تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

الهدف العام من التجربة التالية هو توليد سلائف الخلايا الدبقية قليلة التغصن من الخلايا الجذعية الجنينية عبر سلسلة من خطوات الزرع على مدار 30 يوماً. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توليد أجسام جنينية من الخلايا الجذعية الجنينية للفئران لبدء تمايز الخلايا. وكخطوة ثانية، تُعالج الأجسام الجنينية بالجزيئات الصغيرة، حمض الريتينويك والمورفين النقي، والتي تحفز التمايز الموجه للخلايا إلى liga den.

طلائع الخلايا. كخطوة ثالثة، يتم تفكيك أجسام الأجنة إلى خلايا مفردة بعد مرور 22 يوماً إضافية. وفي المزرعة، تكون حوالي 80% من الخلايا عبارة عن OPCs.

بعد ذلك، يتم نقل الفيروسات من نوع bao التي تحمل الوحدة الفرعية NAV 1.2 إلى خلايا OPC المشتقة من MESC من أجل توليد خلايا OPC ذات نشاط كهربائي نبضي؛ وقد تم الحصول على نتائج تظهر التعبير عن مؤشر OPC والخصائص النبضية لهذه الخلايا OBC المشتقة من MESC بناءً على المجهر الفلوري المناعي والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية. مرحباً، أنا بونغ شيانغ من مختبر الدكتور إنغ في قسم بيولوجيا الخلية والتشريح البشري بجامعة كاليفورنيا ديفيس. ونحن تابعون أيضاً لمستشفى شرينرز للأطفال في شمال كاليفورنيا.

مرحباً، أنا فيال راج، من مختبر دينج أيضاً. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران إلى خلايا سلفية للدبقيات قليلة التغصن. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة خصائص أسلاف الخلايا الدبقية قليلة التغصن المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية، وذلك بهدف إنتاج خلايا ذات إمكانات علاجية أفضل.

لنبدأ الآن. اليوم، سيتم توليد الخلايا السليفة للخلايا الدبقية قليلة التغصن أو OPCs من خط الخلايا الجذعية الجنينية للفئران OG two GFP. تحتاج هذه الخلايا الجذعية الجنينية إلى عملية تمرير كل ثلاثة أيام للحفاظ على صحتها عند كثافة مثالية ولمنع التمايز التلقائي. التمرير.

تُحضر خلايا ESS عندما تصل إلى نسبة 70% من التلاحم تحت غطاء التدفق الصفائحي. يتم إزالة الوسط الغذائي عن المزرعة، ثم تُشطف بـ PBS وتُعامل بإنزيم trypsin باستخدام 2 mL من المحلول المسخن مسبقاً.

يتم إجراء عملية التحضين (trip LE express) لمرة واحدة لمدة خمس دقائق عند 37 degrees Celsius. يتم إيقاف التفاعل وإعادة تعليق الخلايا في أربعة milliliters من وسط خلايا MES. تُنقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter ويتم ترسيبها عند 1000 RP لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق عُشر الخلايا في طبق يحتوي على وسط MESL فوق طبقة متصلة من خلايا التغذية المريضة (meth feeders) المُشععة في وسط خلايا MES. بعد ثلاثة أيام، تصل خلايا ES إلى درجة تلاحم تبلغ 70% تقريباً وتصبح جاهزة للنقل أو التعليق لتكوين أجسام جنينية؛ لتحفيز تكوين الأجسام الجنينية وبدء التمايز، قم بهضم مستعمرات خلايا ES الفأرية باستخدام التريبسين كما سبق، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط بديل المصل المزال منه البروتينات (knockout serum replacement) أو وسط KSR. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس دم (hemo TER)، ثم خفف المعلق في وسط KSR.

قم بتوزيع الوسط الذي يحتوي على 15,000 خلية لكل مليلتر بمقدار ثلاثة مليلترات في كل بئر من أطباق زراعة سداسية الآبار ذات الالتصاق المنخفض للغاية. قم باستنبات الخلايا المعلقة عند 37 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. استبدل الوسط بالكامل كل يومين.

