نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استزراع خلايا الظهارة الصبغية للشبكية الجنينية البشرية، أو RPE، لاستخدامها كنموذج دراسة. وفي أبحاث أمراض العين البشرية، يتم استلام الأنسجة من المتبرعين على شكل مقل عينية سليمة. وتتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في تقليم العضلات والأنسجة الضامة الزائدة، ثم فتح العين عن طريق إزالة القرنية والعدسة.

تُعالج العين باستخدام مادة dispa وتُسطح، ثم تُقشر طبقة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية (RPE) أحادية الطبقة عن المشيمية. يتم تشريح الخلايا، ثم تُزرع خلايا RPE في دوارق وتُترك لتنمو لعدة أسابيع حتى تصل إلى مرحلة الالتحام وتكوّن طبقات أحادية متصلة وتطور الصبغة. تُستخدم المزارع الخلوية في تجارب وظيفية في المختبر (in vitro).

يتم تكرار التجارب الناجحة في المختبر في نماذج حيوانية للتجارب قبل السريرية، حيث يمكن تقييم استجابات RPE بشكل أفضل في بيئات إشارات أكثر تعقيداً. وسيؤدي النموذج الموضح هنا إلى فهم أفضل لفيزيولوجيا RPE وتدخلات علاجية جديدة لعلاج أمراض العين. مرحباً، اسمي شيلدون ميلر.

يقع مختبري في المعهد الوطني للعيون، وهو جزء من المعاهد الوطنية للصحة في حرم بيثيسدا بميريلاند. مرحباً، أنا أركي من مختبر ميلر. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحضير مزارع أولية لخلايا الظهارة الصبغية للشبكية الجنينية البشرية.

سيتم تحضير هذه الخلايا كطبقات أحادية متلاصقة يمكن تثبيتها في غرف "sing" المعدلة. كما سنستخدم خلايا RPE البشرية المعزولة هذه في دراسات الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لإنشاء مستنبتات أولية من الخلايا الظهارية لدراسة وظيفة وتنظيم العمليات الفسيولوجية والباثولوجية وتطوير نماذج حيوانية سريرية للأمراض.

نركز هنا على الظهارة الصبغية للشبكية أو RPE، والتي تقع في الجزء الخلفي من العين، حيث تفصل الشبكية العصبية عن التروية الدموية للمشيمية. يوضح هذا المخطط التخطيطي للعين موقع طبقة RPE في الجزء الخلفي من العين، بجوار المستقبلات الضوئية مباشرةً. ويظهر الشكل المدرج خلايا الشبكية مع وجود المستقبلات الضوئية على اليمين والخلايا العقدية على اليسار.

تتميز هذه الظهارة بنشاط أيضي كبير للغاية. فهي تقوم ببلعمة المستقبلات الضوئية باستمرار على أساس يومي، كما تقوم بتخزين وإعادة تدوير ونقل صبغة الرؤية وفيتامين A إلى المستقبلات الضوئية. وفي الدورة البصرية، تعمل هذه الظهارة بشكل استتبابي للحفاظ على التركيب الكيميائي وحجم المساحات خارج الخلوية المحيطة.

تعد القطبية خاصية حاسمة للخلايا الظهارية. وتعتبر عملية التوصيل غير المتماثل والمستمر للبروتينات إلى الغشائين القمي والجانبي القاعدي عملية منظمة تتيح للظهارة القيام بالنقل الموجه للمستقلبات والأيونات والسوائل من حيز خارج خلوي إلى آخر. ويساعد هذا النشاط الظهارة في الحفاظ على صحة وسلامة الشبكية العصبية.

يسمح التحضير المختبري الذي نصفه هنا بتحليل بروتينات النقل، والمستقبلات، ومسارات التأشير التي تحدد قطبية الظهارة ووظيفتها قبل البدء في عملية التشريح. قم بتجهيز طبق يحتوي على 12 بئراً داخل غطاء تدفق صفائحي باستخدام محلول بـ درجة حرارة الغرفة. تتطلب كل عين بئراً واحداً يحتوي على 10 x من محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات، وبئرين من 1 XPBS، وبئراً واحداً يحتوي على وحدتين لكل ملليلتر من disc space مخففاً في وسط 5%RPE مع المصل. املأ طبق تشريح مبطن بالسيليكون بـ 1 X-H-B-S-S، ثم قم بتصريف السائل وانقل كل عين إلى بئر واحد من محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات.

