مقارن في الجسم الحي دراسة gp96 Adjuvanticity في الضفدع القيطم المورق

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة القدرة الحفظية التطورية لبروتين الصدمة الحرارية GP96 على تعزيز استجابات الخلايا التائية CD8 النوعية للمستضد في ضفدع Xenopus laevis. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصاد الكريات البيضاء البريتونية من خلال الغسيل البريتوني. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحميل الكريات البيضاء البريتونية ببروتين GP96 المشتق من الورم، والذي يعمل كمرافق للمستضدات الورمية والثانوية، وذلك بعد عملية الحضن والغسيل.

يتم نقل كريات الدم البيضاء البريتونية تكيفياً عن طريق الحقن داخل الصفاق في ضفادع سليمة، وذلك لتحفيز هذه الضفادع ضد الأورام أو مستضدات التوافق النسيجي الثانوية. وتتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إجراء طعم جلدي أو تعريض الضفادع المحفزة لتحدي ورمي، ومراقبة بدء رفض الطعم الجلدي أو ظهور الورم. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي الحصول على دم محيطي لتوصيف الخلايا T المشاركة في استجابات رفض الجلد والاستجابات المضادة للأورام.

في النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تسارعاً ملحوظاً في رفض الطعم الجلدي، بالإضافة إلى تأخر في ظهور الأورام في الضفادع التي تم تحفيزها بـ GP 96 من خلال اختبارات زراعة الجلد وتحدي الأورام على التوالي. مرحباً، أنا كريستينا كوسكا من مختبر الدكتور جاك روبرت في قسم الميكروبيولوجيا والمناعة في المركز الطبي بجامعة روتشستر. وأنا تانيا كروز أيضاً من مختبر الدكتور ريفرز.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتهيئة ضفادع المستنسخات عن طريق النقل التكيفي لكريات الدم البيضاء البريتونية، يليه اختبارات تطعيم الجلد وزراعة الأورام. بالإضافة إلى ذلك، سنوضح لكم كيفية سحب الدم المحيطي من هذه الحيوانات. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة قدرة بروتين الصدمة الحرارية GP 96 على تحفيز خلايا CDAT النوعية للمستضد في Xenopus laevis، وكذلك لدراسة أنواع الخلايا المشاركة في هذه العملية.

حسناً، لنبدأ الآن. الضفادع المستخدمة في تجاربنا هي مستنسخات متماثلة جينياً (ISO genetic clones) من مستعمرة التربية الخاصة بنا في جامعة روتشستر (University of Rochester). ولتحفيز كريات الدم البيضاء البريتونية أو pls من أجل حصادها، استخدم إبرة قياس 25 ومقاس 5/8 لحقن الضفدع المخدر داخل التجويف البريتوني بمستحضر من بكتيريا e coli المقتولة حرارياً. وبعد ثلاثة أيام من الحقن، يتم حصاد pls عن طريق الغسل البريتوني.

لبدء هذا الإجراء، قم بتطهير بطن الضفدع المخدر بكمية صغيرة من 70%ethanol. بعد ذلك، استخدم إبرة مقاس 18 بطول 1.5 لحقن خمسة ملليلتر من محلول ملحي منظم بالفوسفات معقم للبرمائيات، أو PBS تم تسخينه مسبقاً إلى درجة حرارة الغرفة، داخل التجويف الصفاقي. اسحب الإبرة وقم بتدليك الضفدع بلطف لمدة دقيقة واحدة لضمان اختلاط المحلول المنظم المحقون بالسوائل الموجودة في تجويف الجسم.

بعد ذلك، أدخل إبرة جديدة مقاس 18 وبطول 1.5 بدون محقنة في بطن الضفدع. وأثناء تجنب الأوعية الدموية، اجمع السائل الصفاقي الذي سيقطر من الجزء الخلفي للإبرة في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 milliliter. تأكد من استعادة أكبر قدر ممكن من الحجم المحقون أوليًا بعد جمع الـ pls.

