خالية من التحديد التمهيدي Aptamer باستخدام مكتبة DNA عشوائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الـ abers من مكتبة عشوائية، والتي ترتبط تحديداً ببروتين مستهدف، وهو في هذه الحالة بروتين S 100 B. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق هضم المكتبة باستخدام إنزيم القطع (restriction endonuclease) لتحرير التسلسلات العشوائية من تسلسلات البادئات الثابتة المتاخمة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ربط تسلسلات المكتبة العشوائية ببروتين S 100 B المنقى ثم استعادتها.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إعادة دمج التسلسلات المرتبطة مع تسلسلات البادئ المثبتة عن طريق التهجين والربط. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي نسخ النواتج المربوطة للسماح بإعادة تضخيم مجمع الـ abers المرشحة المرتبطة باستخدام تقنية R-T-P-C-R، تليها جولات إضافية من إجراء الاختيار هذا. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر ارتباطاً نوعياً لـ abers المختارة ببروتين S 100 B.

على سبيل المثال، يتم هنا إجراء مقايسات الربط الشطيرية باستخدام المصفوفات الدقيقة، كما يتم إجراء مقايسات للأجسام المضادة الثانوية المسمى بفلوروسنتياً باستخدام أسلاك نانوية وظيفية وأجسام مضادة ثانوية مقترنة بجسيمات ذهب نانوية بحجم 15 nanometer. سنعرض اليوم إجراءً لاختيار الأجسام المضادة المثلى التي ترتبط ببروتين S hundred B من مكتبة عشوائية من تسلسلات D. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لأغراض متنوعة، بما في ذلك تطوير منصة استشعار للكشف المبكر عن السرطان.

لنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بإنشاء مكتبة DNA خالية من البادئات (PF) كما تم وصفه سابقاً. سيؤدي شطر مكتبة DNA مزدوجة السلاسل متبوعاً بالتنقية باستخدام هلام بولي أكريلاميد مسخ بنسبة 10% إلى الحصول على قطعة مكونة من 32 نيوكليوتيد ذات مجموعة فوسفات في الطرف '5 في 30 cc، وقطعة مكونة من 30 نيوكليوتيد ذات مجموعة فوسفات في الطرف '5 في 30، ويُشار إليهما بقطعتي 32 plus و 30 plus على التوالي.

تحتوي قطعة 32 بلس على نطاق عشوائي مكون من 30 نيوكليوتيد مع تسلسل جانبي أدنى من CC عند الطرف الثلاثي، بينما تتكون قطعة 30 بلس من تسلسل النطاق العشوائي المكون من 30 نيوكليوتيد فقط. لتحضير قطع DNA الخاصة بمكتبة PF من أجل اصطفاء aptr، قم بإعادة تعليق كل من قطعتي 32 بلس و30 بلس في 40 µL من 20 mM tris، HCL pH 7.4. بعد ذلك، سخن العينات لمدة ثلاث دقائق عند 85 °C بعد فترة التحضين.

قم بتبريد العينات لمدة ثلاث دقائق في حمام مائي حاضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم أضف 760 µL من منظم الاختيار (selection buffer) واحضنها لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد مرور ثلاث دقائق، احتفظ بالعينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة، مرر المحلول عبر عمود يحتوي على حبيبات nickel NTA agarose التي غُسلت مسبقاً بمنظم الاختيار.

لإزالة الحمض النووي DNA غير المحدد، اجمع قطع DNA الخاصة بمكتبة PF التي لم ترتبط بالعمود واحتفظ بها لاستخدامها لاحقاً. ولتحضير الخرز المرتبط بـ S 100 B، قم أولاً بطرد مركزي لـ 400 microliters من خرز النيكل NDA لمدة ثلاث ثوانٍ في جهاز طرد مركزي دقيق وتخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، اغسل الخرز باستخدام 400 microliters من محلول الربط عن طريق السحب والضخ بلطف باستخدام الماصة خمس مرات.

بعد ذلك، قم بطرد الخرزات مركزياً لأسفل وتخلص من السائل الطافي. كرر هذه العملية. اغسل مرتين.

بعد ذلك، قم بصب البروتين المنقى سابقاً والموسوم بالهستيدين فوق الخرزات. في هذه التجربة، تم استخدام البروتين B الرابط للكالسيوم S 100 البشري. قم بسحب المحلول وإطلاقه برفق باستخدام الماصة خمس مرات كل ثلاث دقائق لمدة إجمالية تصل إلى 15 دقيقة.

