الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

يوضح هذا البروتوكول طريقة المعلوماتية الحيوية المرئية لقياس نمو مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تحليل مقاطع فيديو ذات فاصل زمني تم جمعها في حاضنة icon bio station CT، المجهزة بكاميرا للتصوير المرئي. يتم استنبات مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) حتى تصل درجة تلاقي الخلايا إلى 70%، ثم يُعاد زرعها وتحضينها لمدة 48 ساعة، وبعد ذلك يتم تصوير مستعمرات HESC لمدة 48 ساعة إضافية في جهاز Biot ct. ويتم تحديد معدل النمو باستخدام وصفات تحسين التجزئة والقياس التي تم تطويرها بواسطة برنامج CL quant.

يتم التحقق من صحة الوصفات من خلال المقارنة مع Adobe Photoshop، وهو أداة لتحليل الصور تتيح ملاءمة يدوية دقيقة للأقنعة لكل مستعمرة. ويمكن استخدام المجال الناشئ للمعلوماتية الحيوية للفيديو لأتمتة معالجة البيانات البيولوجية المستمدة من الفيديوهات المجهرية وتحليلها واستخراج المعلومات منها. مرحباً، أنا سيرينا لين من مختبر الدكتور بروو تالبوت في قسم بيولوجيا الخلية وعلم الأعصاب هنا في جامعة كاليفورنيا ريفرسايد.

مرحباً، أنا شون فينو، من مختبر تالبوت أيضاً. ومرحباً، أنا تي ساتيش من برنامج الدراسات العليا في البيولوجيا الخلوية والجزيئية والنمائية. سنعرض لكم اليوم كيفية قياس نمو مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية للفيديو.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لقياس تأثيرات السموم البيئية على سلوك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. سنقوم باستعراض هذا الإجراء في مرفقنا الجديد المخصص للخلايا الجذعية. لذا، دعونا نبدأ.

لتحضير HESC للتحليل بالفيديو، يتم تنمية HESC على أطباق ذات ستة آبار مغلفة بـ matrigel حتى تصل درجة الالتحام إلى 70%، ثم يتم سحب الوسط من بئر واحد يحتوي على HESC وشطفه مرتين باستخدام 1 mL من PBS. يُضاف 1 mL من Accutane ويُحضن لمدة دقيقة واحدة عند 37 °C في 5% carbon dioxide. بعد ذلك، يتم إضافة 10 إلى 12 خرزة زجاجية في البئر ورج الطبق بلطف حتى تنفصل المستعمرات تماماً.

قم بمعادلة Accutane باستخدام 1 ml من وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الوسط المكيف بالخلايا الليفية الجنينية للفأر. اجمع الخلايا المنفصلة بدون الخرز في أنبوب مخروطي سعة 15 ml وقم بالطرد المركزي عند 200 G لمدة ثلاث دقائق. تخلص من السائل الطافي وقم بتفكيك الراسب باستخدام 500 µl من وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الطازج أو M-T-E-S-R. وزع 100 µl من معلق HESC قطرة بقطرة في آبار متعددة من طبق 12 بئر مطلي بالـ matrigel.

قم بهز الطبق ذهاباً وإياباً برفق وافحص المزارع تحت المجهر الضوئي للتأكد من توزيع تجمعات الخلايا بشكل متساوٍ في جميع الآبار. ضع الطبق في حاضنة عند 37 °C و5% carbon dioxide لمدة 48 ساعة لضمان التصاق الخلايا بشكل مسطح ونموها بحجم كافٍ يسهل رؤيته. بعد مرور 48 ساعة، اسحب الوسط المزرعي واغسل الآبار باستخدام 500 µL من PBS لإزالة الخلايا غير الملتصقة، ثم أضف 500 µL من وسط M-T-E-S-R إلى كل بئر.

ضع الطبق على الفور في جهاز Biot CT وابدأ في جمع صور الفاصل الزمني. حاول اختيار مجالات تحتوي على مستعمرات فردية منفصلة من غير المرجح أن تنمو لتتداخل مع مستعمرات أخرى. في هذا البروتوكول، يتم تسجيل الخلايا بالفيديو لمدة 48 ساعة إضافية مع التقاط الإطارات على فترات زمنية مدتها سبع دقائق.

لإنشاء وصفة التجزئة أولاً، قم بفحص الفيديو بالكامل يدوياً للتأكد من أنه يحتوي على مستعمرة واحدة تظل في بؤرة التركيز طوال فترة التسجيل. بعد ذلك، افتح معالج التجزئة في برنامج CL quants وانقر على زر التالي. اختر قناة الصورة الصحيحة ثم انقر على زر التالي.

اختر المطابقة المرنة (soft matching) ثم انقر على "التالي" (Next). حدد منطقة واحدة أو منطقتين مرغوبتين عن طريق رسم دائرة من الحافة الخارجية إلى المنطقة المركزية للمستعمرة. يجب أن تكون هذه المنطقة صغيرة قدر الإمكان، ولكن يجب أن تكون ممثلة للمستعمرة بأكملها.

