القطع الناتجة عن تفاعلات الهضم لتحديد نوع السمك باستخدام تعدد أشكال طول قطع التقييد، أو برنامج مطابقة أنماط RFLP. مرحباً، أنا راشيل فورموسا من شركة Agilent Technologies.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحديد أنواع الأسماك بناءً على الحمض النووي DNA. يعد هذا الإجراء طريقة مسح تتيح لكم تحديد أنواع الأسماك الموجودة في العينات الطازجة، أو المجمدة، أو المفرومة، أو المطهوة، أو المجففة، أو المعالجة بأي طريقة أخرى. ويمكن إنجاز ذلك في أقل من يوم عمل واحد.

نستخدم هذا الإجراء لدراسة موثوقية المأكولات البحرية، وهو أمر بالغ الأهمية لصناعة المأكولات البحرية لأن عمليات الاستبدال والتوسيم الخاطئ يمكن أن تؤدي إلى عواقب اقتصادية وبيئية وعواقب تتعلق بسلامة الغذاء. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الصعب بشكل خاص تحديد أنواع الأسماك من خلال التعرف البصري والطرق التقليدية الأخرى. وبمجرد معالجة السمك، يوفر اختبار DNA نتيجة أكثر دقة وموثوقية.

لنبدأ الآن. ابدأ بتحضير العينات لاستخلاص DNA عن طريق وضع 10 إلى 1000 mg من كل عينة من أنسجة الأسماك النيئة أو المطهوة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL لكل سمكة. أضف 220 µL من محلول proteinase K المحضر حديثاً إلى العينة، ثم قم بالماصة صعوداً وهبوطاً لخلط المكونات.

يتم تحضين الأنابيب عند 65 °C لمدة 10 دقائق، ثم تتبع عملية التحضين بالطرد المركزي لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق عند 14,000 Gs لترسيب أي أنسجة غير مهضومة. بعد ذلك، يتم نقل 150 µL من كل سائل طافٍ بعناية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL، مع تجنب نقل أي مواد غير مهضومة في القاع أو مواد زيتية موجودة في الأعلى. سيتم الآن استخدام السائل الطافٍ لاستخلاص DNA الجينومي.

ابدأ عملية استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي (genomic DNA) بإضافة 500 µL من محلول الربط الخاص بالأحماض النووية إلى كل عينة. سيؤدي ذلك إلى وصول الحجم الإجمالي للعينة إلى 650 µL. قم برج العينة بجهاز الفورتيكس (Vortex) حتى تتجانس.

بعد ذلك، انقُل كل عينة إلى كوب طرد مركزي لربط الـ DNA مثبت في أحد أنابيب الاستقبال سعة 2 مل المرفقة في الطقم. أغلق غطاء الأنبوب بإحكام فوق كوب الطرد المركزي. قم بتدوير العينات لمدة دقيقة واحدة عند 14,000 Gs لتحميل الـ DNA على مصفوفة كوب الطرد المركزي.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة أكواب الدوران، وتخلص من الراشح، ثم أعد الأكواب إلى أنابيب الاستقبال. أضف 500 µL من محلول غسيل بتركيز 1x عالي الملوحة. أغلق الأنابيب بإحكام وقم بإجراء عملية الطرد المركزي مرة أخرى بعد انتهاء الطرد المركزي.

تخلص من الراشح، ثم أعد وضع أكواب الطرد المركزي في أنابيب الاستقبال مرة أخرى. الآن أضف 500 µL من الإيثانول بتركيز 80%. أغلق الأنبوب وقم بالطرد المركزي عند 14,000 Gs لمدة دقيقة واحدة.

كرر عملية الغسل بالإيثانول مرتين إضافيتين بعد الغسلة الثالثة في 80% ethanol، مع التخلص من الرشاحات. أعد وضع أكواب الطرد المركزي في أنابيب الاستقبال، وهذه المرة قم بالتدوير لمدة دقيقتين لتجفيف مصفوفة الألياف. الآن، انقل أكواب الطرد المركزي إلى أنابيب تجميع سعة 1.5 milliliter.

أضف 100 µL من منظم الاستخلاص (evolution buffer) إلى كل كوب طرد مركزي مباشرة فوق مصفوفة الألياف الموجودة داخل الكوب. بعد ذلك، قم بتثبيت أغطية أنابيب التجميع على أكواب الطرد المركزي واحفظها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. وبعد انتهاء فترة الحضانة، قم بتدوير العينات بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، تخلص من كوب الطرد المركزي وأغلق الأنابيب بالأغطية. إذا تم قياس تركيزات DNA، فمن المتوقع أن تتراوح التركيزات من 5 ng/µL إلى 500 ng/µL. يمكن الآن تخزين DNA عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد، وللتخزين طويل الأمد، يُحفظ DNA عند درجة حرارة -20 °C أو -80 °C.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام البادئات والكواشف المتوفرة في طقم كواشف P-C-R-R-F-L-P. ووفقاً للبروتوكول المكتوب المرفق، يُوصى بتشغيل كل عينة، بما في ذلك الضابط الموجب والضابط السالب لعدم وجود قالب، في مكررات بينما يكون تفاعل PCR جارياً. قم بتحضير خلطات رئيسية لإنزيمات التقييد لعمليات الهضم باستخدام DTE E one و HAE three و NL three عن طريق دمج المكونات التالية بالترتيب: 1.5 µL من الماء المقطر المعقم، و 0.5 µL من منظم الإنزيم بتركيز 10 x، و 0.5 µL من الإنزيم بتركيز 10 x.

