نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ما إذا كان هناك جينان متكرران وظيفيًا فيما يتعلق بتحديد سلالة خلوية معينة. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحديد النمط الظاهري لفقدان الوظيفة لكل جين على حدة باستخدام المورفينات النوعية للجينات التي يتم حقنها في أجنة أسماك الزيبرا النامية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تطوير مقايسة لقياس تحديد السلالة الخلوية أو التمايز كميًا.

على سبيل المثال، باستخدام سلالة أسماك مبلّغة، كما سنوضح هنا. وتتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في الجمع بين اثنين من الـ morph FENOs لاستهداف فقدان الوظيفة لكلا الجينين في وقت واحد. أما الخطوة الأخيرة من الإجراء فهي تقييم النمط الظاهري الناتج عن عملية التثبيط المزدوج (double knockdown).

وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تُظهر فقدان الوظيفة أو اكتسابها لخلايا من سلالة محددة من خلال فحص مراسل السلالة أو تحليل التعبير عن علامة خاصة بالسلالة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل دمج عمليات التعطيل الجيني في نموذج الفأر، في إمكانية استهداف جينين أو حتى ثلاثة جينات في نموذج السمك ببساطة عن طريق دمج مورفينوات مُتحقق من صحتها في تجربة واحدة. ويمكن حقن أكثر من 100 جنين وتقييم الأنماط الظاهرية على مدار عدة أيام.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية. ففي علم الأحياء النمائي، كما هو الحال عند تحديد المسارات النسخية التي تتحكم في مصير الخلية، غالبًا ما تُمثل المسارات التنظيمية الرئيسية بواسطة عائلات صغيرة من الجينات ذات الصلة التي تتسم بالتكرار الوظيفي. لذا، فإن دورها لا يكون واضحًا من دراسات تعطيل الجينات في الفئران بسبب التعويض من الجينات الشقيقة.

على الرغم من أن هذا النموذج يمكن أن يوفر رؤى حول التخلق الجنيني لسمك الزيبرا، إلا أنه يمكن تطبيق النتائج على أنظمة أخرى مثل الفأر، بما أن البرامج الجينية نفسها تكون محفوظة بشكل جيد عادةً عبر التطور. قم بتجهيز أطباق الحقن المجهري قبل حقن الأجنة. صب حوالي 12 milliliters من 2%agros في الماء النظامي، وهو ماء نظيف يتم أخذه مباشرة من نظام خزان الأسماك، في الغطاء المقلوب لطبق بتري بقطر 100 millimeter.

ضع شريحتين مجهريتين بزاوية 45 درجة تقريباً في جانبي الغطاء. عند تصلب الأجار، اسحب الشرائح برفق بعيداً عن الغطاء، مما يؤدي إلى تكوين أخاديد تستقر فيها الأجنة أثناء الحقن. تُحفظ مخزونات morpholino في درجة حرارة الغرفة بتركيز 1 mM في ماء مقطر منزوع الأيونات ومعقم قبل الحقن. يتم تحضين مخزونات morpholino عند درجة حرارة 65 °C لمدة خمس دقائق لضمان ذوبانها تماماً في المحلول.

اترك المحاليل المخزونة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. يجب التحقق تجريبيًا من نشاط كل مورفو (morpho) مصمم حديثًا ومدى تحمل الأجنة له. في أنابيب جهاز الطرد المركزي الدقيقة، ابدأ بإجراء تخفيف تسلسلي واحد إلى اثنين للمورفو المخزون في ماء مقطر منزوع الأيونات للحصول على تركيزات تشغيلية تبلغ 1 millimolar و 0.5 millimolar و 0.25 millimolar و 0.125 millimolar.

تحت مجهر التشريح، استخدم عملية الشفط للتعبئة الأمامية لإبرة حقن معايرة مثبتة في الميكرو-مانيبولاتور (micro manipulator) ومتموضعة بشكل صحيح. عبئ الإبرة بنحو 1 µL من محلول المورفو (morpho) ذي التركيز الأدنى. استخدم ماصة نقل لنقل الأجنة المخصبة ذات الخلية الواحدة إلى أحواض لوحة الحقن المجهري.

استخدم الماصة لإزالة الماء الزائد من الطبق بحيث تستقر الأجنة في قاع الميزاب. ضع طبق الحقن تحت المجهر، ثم أنزل الإبرة عبر الغشاء الكوريوني وصولاً إلى المح. احقن كل جنين قبل سحب الإبرة وإعادة وضع طبق الحقن للوصول إلى الجنين التالي.