بدءاً من اليوم الرابع، استبدل الوسط الغذائي يومياً؛ وفي اليوم الرابع، أضف إلى مكمل KSR حمض ريتينويك بتركيز 0.2 micromolar. وفي اليوم الخامس، أضف كلاً من حمض الريتينويك و primor famine بتركيز one micromolar. وفي اليومين السادس والسابع، قم بتغذية أجسام الأجنة باستخدام وسطين مكملين بحمض ريتينويك بتركيز 0.2 micromolar و primor famine بتركيز one micromolar. وبعد ثمانية أيام من الزرع، فإن غالبية أجسام الأجنة تعبر عن GFP وتصبح جاهزة للتفكيك باستخدام التربسين، ثم قم بعد الخلايا كما سبق.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الخلايا بتركيز 3.5 × 10⁵ خلية/مل في وسط OPC. صُب 3 مل من المعلق في وسط OPC داخل أطباق قطرها 60 ملم ومطلية بالبولي-أورنيثين. ستصل الخلايا إلى مرحلة التلاقي تقريبًا كل أسبوع وستبدو بهذا الشكل؛ حينها قم بنقل الخلايا كما سبق باستخدام التربسين لمدة 3 دقائق.

بعد 30 يومًا من تعليق الإنعاش الأصلي. في وسط KSR، تظهر الخلايا خصائص الخلايا السلفية للدبقيات قليلة التغصن لتوليد OPCs ذات نشاط كهربائي (spiking). استخدم OPCs مشتقة من ESL للفئران وتتراوح نسبة تلاقيها بين 50 و 70%.

استبدل الوسط بـ XPBS لشطف الخلايا. لإدخال الوحدة الفرعية alpha من قناة الصوديوم المعتمدة على الجهد 1.2.

نستخدم طقم قناة الصوديوم back MAM. اخلط 1 mL من المكون A الخاص بـ back MAM مع 4 mL من 1X PBS. قم بإزالة شطف PBS وأضف المكون المخفف.

يتم التحضين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. استبدل عامل الذاكرة الخلفي بوسط OPC المعزز بالمكونين B وC كما هو موضح في الطقم. يتم التحضين لمدة ساعتين إضافيتين عند 37 درجة مئوية وفقاً للتعليمات.

بعد فترة التحضين، استبدل الوسط المعزز بوسط OPC طازج. وبعد 24 ساعة أخرى من الزرع، يمكن اختبار خلايا OPC المشتقة من ESL للتحقق من وجود نتوءات (spiking) عند هذه النقطة الزمنية. أما خلايا EBS فلا تظهر أي فلورة GFP.

تظهر الأجسام الكروية العصبية (EBS) تعبيراً قوياً لبروتين GFP، وتصبح جاهزة للزراعة بالتفكيك بعد حوالي 30 يوماً من تعليق إعادة التوزيع الأصلي. وفي وسط KSR، تكون غالبية الخلايا إيجابية مناعياً لصبغة NG2، وهو ما يتوافق مع تعبير GFP. ومع ذلك، وعلى عكس الخلايا السلفية للدبقيات قليلة التغصن (OPCs) في الدماغ، تفشل هذه الخلايا السلفية للدبقيات قليلة التغصن المشتقة من خلايا MES في إطلاق جهود الفعل حتى عند إزالة استقطاب الخلايا إلى صفر millivolts.

بعد إدخال الوحدة الفرعية NAV 1.2 عن طريق ترنسدكشن فيروسي، تصبح هذه الخلايا السلفية للدراسات قليلة التغصن (OPCs) المشتقة من خلايا MES مستثارة وتطلق جهود فعل. لقد أظهرنا لكم للتو كيفية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران إلى OPCs وتوليد OPCs ذات نشاط نبضي عن طريق الترنسدكشن الفيروسي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تخزين حمض الريتينويك والمورفين و FGF two بشكل صحيح، واستخدام حصص طازجة دائمًا، والتخلص من أي كمية زائدة من حمض الريتينويك بعد الاستخدام.

هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.