لا تختر مناطق كثيرة لأن ذلك قد يؤدي إلى تطبيق غير دقيق للقناع. انقر على الزر التالي. اختر "لا أريد مناطق" (Don't want regions) من خلال رسم دوائر حول المناطق التي ليست جزءاً من المستعمرة وليست جزءاً من الخلفية.

تحتوي هذه المناطق على أنماط يجب تثبيطها، مثل الحطام والخلايا الميتة. انقر على التالي. حدد الخلفية عن طريق رسم دوائر حول المناطق التي لا تمثل مستعمرات أو حطاماً أو خلايا ميتة.

يجب أن تكون الخلفية موحدة ومن المرجح أن تظهر في كل إطار. عادةً، نختار الخلفية الرمادية المحيطة بالمستعمرة. انقر على زر التالي.

يجب أن يظهر قناع ملون فوق المنطقة المراد دراستها إذا كان القناع لا يغطي المنطقة المراد دراستها بدقة. يمكن زيادة أو تقليل نطاق عتبة التقسيم الموجود في الزاوية السفلية اليمنى من الشاشة إذا كانت هناك حاجة لتغيير القناع. اختر تحديث مناطق المطابقة المرنة.

يتيح ذلك تغيير المناطق المرغوب فيها أو غير المرغوب فيها أو مناطق الخلفية. إذا كان القناع مرضياً، اختر "تطبيق العتبة" (apply threshold) و"حفظ القناع الخاص بي" (save my mask)، ثم انقر على زر "التالي".

سيظهر القناع بعد ذلك بلون مختلف. اختر "إنهاء" (finish). يجب أن تظهر الوصفة في الزاوية العلوية اليمنى من البرنامج باسم "وصفة التجزئة" (segmentation recipe).

أعد تسمية الوصفة إذا كنت ترغب في ذلك عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن وإدخال اسم جديد. لتطبيق الوصفة، انقر بزر الماوس الأيمن وحرك مؤشر الماوس فوقها.

قم بتطبيق الوصفة (recipe). ستظهر قائمة تتيح اختيار عدد الإطارات المراد استخدامها. اضبط الفاصل الزمني للإطارات على كل 20 إطاراً لضمان دقة القناع.

قم بإجراء فحص عشوائي يدوي لـ 10% من الإطارات التي طُبق عليها القناع لإنشاء وصفة تحسين تعمل على إزالة المناطق غير المرغوب فيها في الحطام. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مجلد وصفة التحسين ثم انقر على "جديد". يجب أن تظهر وصفة تحسين جديدة من مجال الرؤية الأصلي.

مرر الماوس فوق الأيقونات الموجودة في شريط الأدوات لتحديد زر تبديل وحدة التحسين الموجود إلى يمين الصورة وانقر عليه. اختر القائمة المنسدلة للتوسيم. اختر التوسيم للمتصل اختر التوسيم للمتصل اثنين.

يجب أن يظهر شريط مهام جديد. اسحب القناع الأولي من وصفة التجزئة وأفلته في مربع الإدخال. يجب أن يعرض الشريط الآن رقم قناع الإدخال.

اسحب الأيقونة التي تحمل رقم قناع الإدخال إلى أيقونة القناع صفر. ابحث عن الحد الأدنى للحجم (min size) في شريط المهام وقم بتعديل الرقم حتى يتم عرض المنطقة ذات الصلة فقط. تأكد من النقر على تنفيذ (execute) لكل تجربة مطابقة.

بمجرد أن يصبح تعديل الحد الأدنى للحجم مرضياً، انقر فوق وصفة التحسين السابقة في أسفل الشاشة، واختر "حفظ في الوصفة" (save to recipe). سيطلب البرنامج الآن الكتابة فوق الوصفة المحددة، لذا اختر "نعم" (yes) للنقطة. تحقق من وصفة التحسين باستخدام نفس الإجراء المتبع في التحقق من تقسيم النقاط.

إذا كنت راضياً عن وصفات التجزئة والتحسين، فاستمر في إنشاء قالب القياس. للبدء، اختر "create measurement template" من شريط الأدوات الموجود على الجانب الأيمن. في نافذة القياس، اختر "move cursor" فوق شكل خلية الرسوم التوضيحية.

اضغط باستمرار على مفتاح Ctrl وحدد الخلية الموجودة تحت قسم morphology، ثم قم بإلغاء تحديد المعلمة الافتراضية default parameter وتفعيل معلمة المساحة area parameter. بعد ذلك، اخرج من نافذة القالب. حدد الأيقونة.

أنشئ وصفة القياس. أعد تسمية الوصفة. انتقل إلى علامة تبويب القالب وحددها. في الزاوية العلوية اليمنى، اسحب قالب القياس الذي تم إنشاؤه مسبقاً وأفلته فوق نافذة القياس.

