عزل الخلايا الجذعية من أنسجة العظام والعضلات الناعمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية البالغة من الأنسجة الرخوة للجهاز العضلي الهيكلي مثل العضلات الهيكلية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق أخذ خزعة من النسيج الرخو، ثم تنظيفه وتقطيعه بدقة. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي هضم النسيج إنزيميًا.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في عزل الخلايا الجذعية من خلال خطوات متكررة من الزرع المسبق. والخطوة النهائية من الإجراء هي تحديد الخلايا الجذعية المعزولة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح السلوكيات المورفولوجية والخلوية للخلايا باستخدام التألق المناعي، أو المجهر، و/أو قياس التدفق الخلوي.

مرحباً، أنا y Lee من مختبر علم الأمراض الجزيئي في قسم جراحة العظام بجامعة بيتسبرغ. سأوضح لكم اليوم كيفية عزل خلية جذعية بالغة من الأنسجة الرخوة للجهاز العضلي الهيكلي مثل العضلات الهيكلية. مرحباً، أنا الدكتور Johnny Ward.

أنا بروفيسور في كلية الطب بجامعة بيتسبرغ ضمن قسم جراحة العظام. لقد كنت أعمل بشكل وثيق مع الدكتور Young Lee على هذه الإجراءات لعزل أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية من العضلات الهيكلية والأنسجة الأخرى مثل الأوتار. نحن نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لعزل الخلايا الجذعية بغرض إجراء دراسات بحثية حول تطبيقات الطب الانتقالي.

لنبدأ الدراسة. تشمل الأنسجة التي يمكن عزل الخلايا الجذعية منها الأوتار والعضلات الهيكلية التي يتم جمعها من عظمة الساق أو العضلات النعلية للطرف الخلفي للفئران من النوع البري. بعد إزالة بقايا الجلد والعظام، توضع الأنسجة في طبق يحتوي على HBSS بارد مضاف إليه 5%FBS.

بعد ذلك، ضع الأنسجة بشكل منفصل في أطباق مغطاة بالكولاجين تحتوي على HBSS بارد. سنستخدم أنسجة العضلات الهيكلية لتوضيح الإجراءات الأساسية لتفكيك الأنسجة وهضمها. استخدم مقصات دقيقة و/أو شفرات مشرط لتقطيع الأنسجة الهيكلية إلى ملاط خشن من أجل الهضم الإنزيمي للأنسجة.

ابدأ بنقل ملاط أنسجة MIT إلى أنابيب منفصلة سعة 15 milliliter ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 3,500 RPM تقريبًا عند درجة حرارة أربع degrees Celsius لمدة خمس دقائق. قم بإزالة غسول SANE عن طريق إعادة التعليق في HBSS وكرر عملية الطرد المركزي. بعد إزالة الطافي، قم بهضم الملاط بإضافة 10 milliliters من 0.2%collagenase المسخن مسبقًا.

قم بتحضين النوع 11 لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة Celsius، مع رج الأنابيب يدويًا كل 10 دقائق. عند انتهاء تحضين الـ 60 دقيقة، قم بالطرد المركزي ثم أعد تعليق الملاط في 10 milliliters من محلول DYS space. قم بالتحضين لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة Celsius، مع الرج يدويًا كل 10 دقائق. بعد انتهاء تحضين الـ 45 دقيقة، قم بالطرد المركزي وأعد تعليق الملاط في 10 milliliters من محلول 0.2%trips في HBSS.

نقوم عادةً بالتحضين لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع قلب الأنابيب كل 10 دقائق، وبذلك تكتمل عملية التحضين. وعند تحرر عدد كافٍ من الخلايا المفردة من الأنسجة كما هو موضح هنا، يتم طرد الخلايا الناتجة مركزياً وإعادة تعليق الكتلة الخلوية في 5 mL من وسط التكاثر PM. يتم تفكيك معلق الخلايا بتمرير المستخلص عبر سلسلة من الإبر مرتين من خلال إبرة قياس 18، ثم مرة واحدة من خلال إبرة قياس 23، وأخيراً مرة واحدة من خلال إبرة قياس 27.

أخيرًا، مرر مستخلص الخلايا عبر مصفاة خلايا بقطر 70 micron لبدء تقنية prepl. قم بطرد مركزي لمستخلص الخلايا الذي تم تحضيره للتو، وأعد تعليق الراسب في وسط تكاثر. صب خمسة milliliters من خليط الخلايا في دورق T 25 مغطى بالكولاجين وعلمه كـ PP one، ثم حضنه عند 37 degrees Celsius في حاضنة رطبة تحتوي على 5%carbon dioxide لمدة ساعتين.

بعد مرور ساعتين، انقل الخلايا غير الملتصقة إلى دورق T 25 جديد مطلي بالكولاجين وقم بتسميته PP two. أضف خمسة milliliters من PM إلى دورق T 25 السابق الذي يحمل التسمية PP one.

أعد كلا الدورقين إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة. وبعد مرور 24 ساعة، انقل الخلايا غير الملتصقة من PP two إلى دورق T 25 جديد مطلي بـ collagen ENC، وقم بتمييزه على أنه PP three. أضف خمسة ملليلتر من وسط التكاثر إلى الدورق المسمى PP two.

أعد الدوارق إلى الحاضنة. كرر الإجراء كل 24 hours حتى الوصول إلى المجتمع الخلوي PP six. وبذلك يكون قد تم إنشاء مجتمع الخلايا الجذعية.

تكون خلايا PP six المعزولة قليلة العدد للغاية، وتتطلب الحفاظ عليها في وسط تكاثر غني بـ FBS. يتم تغيير هذا الوسط يومياً. وعلى الرغم من ذلك، فإن معظم الخلايا في مستنبت PP six سوف تموت خلال فترة الزراعة التي تلي ذلك لمدة أسبوع إلى أسبوعين.

عادةً ما يتم إنشاء مجتمع كبير وصحي من خلايا PP six بعد فترة توسعة إضافية تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين. حافظ أيضاً على جميع المجموعات الأخرى من الخلايا العالقة، مع السماح لها بالتكاثر وفحصها بانتظام باستخدام مجهر مقلوب. وتكون الخلايا الملتصقة المبكرة التي ترتبط بقوارير PP one وPP two في الغالب خلايا ليفية.

تلتصق الخلايا بالدوارق المطلية بالكولاجين بعد فترة زمنية أطول تتراوح من 48 إلى 96 ساعة. تكون الخلايا في الممر الثالث (PP three) والممر الرابع (PP four) في الغالب عبارة عن أرومات عضلية. وبينما تظهر الخلايا التابعة للعضلات غالباً في الممر الخامس (PP five)، فإن خلايا الممرات اللاحقة التي تستغرق 96 ساعة أو أكثر، أي الممر السادس (PP six)، تُعتبر خلايا جذعية بالغة وتظهر صغيرة ومستديرة وشفافة.

في بداية عملية عزلها، يمكن إجراء المزيد من التوصيف لها عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية للكشف عن تعبيرها عن مؤشرات الخلايا الجذعية مثل stem cell, antigen one و CDC 34. لقد عرضنا لكم للتو كيفية عزل الخلايا الجذعية من نخاع العظم للفأر. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على التعقيم طوال جميع الخطوات.

بمجرد عزل الخلية الجذعية، تأكد من استزراع هذه الخلايا بكثافة منخفضة للحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية. هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وبالتوفيق في تجربتكم، وأتمنى لكم النجاح في تطبيق ذلك في تجاربكم.

شكراً لك.