عند تعلم كيفية الحقن، قد يكون من المفيد استخدام صبغة حيوية لتصور عملية الحقن داخل الخلية كما هو موضح هنا، ثم يتم نقل الأجنة مرة أخرى إلى طبق بتري بقطر 100 مليمتر يحتوي على ماء النظام لاستنباتها عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية. تخلص من أي محلول morpho متبقٍ في الإبرة، واملأها بتركيز morpho الأعلى التالي لحقن الدفعة التالية من الأجنة في مرحلة النمو المناسبة. افحص الأجنة بحثاً عن الأنماط الظاهرية عند كل تركيز morpho محقون.

تعتبر الجرعة العتبية لكل morpho هي أدنى جرعة يظهر عندها نمط ظاهري محدد وموثوق. قد تكون هناك حاجة إلى عدة جولات من المعايرة لتحديد العتبة غير الدقيقة. وذلك للبحث عن تفاعل جيني بين جينين متميزين.

قم بتحضير خليط من اثنين من المورفولينوات (morphos) المستهدفة، بحيث يكون كل منهما بتركيز العتبة الخاص به. من المهم مراعاة أن الأجنة قد لا تتحمل أكثر من 20 nanograms من إجمالي المورفولينو لكل حقنة. قم بحقن الأجنة بنفس الطريقة المتبعة سابقاً.

حافظ على ثبات أحجام الحقن بين المجموعات التجريبية ومجموعات الضبط، والتي يجب أن تشمل مجموعات تم حقنها بكل morpho بمفرده تحت المجهر التشريحي. راقب الأجنة المحقونة مباشرة بعد الحقن وعدة مرات على مدار اليوم، واستخدم ماصة نقل لإزالة أي أجنة ميتة أو تحتضر. وبما أن هذه الأجنة يمكن أن تؤثر سلباً على حيوية الأجنة المتبقية، فقم بنقل الأجنة المخدرة أو التي تم قتلها رحيماً في أي وقت باستخدام ماصة نقل.

انقل العينة إلى شريحة مقعرة للفحص. وللتصوير الفوتوغرافي، استخدم ملاقط دقيقة لإزالة الغشاء الكوريوني إذا لزم الأمر.

قم بتثبيت الجنين في قطرة من Methyl cellulose بنسبة 3%، وافحص الأجنة للبحث عن نمط ظاهري متميز، يكون فريداً لمزيج المورفولينوهات مقارنة بنفاذية أعلى للنمط الظاهري للمورفولينوهات المفردة. تظهر هنا عدة أجنة من النوع البري عند حقنها بالمورفولينوهات عند الحد الأدنى. بالنسبة لـ gata five، فإن النمط الظاهري النموذجي هو cardio bifida أو وجود قلبين، وذلك بسبب فشل الخلايا السليفة في الالتحام عند الخط المتوسط.

لاحظ الخلايا العضلية القلبية الموجبة لـ GFP والمشار إليها بالأسهم. يتضمن النمط الظاهري لستة من حالات المورفين قلوباً مشوهة تفشل في الالتفاف بشكل صحيح. كما تطور هذه الأجنة خلايا عضلية قلبية موجبة لـ GFP.

ومع ذلك، فإن الأجنة التي حُقنت بمزيج من مورفانوهات gata five و gata six الموضحة هنا، تظهر فقداناً تاماً لتطور الخلايا العضلية القلبية، مما يشير إلى ضرورة تعبير إما gata five أو gata six لكي تتطور الخلايا العضلية القلبية. هذان الجينان متكرران وظيفياً فيما يتعلق بتحديد هوية الخلايا العضلية القلبية.

عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم أولاً التحقق بشكل كامل من المورفوس (morphos) والتأكد قدر الإمكان من أنها تمثل تثبيطاً حقيقياً للجين المستهدف الواحد بعد اتباع هذا الإجراء. كما يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل دمج الأليلات الفارغة للمؤشرات الشرطية في الفئران لإظهار أن الجينات نفسها تؤدي الوظيفة ذاتها، وبالمثل في الثدييات.

بعد مشاهدة الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد ما إذا كان جينان متكررين وظيفيًا أثناء التكون الجنيني.