عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر

تحدث هجرة الخلايا اللمفاوية T أثناء التوجه إلى الأعضاء اللمفاوية، والخروج من الأوعية الدموية، والدخول إلى الأنسجة الطرفية. تتضمن هذه العملية تفاعلاً التصاقياً بين سطح الخلية T وخلايا أخرى. ولفحص هذه الظاهرة في المختبر، يتم عزل الخلايا اللمفاوية T البشرية وزراعتها ووضعها على أطباق زراعة أنسجة مغطاة ببروتين لاصق.

ICAM 1 وكيموكين SDF 1. يمكن بعد ذلك الحصول على صور لهجرة الخلايا التائية وتحليلها. مرحباً، أنا كريج ليفورت من مختبر مينسو كيم في مركز بيولوجيا اللقاحات والمناعة بجامعة روتشستر.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل واستنبات الخلايا اللمفاوية التائية البشرية، وتحليل هجرتها في المختبر. نستخدم هذا المقايسة في مختبرنا لدراسة دور الإنتغرينات وهجرة الخلايا التائية. الإنتغرين الرئيسي في الخلية التائية هو المستضد المرتبط بوظيفة الخلايا اللمفاوية واحد أو LFA one.

الروابط المحددة لـ LFA one هي الـ icas، مثل ICAM one. بالإضافة إلى ذلك، يلزم وجود إشارة كيموكونين من أجل هجرة الخلايا التائية لتوفير إشارة توجيهية وكذلك لتنشيط الإنتجرينات. في اختبارنا، نستخدم ICAM one البشري وCX CL 12 أو SDF one كركائز لهجرة الخلايا التائية.

فلنبدأ الآن. بعد الحصول على دم بشري من متبرع سليم، اترك الدم ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. تستغرق هذه العملية حوالي 30 دقيقة.

بمجرد تبريد الدم، اسحب بلطف ثلاث مليليتر من وسط تدرج كثافة polymorph في درجة حرارة الغرفة باستخدام الماصة وضعها في أنبوب بوليسترين مستدير القاع سعة ثماني مليليتر. ثم أضف بلطف ثلاث مليليتر من الدم الكامل فوقه. ومن المهم تجنب حدوث أي خلط بينهما.

ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي وقم بتدويرها بسرعة 500 G لمدة 45 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة وبعد عملية الطرد المركزي، تكون الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) قد انفصلت عن مكونات الدم الأخرى. تظهر طبقة PBMC كأول حزمة غائمة من الأعلى.

في ظروف معقمة، قم بإزالة الطور العلوي ذو اللون الأصفر الشفاف بعناية والتخلص منه. بعد ذلك، استخدم ماصة دقيقة P 1000 لنقل طبقة PBMC إلى أنبوب مخروطي جديد. اغسل PBMC مرتين باستخدام PBS مع طرد الخلايا مركزياً عند 500 G لمدة خمس دقائق.

في كل مرة، سيكون السائل الطافي عكراً بعض الشيء بعد كل عملية غسل. قم بإعادة تعليق الخلايا في 20 milliliters من وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10%FBS، و 1%penicillin streptomycin، و one microgram per milliliter من Phyto hemagglutinin أو PHA؛ حيث يؤدي التحضين في وجود PHA إلى تحفيز تنشيط وتوسع الخلايا اللمفاوية T.

استخدم ماصة لنقل pbmc إلى دورق زراعة T 75. بعد ذلك، يتم التحضين عند 37 °C و5% CO2 لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى 24 ساعة. تسمح هذه الخطوة بفصل الخلايا الوحيدة، التي ستلتصق بسطح الدورق، عن الخلايا اللمفاوية التي تظل معلقة.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة جميع أوساط الزرع التي تحتوي بشكل أساسي على الخلايا اللمفاوية بعناية وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 500 G لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة في RPMI 1640 وانقل الخلايا إلى قارورة T 75 جديدة تحتوي على 25 milliliters من RPMI 1640 مع FBS، والبنسلين، والستريبتومايسين، وPHA، ثم احضنها عند 37 degrees Celsius.

بعد 24 ساعة من النمو، قد يكون من الضروري إضافة من 15 إلى 20 مللي لتر من الوسط الغذائي الطازج والنقل إلى قارورة T 1 75 أكبر حجماً. استمر في التحضين لمدة ثلاثة أيام أو يومين. إذا كان التحضين الأولي لخلايا PBMC قد تم طوال الليل وبعد مرور ثلاثة أيام، استخدم ماصة لإزالة الوسط، والذي سيحتوي على الخلايا اللمفاوية العالقة، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مللي لتر، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 500 G لمدة خمس دقائق.

