التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

نقدم هنا وصفاً شاملاً لتقنية التشريح الدقيق بالليزر المطبقة لإجراء تحليل مقارن لملفات نسخ الحمض الريبي RNA في المناطق المثبطة وغير المثبطة من قرص جناح ذبابة الدروسوفيلا. تتطلب هذه الطريقة كـمادة بيولوجية أقراص صور الدروسوفيلا التي يتم تشريحها يدوياً، وكجهاز رئيسي جهاز تشريح دقيق بالليزر. نحن نستخدم جهاز LI A-L-L-M-D 6,000 وجهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real time PCR).

استخدمنا جهاز BioRad iq. الأدوات الخمس الصغيرة المطلوبة هي: طبق مقعر، وفرشاة رسم صغيرة، وملقط تشريح دقيق، وشريحة قطرة معلقة، وملاقط حشرات مثبتة على إبر محاقن، وإطار معدني بغشاء مسامي، وأنابيب بلاستيكية صغيرة. تتضمن هذه الطريقة الخطوات التالية.

الخطوة الأولى هي تهجين سلالتين مناسبتين من *Drosophila* المعدلة وراثياً من أجل تحفيز إسكات جيني موضعي ومحدد في النسل باستخدام نظام GAL4 UAS. الخطوة الثانية، معالجة إطارات التشريح. الخطوة الثالثة، إعداد جهاز التشريح الدقيق بالليزر.

الخطوة الرابعة، جمع أقراص الجناح التخيلية يدوياً من النسل اليرقي للتزاوج الجيني. الخطوة الخامسة، إجراء التشريح المجهري بالليزر لمناطق محددة من الأقراص التخيلية المحددة بـ GFP. الخطوة السادسة، سيتيح تحليل التعبير النسخي لمناطق متكافئة من المناطق المسكوتة وغير المسكوتة في القرص تحديد التأثيرات الناتجة عن إسكات الجين المستهدف.

سيتطلب تحليل ملف النسخ الحي لـ gene X استخلاص RNA من المناطق التي تم تشريحها مجهرياً، والتحقق من دقة التشريح اليدوي، وتقييم تعبير GFP في العينتين بواسطة R-T-P-C-R، وتقدير كمية تعبير الأهداف المفترضة للجين المكبوت في العينتين بواسطة real time R-T-P-C-R أو عن طريق إجراء تحليل المصفوفات الدقيقة. وفيما يلي مزيد من التفاصيل حول كل خطوة.

الخطوة الأولى هي التهجين الوراثي. يتضمن التهجين الوراثي سلالات متحولة وراثياً من GAL four UAS، ويركز على الحصول على أقراص تخيلية مُسكتة في النسل اليرقي. يتيح نظام GAL four متعدد الاستخدامات تحفيز إسكات جيني محدد وموضعي عن طريق تداخل RNA.

تُدخل سلالة واحدة في التهجين الجين الناقل للمحرك (driver transgene) الذي يعبر عن GAL4 وفق نمط زمني أو مكاني محدد، بالإضافة إلى مراسل UAS-GFP الذي يسمح بتصور نطاق تعبير GAL4. وتُدخل السلالة الثانية جين UAS المستجيب الناقل (responder transgene) الذي يعبر عن الحمض النووي الريبي الصامت على شكل دبوس شعر (hairpin silencing RNA)، والقادر على استهداف الجين X تحديداً بمجرد التعبير عنه في الخلية.

يتم شطر هذا الـ RNA لإنتاج RNA متداخل صغير، قادر على إسكات الجين X المختار بشكل محدد في نسل هذا التزاوج. لا يتم نسخ الجين الناقل للإسكات UAS إلا في تلك الخلايا التي تعبر عن بروتين GAL four، مما يؤدي إلى إسكات الجين X بشكل محدود مكانيًا. ومن بين مجموعة متنوعة من التطبيقات، ركزنا على تحليل ملف نسخ الـ RNA في قرص الجناح الذي تم إسكاته بواسطة محرك Grailed GAL four، والذي يوجه عملية الإسكات المحددة في الحجرة الخلفية.