انقر على "نعم" للمتابعة في نافذة وصفة القياس، ثم اختر تعيينات القنوات. بعد ذلك، اختر تعيينات قناع تحديد الخلية الكاملة. ثم اختر خيار الخلية الكاملة. وللحصول على قناع محسّن، اختر وصفة القياس من علامة تبويب الوصفة.

في النافذة الرئيسية، اختر أيقونة الحفظ داخل نافذة وصفة القياس. ثم أغلق النافذة، وبعد ذلك أغلق مجال الرؤية وأعد فتحه. انقر بزر الماوس الأيمن على مجلد قائمة الوصفات ثم انقر على "جديد"، واسحب الوصفات بترتيب التطبيق المطلوب إلى قائمة الوصفات، ثم اختر "قفل قائمة الوصفات"، وقم بتشغيل الوصفات بالتتابع على بيانات الفيديو باستخدام برنامج Adobe Photoshop.

تم تحليل الإطار رقم 20 من كل مجموعة من الإطارات لنفس المستعمرات. افتح إطاراً لصورة مستعمرة يدوياً في برنامج Adobe Photoshop. انقر على أداة العصا السحرية (magic wand tool) في شريط الأدوات.

انقر على المنطقة المحيطة بالمستعمرة بحيث يتم تغطية الحقل بالكامل باستثناء منطقة المستعمرة. تأكد من أن الخط المنقط المحيط بالمستعمرة يقع تماماً حول محيط المستعمرة وليس بداخلها. إذا لم يكن الخط المنقط حول المحيط، فقم بتغيير قيمة التسامح (tolerance) في شريط الأدوات العلوي وفقاً لذلك.

انقر على خيار التحرير (edit) في وضع القناع السريع (quick mask mode) في شريط الأدوات، ثم انقر على المستعمرة بحيث يتم تحديدها. انتقل إلى قائمة النافذة (window) المنسدلة وانقر على المدرج التكراري (histogram). يجب ضبط ذاكرة التخزين المؤقت (cache) على القيمة one.

إذا كانت القيمة المخزنة مؤقتًا هي اثنان، فانقر على علامة التعجب في التعبير لتغيير القيمة المخزنة مؤقتًا إلى واحد. سجل قيمة البكسل في جدول بيانات. كرر العملية المذكورة أعلاه لكل إطار رقم 20.

يمكن بعد ذلك تمثيل البيانات التي تم جمعها باستخدام برنامج Photoshop وبرنامج CL quant بيانياً معاً. يوضح البروتوكول الخاص بنا لقياس نمو مستعمرات HESC أحد تطبيقات المعلوماتية الحيوية للفيديو في معالجة مشكلة بيولوجية. نعرض هنا رسماً بيانياً يقارن الزيادة في حجم المستعمرة على مدار 48 hours وفقاً لما تم تحديده باستخدام برنامج CL quant وبرنامج adobe Photoshop.

يوضح الرسم البياني خمس مستعمرات مختلفة تم تحليل كل منها بواسطة كلا الحزمتين البرمجيتين. وتُمثل كل مستعمرة بلون مختلف. وقد استُخلصت الخطوط المتصلة باستخدام برنامج sail quant، بينما جُمعت الخطوط المنقطة باستخدام برنامج Photoshop.

يظهر الرسم البياني للبيانات الخام أن كلا طريقتي القياس متوافقتان بشكل جيد مع مراعاة حقيقة أن المستعمرات لها أحجام بدائية مختلفة. يوضح هذا الشكل البيانات بعد إعادة رسمها كنسبة مئوية للزيادة في حجم المستعمرة. وتتشابه معدلات النمو بغض النظر عن الحجم البدائي للمستعمرة، كما تعطي كلتا وسيلتي التحليل نتائج مماثلة.

يعرض الرسم البياني التالي متوسطات بيانات النسبة المئوية للتغير السابقة في نمو مستعمرات HESC. ويظهر هذا الرسم بوضوح توافقاً جيداً بين التحليل الذي تم باستخدام المعلوماتية الحيوية للفيديو وبرنامج Adobe Photoshop. لقد عرضنا لكم للتو كيفية قياس نمو مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية للفيديو.

عند تنفيذ هذا الإجراء باستخدام مجهر تباين الأطوار، تأكد من تضمين الهالة المحيطة بالمستعمرة لضمان اختيار دقيق للمستعمرات بواسطة البرنامج. ومن المهم أيضاً تذكر أنه يمكن استخدام طرق أخرى للاستزراع والتحضين وجمع مقاطع الفيديو بدلاً من البروتوكول الذي عرضناه. وبمجرد تطوير الوصفات والتحقق من صحتها، فإنها ستجري التحليلات بسرعة أكبر بكثير وبتباين تجريبي أقل من التحليل اليدوي.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.