متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

يتضمن الاندماج الكهربائي تطبيق نبضات كهربائية قصيرة عالية الجهد على الخلايا الموجودة في سياق متقارب. في هذا الفيديو، نستعرض الاندماج الكهربائي للخلايا في المختبر (in vitro) عن طريق طريقة الالتصاق المعدلة. أجريت التجارب على خلايا ميلانوما الفأر، BF one.

لإجراء التجربة، اتبع الخطوات التالية. قم بنمو الخلايا في قارورتي مزرعة منفصلتين حتى تصل درجة التلاحم إلى 80%. وبشكل منفصل، أضف 2.1 µL من كل محلول مخزون.

أضف 10 millimolar من C-M-F-D-A أو CMRA على التوالي إلى ثلاثة milliliters من Krebs Hess Buffer في أنبوب طرد مركزي. اغسل الخلايا مرتين باستخدام Krebs Hess buffer، ثم أدخل محاليل التحميل في القوارير. تحتوي محاليل التحميل على حوالي سبعة Micromolar من C-M-F-D-A أو CMRA على التوالي.

قم بتحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة في جو متحكم به. وخلال فترة التحضين الأولى هذه، تعبر المناطق بحرية عبر أغشية الخلايا إلى العصارة الخلوية حيث تتحول إلى نواتج تفاعل نفاذة لغشاء IMP. وبعد انتهاء فترة التحضين الأولى، اشطف الخلايا ثم قم بتحضينها في وسط استزراع لمدة ساعتين إضافيتين.

يتم فحص الخلايا باستخدام مجهر فلوري مجهز بكاميرا CCD مبردة في برنامج الاستحواذ. اضبط طول موجة الإثارة على 548 نانومتر واختر مرشح تمرير نطاق مناسب لصورة الفلورة للخلايا المحملة بـ CMRA، وبالنسبة للخلايا المحملة بـ C-M-F-D-A، اضبط طول موجة الإثارة على 492 نانومتر واختر مرشح تمرير نطاق لصورة الفلورة الخضراء، ثم قم بعد الخلايا في كلتا القارورتين واخلط الخلايا الحمراء والخضراء معاً بنسبة واحد إلى واحد، واضبط تركيز الخلايا ليصبح 5 مليون خلية لكل ملليلتر.

ضع قطرة بحجم 20 µL من معلق الخلايا في منتصف كل بئر. وفي طبق متعدد الآبار سعة 24 بئراً، قم بتحضين الخلايا في جو محكوم لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق قليلاً بسطح البئر في طبقة أحادية وتكوين اتصالات خلوية فيما بينها. ضع الطبق متعدد الآبار الذي يحتوي على الخلايا على منصة المجهر.

ضع الأقطاب الكهربائية في قاع البئر وقم بتوصيلها بمولد النبضات. ولتحقيق دمج كهربائي مثالي والحفاظ على حيوية الخلايا، يجب استخدام معاملات مناسبة للنبضات الكهربائية. تعتمد هذه المعاملات على الخط الخلوي ويجب تحديدها في تجارب أولية. قم بإزالة وسط الزرع واغسل الخلايا بـ 1 mL من محلول potassium phosphate buffer بتركيز ISO omu، ثم بـ 350 µL من محلول hypos Miller potassium phosphate buffer لتحفيز تورم الخلايا.

اترك الخلايا في محلول منظم عالي الأسموزية لمدة دقيقتين قبل تطبيق النبضات الكهربائية. يجب تطبيق النبضات الكهربائية عندما تكون الخلايا قريبة من أحجامها القصوى، أي قبل أن تبدأ في عملية تنظيم الحجم.

انخفاض في تجربتنا. تم تطبيق سلسلة من ثماني نبضات مستطيلة بمدة 100 microseconds وبتردد واحد hertz. بعد إيصال النبضات.

اترك الخلايا دون تحريك لمدة 10 دقائق بعد مرور 10 دقائق. حدد عائد الانتشار بواسطة مجهر تباين الطور والمجهر الفلوري. التقط ثلاث صور، تباين الطور، والفلورة الحمراء والخضراء في خمسة حقول رؤية مختارة عشوائياً.

في كل حالة، يتم إنشاء صور ثلاثية القنوات من كل مجموعة ثلاثية من الصور باستخدام برنامج Image J، وذلك لتحسين الجودة المرئية للصور بحيث يمكن تطبيق خطوات المعالجة المسبقة على الصور الأصلية، والتي تشمل طرح الخلفية وتعزيز التباين باستخدام مجموعات المعلمات الافتراضية. وأخيرًا، يتم تكوين الصور ثلاثية القنوات باستخدام ملحق RGB to gray في برنامج Image J. وفي مثل هذه الصور، يمكن رؤية السيتوبلازم في حالة الراحة جنبًا إلى جنب مع أغشية الخلايا.

وبذلك، يمكن بسهولة تحديد عدد الخلايا القليلة في صورة القنوات الثلاث، حيث يتم حساب الأنواع الثلاثة من الخلايا: الحمراء، والخضراء، والمزدوجة الفلورة. يتم تحديد النسبة المئوية للخلايا مزدوجة الفلورة عن طريق قسمة عدد الخلايا مزدوجة الفلورة على إجمالي عدد الخلايا في كل صورة. ثم تُعرَّف حصيلة الاندماج بأنها النسبة المئوية للخلايا مزدوجة الفلورة مضروبة في اثنين.

نظرًا لعدم اكتشاف نصف خلايا الرؤية عند فحص خلايا ذات ألوان رؤية متماثلة.