يُحضن لمدة تتراوح بين ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب تجنب تطبيق أي ضغط زائد على مقلة العين. تُشطف العين في بئرين متتاليين من XPBS لإزالة المضاد الحيوي الزائد.

ثم استخدم الملقط لنقله إلى طبق التشريح المملوء بـ one X-H-B-S-S تحت مجهر تشريح ستيريوسكوبي. استخدم مقص القزحية لإزالة العضلات والأنسجة الضامة الزائدة حول العين. قم بمحاذاة العين بحيث تكون القرنية متجهة للأعلى.

استخدم إبرتين معقمتين بقياس 27 gauge لتثبيت العين من خلال النسيج الضام على الوسادة السيليكونية دون إتلاف الصلبتا. وفي هذا الوضع، استخدم سكين المنفذ الجانبي لإجراء شق عبر الصلبتا. يجب أن يكون الشق على مسافة تعادل ثلث المسافة من خط استواء العين إلى السطح الأمامي.

استخدم مقص القزحية لمواصلة القطع بشكل دائري حول العين لتجنب إتلاف الظهارة الصبغية للشبكية، والتي يُرمز لها اختصاراً بـ RPE، والناتج عن جذب الشبكية الزجاجية. استخدم المقص نفسه للقطع عبر الجسم الزجاجي لفصل سديلة العين الأمامية عن كأس العين.

ارفع الجزء الأمامي من IOA وتخلص منه. استخدم الملقط لنقل العين المفتوحة إلى بئر dys. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في العين. كوب.

قم بالتحضين لمدة 40 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون. انقل العين من مساحة التثبيت مرة أخرى إلى طبق التشريح، والذي تم ملؤه بمحلول 1X HBSS طازج في درجة حرارة الغرفة. ضع العين بحيث يكون الكوب متجهًا للأعلى وثبتها باستخدام إبرتين بقياس 27 gauge.

باستخدام المجهر التشريحي، استعمل ملقطاً دقيقاً لرفع الشبكية المنفصلة جزئياً برفق باستخدام مقص الشبكية. اقطع الشبكية بعيداً عن العصب البصري. ثم تخلص من الشبكية باستخدام مقص القزحية.

قم بإجراء شق من محيط العين وصولاً إلى العصب البصري. ثبّت العين باستخدام 5 إبر من قياس 27. ولتوسيع طبقة الظهارة الصبغية الشبكية (RPE)، استخدم مقص الشبكية لإجراء قطع دائري حول العصب البصري.

فصل طبقة الظهارة الصباغية للشبكية (RPE) مع التحويل إلى تكبير 250x أو أكثر. حدد حافة صفيحة الـ RPE على طول القطع الذي تم إجراؤه بواسطة مقص القزحية وبالقرب من العصب البصري. استخدم زوجين من الملاقط لفصل الـ RPE والغشاء بروش عن طبقة النسيج المشيمي.

جرب عدة مناطق على طول الحافة المقطوعة لتحديد النقطة التي يكون فيها الاتصال بين RPE والمشيمية في أضعف حالاته. قم بتقشير الغشاء برفق لإزالته بالكامل. ضع شرائح RPE في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter مملوء بمحلول trips في EDTA بدرجة حرارة الغرفة.

عند جمع كافة الرقائق، قم بتغطية الأنبوب، ثم حضن الأنابيب في حمام مائي لمدة 10 دقائق عند 37 degrees Celsius. رج الأنبوب بقوة لفصل الـ RPE إلى تكتلات صغيرة. ويعني عدم وجود تكتلات خلوية داكنة أن عملية الفصل قد اكتملت.

أعد الأنبوب إلى الحمام المائي لمدة خمس دقائق أخرى. استخدم ماصة باستور وماصة مخبرية وشفطاً خفيفاً لإزالة أي بقايا أنسجة غير مهضومة. قم بترسيب الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 280 5G لمدة أربع دقائق.

قم بإزالة السائل الطافي. أكمل الحجم النهائي إلى تسعة milliliters باستخدام وسط 15%RPE مع الماصة لإعادة التعليق. انقل ثلاثة milliliters من معلق الخلايا باستخدام الماصة إلى دورق بمساحة 25 centimeter squared.

أضف 2 mL من وسط زراعة RPE بتركيز 15% طازجاً وبدرجة حرارة الغرفة. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و 5% carbon dioxide. ومع نضوج المزارع، سيزداد تصبغها بعد ثلاث إلى أربع أسابيع.

ستكون المزارع الناجحة متلاحمة وذات تصبغ كثيف وموحد. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير المزارع الأولية للخلايا الشبكية البشرية الجنينية. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.