يتم تحديد منطقة الصمت عن طريق التعبير عن الجين المنقول U-A-S-G-F-P. في الحجرة الخلفية، سيتم تحفيز حدثين: التعبير عن GGFP وإسكات الجين x.

الخطوة الثانية، معالجة إطارات التشريح لتثبيط نشاط RNAs. اغسل شرائح الإطارات وأدوات التشريح بماء DEPC لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة واتركها تجف في غرفة معقمة. ولتثبيط نشاط RNAs، استخدم أنبوباً جديداً سعة 50 ml خالياً من RNAs، مملوءاً بماء DEPC، مع وضع ملقط وشريحة قطرة معلقة وإطار بت داخل الأنبوب.

كلاهما مطلوب لعملية التشريح الدقيق. أغلق الأنبوب، واقلبه رأساً على عقب، ثم اتركه ليتفاعل لمدة ساعة واحدة على الأقل. في درجة حرارة الغرفة، وبعد مرور ساعة، انقل ماء DEPC إلى أنبوب آخر باستخدام الملقط.

ثبت الشرائح داخل الأنبوب لضمان عدم سقوطها، ثم اترك الشرائح تجف داخل الأنبوب. الخطوة الثالثة، إعداد التشريح الدقيق.

أولاً، قم بتشغيل جميع الأجهزة المطلوبة: مصباح الفلورسنت، والمجهر، وبرنامج التشريح المجهري. ستظهر نافذة تحذير تذكرك بتشغيل الليزر أيضاً؛ قم بتشغيله واتركه حتى يسخن بينما تنهي إعدادات التشريح المجهري.

حان الآن وقت تحضير الآبار التي ستُجمع فيها الأنسجة المقطوعة. تتيح معدات القطع بالليزر Leica LMD 6,000 تحميل ما يصل إلى أربعة أنابيب لجمع عينات مختلفة. ولغرضنا، نحتاج إلى أنبوبين فقط.

أحدهما لجمع الأنسجة الصامتة الإيجابية لـ GFP، والآخر لجمع الأنسجة غير الصامتة السلبية لـ GFP باستخدام ملقط دقيق. املأ غطاءي الأنبوبين بـ 20 µL من محلول tri reagent للحفاظ على RNA. الآن أصبح التشريح الدقيق جاهزاً للاستخدام. الخطوة الرابعة، التشريح اليدوي لأقراص تخيل الأجنحة من يرقات ذبابة الدروسوفيلا.

اعزل أقراص الجناح من النسل اليرقي الذي تم الحصول عليه كما وصف سابقاً، وتأكد من عدم تلوث الأقراص بأنسجة أخرى. لتحقيق هذا الهدف، يختلف نهج التشريح تماماً عن ذلك المستخدم عادةً لجمع الكتلة الإجمالية من جميع الأقراص الأصلية. أولاً، اغسل اليرقة في محلول رينجر لإزالة الوسط الملتصق. ثم انقلها إلى شريحة قطرة معلقة واقطع الرأس مع سحب الفم للأسفل على الفور.

استخدم دبابيس الحشرات الآن لتشريح الأنسجة الأخرى بعناية وإزالتها. يوضح المخطط التفصيلي الأحمر أقراص جناح الخيال المراد جمعها. حافظ على خلو الأقراص من الأنسجة الملتصقة، ثم انقل كل قرص جناح معزول بسرعة وبنعومة إلى إطار التشريح لإجراء القطع الفوري.

يجب تكرار هذا الإجراء حتى الوصول إلى عدد إجمالي يبلغ مائة قرص جناحي. الخطوة الخامسة، التشريح الدقيق بالليزر لمناطق محددة من الأقراص الجناحية الموصومة بـ GFP. بمجرد وضع القرص الجناحي الأصلي على الغشاء، يمكنك البدء في عملية القطع.

ضع الإطار على الحامل الخاص به وثبّت الحامل على المنصة الآلية. ابحث عن قرص الجناح الأصلي باستخدام جهاز LMD 6, 000 كمجهر عادي. قم بضبط التركيز عليه ثم حدد منطقة القطع.

ارسم منطقة بيضاوية تتناسب مع كلا جانبي القرص، الجانب الموجب لـ GFP والجانب الآخر. اختر غطاء الأنبوب الذي تريد جمع الجزء الموجب لـ GFP فيه. اضغط على زر Start cut.