ضع الضفدع في وعاء به ماء ضحل حتى يستيقظ، وعند هذه النقطة يمكن إعادته إلى قفصه. بمجرد حصاد pls، قم بالطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius، ثم أزل sup وnatant وresus. قم بتعليق pls في A PBS بارد.

انقل الخلايا الملعقة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 milliliter. لنبض الخلايا باستخدام GP 96، أضف الكمية المناسبة من GP 96 إلى الخلايا واخلطها عن طريق الماصة، ثم حضنها على الثلج لمدة ساعة واحدة؛ وبعد مرور ساعة واحدة.

قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 14,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. ولإزالة أي GP 96 غير مرتبط، تخلص من الراشح. أضف A PBS بارداً وأعد التعليق.

قم بتعليق الـ PLS باستخدام جهاز الطرد المركزي مرة أخرى. اغسل الـ S باستخدام A-P-B-S-A البارد ثلاث مرات إجمالاً للتأكد من عدم وجود أي G 96 متبقٍ بعد الغسلة النهائية. أعد تعليق الـ pls المنبضة بتركيز 5 × 10⁵ pls لكل 300 µL من PBS لنقل الـ pls تكيفياً إلى مستقبلات LG six الساذجة.

يتم حقن 300 µL من pls النبضي داخل الصفاق لكل حيوان. يجب تحفيز الضفادع قبل ثلاثة أيام على الأقل من تجارب طعم الجلد أو تحدي الورم، والتي سيتم عرضها لاحقاً. يتم الحصول على الجلد المخصص للتطعيم من ضفدع مانح LG 15 تحت التخدير.

استخدم المقص لقص وإزالة قطعة صغيرة من الجلد البطني، وهو جلد البطن الذي يظهر بلون فضي. نظراً لوجود ARI، تظهر أربع خلايا صبغية أثناء التعامل مع الطعم. ومن الضروري تقليل التعامل مع النسيج قدر الإمكان لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الطعم.

أمسك الجلد برفق شديد باستخدام الملقط وضعه في طبق بتري يحتوي على PBS بارد. أبقِ طبق بتري على الجليد. ضع الجلد على شريحة زجاجية نظيفة واستخدم شفرة حلاقة لقص طعوم فردية إلى قطع بحجم 5 millimeter في 5 millimeter.

احتفظ بالقطع في محلول PBS على الثلج من أجل تطعيم الجلد على الضفدع المستقبل LG six. أولاً، قم بعمل شق صغير في الجلد الظهري للمستقبل المخدر. ثم أدخل الطعم الذي تبلغ أبعاده 5 millimeter في 5 millimeter تحت الجلد بحيث يكون الجانب الفضي للأعلى.

تأكد من تدوين علامات المقص والملاقط الموجودة على الطعوم لأنها لا تُحتسب ضمن رفض الطعم. وبمجرد بدء التقييم بعد 24 ساعة، يجب إزالة جزء من جلد المضيف الذي يغطي الطعم. استخدم المقص لقص فتحة نافذة حول الطعم بحيث يمكن رؤية الطعم بوضوح.

احذر من لمس جلد المانح أو التسبب في حدوث نزيف. ابدأ بتدوين تفاصيل الرقعة على الفور من خلال رسم مخطط توضيحي. رقعة جلدية.

يتم تحديد الرفض من خلال النسبة المئوية لتدمير الـ aridol على الجلد المطعّم. يجب فحص الطعم كل يومين إلى ثلاثة أيام باستخدام المجهر الاستريو. يتم تحضير الخلايا الورمية للزرع عن طريق إعادة تعليقها في وسط زراعة الورم بكثافة 5 × 10⁵ خلية لكل 300 µL.

قم بنقل الخلايا عن طريق الحقن تحت الجلد في أحد جانبي المنطقة الظهرية للحيوان. يتم حقن 5 × 10⁵ خلية في حجم 300 µL لكل ضفدع. سيبدأ نمو الورم في غضون أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع بعد تحفيز الورم.