قامت ريس بجمع كرات الخلايا ونقل الخلايا إلى قارورة T 75 جديدة تحتوي على 25 milliliters من وسط RPMI 1640 المضاف إليه FBS وبنسلين وستربتومايسين و IL 2 أو IL 15 البشري، ثم وضعت الخلايا في الحاضنة. في حال البدء بقارورة T 75، ستحتاج المزرعة إلى التوسيع والنقل إلى قارورة T 1 75.

بعد مرور يوم إلى يومين، يتم إنماء الخلايا اللمفاوية لمدة إجمالية تتراوح من أربعة إلى سبعة أيام. وقبل يوم واحد من اختبار الهجرة، يتم طلاء طبق ذو قاع زجاجي بسماكة 0.17 millimeter بتركيز 20 micrograms per milliliter من البروتين A أو G في محلول PBS، ثم يُحضن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، يتم غسل الطبق جيداً باستخدام PBS، ثم يُضاف إلى الطبق محلول يحتوي على ICAM one FC وhuman SDF1 في PBS.

يُحضن المزيج لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الجزيئات. يتم تحديد كثافة الخلايا المستنبتة باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). بعد ذلك، تُغسل الخلايا اللمفاوية مرتين باستخدام PBS ثم يُعاد تعليقها في 1 mL من وسط L 15 الذي يحتوي على D glucose. بعد فترة التحضين، يُغسل الطبق المطلي بـ ICAM one FC و SDF one جيداً باستخدام PBS، ثم تُنقل الخلايا اللمفاوية T في 1 mL من الوسط إلى الطبق؛ حيث يجب استخدام ما يقرب من 2 إلى 5 × 10⁵ خلية لكل طبق لتحقيق كثافة خلوية مناسبة لتحليل الهجرة.

للحصول على صور لهجرة الخلايا، ضع الطبق على منصة المجهر في بيئة ذات درجة حرارة مضبوطة، مثل غرفة تسخين عند 37 درجة Celsius. افتح برنامج NIS elements في قائمة إعدادات الصور. اختر تجميع البكسلات بنمط 2×2 (two by two binning) كوضع لكل من التصوير الحي والتقاط الصور.

انتقل إلى قائمة التطبيقات واختر "تعريف التجربة وتشغيلها" (define, run, experiment). حدد الفاصل الزمني بين الصور والمدة الإجمالية. لبدء تسلسل التقاط الصور، اضغط على زر التشغيل لبدء عملية الحصول على الصور بعد ضبط إعدادات الالتقاط.

يمكن قياس معاملات الهجرة، مثل السرعة وطول المسار والإزاحة، باستخدام حزمة برمجية مثل Image J Auto Quant أو veloc. ولإنشاء مخطط شبكة العنكبوت، قم بجمع إحداثيات XY لكل خلية وعند كل نقطة زمنية، ثم قم بإسقاطها على رسم بياني بنقطة بداية مشتركة لكل خلية عند نقطة الأصل. وقد تم استزراع الخلايا اللمفاوية T الموضحة هنا على أطباق مطلية بـ ICAM و SDF one، وتم تصويرها كل 10 seconds لمدة 30 minutes.

يوضح هذا المقطع الهجرة العشوائية للخلايا التائية T lymphocytes بسرعة تقارب 15 microns في الدقيقة باستخدام إحداثيات XYT لكل خلية. تم اختيار 15 خلية عشوائياً ورسم مساراتها انطلاقاً من نقطة بداية مشتركة عند نقطة الأصل. وتوفر مقارنة مخططات شبكة العنكبوت (spiderweb plots) تصويراً مرئياً سريعاً للفروق في الهجرة بين الظروف التجريبية المختلفة.

تظهر المخططات الخاصة بهجرة الخلايا اللمفاوية T في ظل الظروف الضابطة على اليسار، بينما تظهر المخططات الخاصة بهجرة الخلايا اللمفاوية T في وجود جسم مضاد حاجب لرابط LFA one على اليمين. تثبت هذه البيانات أن الخلايا اللمفاوية T تستخدم integrin LFA one للهجرة على ركيزة ICAM one. لقد شرحنا لكم للتو كيفية إجراء مقايسة الهجرة باستخدام الخلايا اللمفاوية T البشرية المستنبتة خلال الإجراء.

من المهم تذكر إضافة عدد مناسب من الخلايا إلى الطبق المطلي بـ ICAM one لتبسيط تتبع الخلايا وتحليل الهجرة. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.