قم بتحضير كمية كافية من خليط كاشف fourex three لجميع العينات بالإضافة إلى حجم تفاعل واحد إضافي. ثم وزع 2.5 µL في كل أنبوب تفاعل مُحدد باسم العينة والإنزيم. وبمجرد اكتمال عملية الـ PCR، أخرج العينات من الجهاز الدوري الحراري وضعها على الثلج.

أضف 2.5 µL من كل ناتج PCR إلى كل أنبوب من أنابيب الهضم التقييدي الثلاثة الخاصة بهذا التفاعل. DDE 1 وHAE 3 وNLA 3. بعد ذلك، استخدم جهاز الرج vortex.

قم بإجراء طرد مركزي لفترة وجيزة ثم حضّن عمليات الهضم عند 37 درجة Celsius لمدة ساعتين. وإذا كان ذلك أكثر ملاءمة، يمكن أيضاً تحضين عمليات الهضم طوال الليل. وبعد عملية الهضم، حضّن التفاعلات عند 65 درجة Celsius لمدة 15 دقيقة.

ثم أضف 1 µL من EDTA بتركيز 60 mM إلى كل أنبوب لإيقاف التفاعل وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس. باستخدام مجموعة كواشف Agilent bioanalyzer، قم بتحضير نواتج الهضم التقييدي وتحميلها في آبار شريحة A DNA وفقاً لدليل المجموعة. وبالنسبة لكل عينة، يجب تحميل جميع نواتج الهضم الثلاثة على نفس الشريحة.

بعد ذلك، قم برج الشريحة بواسطة جهاز الرج (vortex) ثم قم بتحميلها في الجهاز. وبعد انتهاء عملية التشغيل، انتقل إلى سياق المقايسة (assay context) واختر علامة تبويب ملخص الشريحة (chip summary). وفي حقل اسم العينة، أدخل اسم عينة لجميع الآبار الـ 12 في الشريحة لتحديد أنواع الأسماك لعينات DNA المختبرة.

قم بتشغيل برنامج فك تشفير RFLP من خلال النقر على "file". ثم افتح ملف XAD، حيث سيظهر مربع حوار الفتح.

قم الآن بتحديد ملف XAD الخاص بشريحة DNA المستخدمة. وانقر على "فتح" لرؤية قائمة بالعينات المحملة على الشريحة. حدد عمليات الهضم الثلاث المقابلة لعينة DNA الأولى.

حدد إنزيمات القطع التي تم استخدامها تحت عمود الإنزيم في الحقل المسمى min peak height as percent of lower marker. القيمة الافتراضية هي 10% عند الحاجة. يمكن خفض هذه القيمة لتحديد القمم الصغيرة التي تم تفويتها، أو رفعها لاستبعاد القمم الناتجة عن الضوضاء غير المحددة في مخطط الرحلان الكهربائي (electropherogram).

بعد إجراء أي تعديلات على قيمة الحد الأدنى لارتفاع الذروة (min peak height)، انقر فوق reintegrate. الآن انقر فوق calc في أسفل مربع الحوار. ستملأ بيانات طول القطع الناتجة عن تشغيل الـ bioanalyzer الحقول المخصصة في البرنامج.

بعد ذلك، من القائمة المنسدلة للدرجات (score) في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة، اختر dice. إذا كانت عينة الأسماك تتكون من نوع واحد من الأسماك أو مزيج، وفي حال كانت العينة قد تتكون من مزيج، تظهر الجدولة الموجودة في أسفل الشاشة والموسومة بـ "قائمة الدرجات المجمعة" (combined score list). وهي توضح أفضل تطابقات الأنواع بناءً على نتائج تفاعلات الهضم الثلاثة جميعها.

يتم تظليل التطابقات التامة التي تبلغ درجتها واحد باللون الأخضر. أما التطابقات القريبة فتظهر مظللة باللون الأصفر في الجزء العلوي من الشاشة. وتحدد قيمة الحد الأدنى (cutoff value) أصغر حجم للقطعة المستخدمة في التحليل، بينما تحدد قيمة سماحية التطابق (match tolerance value) مدى تقارب طول القطعة مع القطعة المتوقعة لكي تُعتبر تطابقاً.

القيم الموضحة هي الإعدادات الافتراضية ويمكن تعديلها. كرر هذه الخطوات لتحليل عينات DNA المتبقية على الطرف. تم عزل عينات DNA من أربعة أنواع مختلفة من الأسماك، وتضخيمها، وهضمها باستخدام الطريقة الموضحة في هذا الفيديو.

يظهر هنا جل من جهاز تحليل حيوي (bioanalyzer) يعرض عينات الهضم التقييدي باستخدام جهاز Agilent Bioanalyzer ومفكك شفرة RFLP. وتُستخدم أنماط الانحناء في البرنامج لتحديد أنواع الأسماك هنا؛ حيث تم تحديد العينة الأولى بشكل صحيح على أنها سمك تراوت، والثانية على أنها تونة، والثالثة على أنها سمك صخري.

والعينة الأخيرة كرمز محدد. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء تحديد لأنواع الأسماك استناداً إلى DNA باستخدام طريقة P-C-R-R-F-L-P من شركة agilent. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تجنب التلوث الخلطي للعينات نظراً للحساسية العالية لهذه الطريقة.

هذا كل شيء. الآن أصبحت تعرف كيفية تحديد أنواع الأسماك الموجودة في عيناتك بسرعة وسهولة ودقة. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لك بالتوفيق في تجاربك.