لاحظ المظهر الأولي للورم. استخدم الفرجار لقياس أبعاد الورم وسجّل حجمه كل يومين إلى ثلاثة أيام قبل جمع الكريات البيضاء من دم الضفدع. جهّز الإبر الزجاجية عن طريق سحب أنابيب pasta peppes فوق لهب.

بعد شحذ الطرف الدقيق للماصة تحت المجهر الاستريو، قم بتوصيل الماصة بأنبوب شفط بلاستيكي. لبدء عملية جمع الدم، اقطع الجلد فوق القدم الخلفية للضفدع المخدر لكشف الوريد الرسغي الظهري. املأ الإبرة الزجاجية بمقدار 1 إلى 2 mL من محلول A PBS مضاف إليه الهيبارين والمبرد بالثلج.

بعد ذلك، أدخل الإبرة الزجاجية في الوريد وابدأ بجمع الدم عن طريق السحب البطيء باستخدام الفم. يمكن الحصول على 1 إلى 2 mL من الدم من ضفدع واحد متوسط الحجم. لا يحتاج الشق الصغير الموجود في ساق الضفدع إلى خياطة.

سوف يلتئم الجرح في غضون أسبوع. تظهر هنا نتائج تحليل مجهري ستيريو لرفض الطعم الجلدي بعد 12 يوماً من عملية الزرع. لم يظهر أي رفض في ضفدع LG six مستنسخ تلقى طعماً جلدياً من متبرع LG six متطابق من حيث معقد التوافق النسيجي الكبير MHC.

تشير النجمة إلى ملقط العلامة وليس إلى الرفض. وفي المقابل، يُظهر ضفدع مستنسخ من سلالة LG six تلقى طعماً جلدياً من متبرع غير قريب متباين في معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) نسبة رفض بلغت 80%. وفي كلتا الصورتين، تشير الأسهم إلى الخلايا الصبغية القزحية الفضية التي تميز الأنسجة المطعمة السليمة وغير المرفوضة.

في التجربة التالية، تم تحفيز خلايا LG 15 إما باستخدام PBS كمجموعة ضابطة سلبية، أو بروتين GP 96 المؤتلف المنقى من مزرعة e coli، أو بروتين GP 96 المنقى من خلايا أنسجة ورم 15 zero؛ ثم تم نقل هذه الخلايا تكيُّفياً إلى مستقبلين بالغين من LG 15، وبعد ثلاثة أيام، زُرعت خلايا ورم 15 zero حية عن طريق الحقن تحت الجلد. تمت مراقبة الأورام التي ظهرت لأول مرة بعد أيام من التحدي، وقيس حجم الورم بشكل دوري. في هذه الرسوم البيانية، يمثل كل منحنى حركية نمو الورم في ضفدع واحد. وتظهر النتائج أن الحيوانات التي تم تحفيزها إما بـ 0.5 أو 1 µg من GP 96 شهدت تأخراً ملحوظاً في ظهور الورم مقارنة بالمجموعات الضابطة. وبناءً على ذلك، فإن GP 96 يسهل التقديم المتقاطع لمستضدات الورم في xenopus.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية استكشاف قدرة GP 96 على تمثيل كل من المستضدات الثانوية والمستضدات الورمية في ضفدع xap lavis من خلال مقايسات تطعيم الجلد وزراعة الأورام. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب جمع غسيل الصفاق إذا تعرض وعاء دموي للتلف، نظرًا لأن غالبية الخلايا حينئذٍ ستكون كريات دم حمراء وليس خلايا بلعمية. كما أنه من المهم تجنب الضغط على النسيج باستخدام الملقط عند التعامل مع طعم الجلد لتفادي حدوث أي تلف.

هذا كل شيء. شكراً لكم على القيام بعملية الغسل، وبالتوفيق في تجاربكم.