يقوم المشرح الدقيق بالمضي قدماً في قطع النسيج وفقاً للسرعة والقوة اللتين قمت بتحديدهما مسبقاً عن طريق اختيار وظيفة التحريك والقطع. يمكنك تحسين عملية القطع يدوياً حتى تسقط قطعة النسيج غير المختارة. يوضح الرسوم المتحركة ثلاثية الأبعاد ما يحدث أثناء عملية القطع بالمشرح الدقيق، حيث يتم تركيز شعاع ليزر على النسيج لإجراء قطع على طول المحيط المحدد.

بمجرد إتمام القطع، تسقط قطعة النسيج في غطاء الأنبوب المختار، وبالتالي في كاشف tri Reagent. بعد القطع الأول، انقل منطقة القطع إلى الجانب الآخر من قرص الجناح لقطع منطقة مكافئة سالبة لـ GFP. وقبل المضي قدماً في عملية القطع الجديدة، تأكد من اختيار غطاء أنبوب مختلف للفصل بين الأنسجة الموجبة لـ GFP والأنسجة السالبة لـ GFP.

اضغط على زر بدء القطع بعد عملية القطع التلقائي. انتقل إلى تحسين القطع يدويًا كما هو موضح في الرسوم المتحركة ثلاثية الأبعاد قبل عملية القطع الثانية. تقوم المنصة الآلية بتحريك غطاء الأنبوب المحدد إلى منطقة القطع.

يتم تركيز شعاع الليزر على النسيج المقطوع على طول المحيط المحدد، وبمجرد إتمام القطع، تسقط قطعة النسيج في غطاء الأنبوب المحدد الذي يحتوي على كاشف Tri. ولجمع مادة كافية، كررنا هذه العملية على مائة من أقراص جناح الخيال (imaginal wing discs). وبمجرد جمع العينات، قم بتفريغ الأنابيب.

هذه خطوة دقيقة قد تؤدي إلى فقدان كل العمل الذي أنجزته حتى الآن، لذا يجب توخي الحذر. أغلق الغطاء بشكل مقلوب وتابع التجربة.

هذه هي العينة التي تحتوي على أنسجة موجبة لـ GFP. وهذه هي العينة الأخرى التي تحتوي على أنسجة سالبة لـ GFP. الخطوة السادسة، تحليل النسخ.

قم بتدوير الأنابيب لفصل السائل عن الغطاء وأضف كاشف Try حتى يصل الحجم إلى 1 mL. قم باستخلاص RNA باتباع بروتوكول كاشف try القياسي من مائة منطقة تبلغ مساحة كل منها حوالي 5,000 µm² . كانت الحصيلة لدينا 1.5 µg من RNA.

نستخدم In Vitro Transcription لتخليق cDNA يحتوي على تسلسلات عشوائية سداسية. تم التحقق من دقة التشريح اليدوي من خلال فحص تعبير GFP في العينتين باستخدام R-T-P-C-R، كما هو موضح في هلام R-T-P-C-R الكمي.

قمنا بتقييم مستويات تعبير الجين X الصامت جنباً إلى جنب مع مستويات التعبير للأهداف المفترضة المحتملة للمسار التنظيمي الذي يتوسطه الجين X. يوضح هذا المخطط مثالاً لمستويات تعبير الجين X وأحد أهدافه المفترضة، والتي سنسميها الجينات Y، وذلك فيما يتعلق بمستويات تعبيرها الأساسية في الحجرات الأمامية والخلفية لأقراص الأجنحة غير المندمجة.

وُجد أن نشاط الجين المختار X قد انخفض إلى 40% عند إسكاته. وفي المقابل، وُجد أن أحد أهدافه المفترضة، الجين Y، قد زاد تعبيره بشكل ملحوظ بمقدار سبعة أضعاف، مما دفعنا للتحقق من الفرضية القائلة بأنه يخضع لتنظيم سلبي بواسطة الجين X. ونستنتج أن النهج التجريبي الموصوف أعلاه يمكن تطبيقه بنجاح للتحقق من الأهداف المفترضة في مسارات تنظيمية متنوعة.