بعد مرور 15 دقيقة، قم بطرد الخرزات مركزياً وتخلص من المادة الطافية. وأخيراً، اغسل S 100 B المرتبط بالخرزات باستخدام 400 microliters من منظم الاختيار عن طريق الماصة برفق صعوداً وهبوطاً ثلاث مرات. ثم قم بطرد الخرزات مركزياً مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية.

كرر هذه الخطوة مرتين لإجراء ثلاث غسلات نهائية إجمالاً لانتقاء الأجسام المضادة المرتبطة بـ S 100 B. استرجع شظايا 32 plus و 30 plus التي تم تنحيتها مسبقاً. أضف الشظايا إلى S 100 B المرتبط بالخرز. ثم حضن العينة لمدة 15 minutes.

بعد 15 دقيقة، ومع الخلط كل ثلاث دقائق عن طريق السحب والطرد اللطيف بالماصة، قم بتدوير الخرزات لفترة وجيزة لترسيبها، ثم تخلص من الطافي، وبعد ذلك اغسل معقد S 100 BDNA باستخدام 800 microliters من محلول التحديد المنقي عن طريق السحب والطرد اللطيف بالماصة. ثم قم بتدوير الخرزات لترسيبها وتخلص من الطافي. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين.

لاستعادة S 100، أضف 200 µL من tris-HCL بتركيز 20 mM ودرجة حموضة pH 7.4 إلى الخرز. ثم قم بتسخين المزيج لمدة ثلاث دقائق عند 85 °C. بعد الحضانة.

قم برجّ الخرز بجهاز الـ Vortex لمدة دقيقة واحدة ثم قم بطردها مركزياً لترسيبها. بعد ذلك، انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. كرر هذه الخطوة مرة واحدة واجمع السوائل الطافية معاً.

أخيرًا، قم بتنقية قطع DNA المختارة. استخلص نواتج PCR مرتين باستخدام حجم مكافئ من الفينيل كلوروفورم، وكحول الإيزوبروبيل. ثم قم بترسيبها باستخدام 250 millimolar من كلوريد الصوديوم و2.5 مرة من حجم 100% Ethanol عند درجة حرارة minus 70 degrees Celsius لمدة 15 دقيقة.

قم بالطرد المركزي بسرعة 21,000 GS عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 15 دقيقة. ثم تخلص من السائل الطافي. اشطف الراسب بـ 75% ethanol بكفاءة.

يتم الطرد المركزي بسرعة 21,000 GS عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق والتخلص من الطافي. يتم تجفيف الراسب في جهاز طرد مركزي مفرغ (speed vacuum) لمدة ثلاث دقائق بعد 10 جولات من الاختيار. ثم تُستنسخ قطع DNA المضخمة بواسطة PCR الناتجة في ناقل PCR 2.1 topo الذي تم الحصول عليه من vitrogen core.

بعد ذلك، قم بإجراء التسلسل لـ 40 إلى 50 مستعمرة منفردة لكل من قطع N 30 cc و N 30 المختارة باستخدام بادئ M 13 الأمامي. قم بمحاذاة التسلسلات المختارة باستخدام برنامج infomax vector NTI، ثم حدد تسلسلات الإجماع بناءً على عمليات المحاذاة.

بمجرد تحديد تتابعات الإجماع، قم بشراء خيوط الإجماع كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. قم بتعليق أول aptamer تم تخليقه مع مجموعة Amin C في الطرف 5 في محلول التخزين (printing buffer) للوصول إلى تركيز نهائي قدره 15 micromolar. بعد ذلك، قم بترسيب محلول الـ aptamer على شرائح مفعلة بـ code link باستخدام مصفوفة microgrid array من apogen discoveries.

اتبع البروتوكولات الموصى بها في رابط الكود. اطبع كل شريحة بحيث تحتوي على 12 مصفوفة. استخدم تنسيق اثنين في ثمانية.

كاسيت تهجين المصفوفات الدقيقة لعملية التهجين. يتم تخفيف بروتين S 100 B إلى التركيز المناسب في 70 microliters من PBS. ثم يُوضع المحلول في آبار كاسيت المصفوفة الدقيقة.

قم بإغلاق كاسيت المصفوفة الدقيقة باستخدام رقائق سد لاصقة خالية من النيوكلياز لمنع التبخر. اترك البروتين ليرتبط بالأجسام المضادة المطبوعة على شرائح الربط الكودية. قم بالتحضين بشكل فردي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل آبار الكاسيت ثلاث مرات باستخدام PBS يحتوي على كلوريد المغنيسيوم بتركيز 5 millimolar أو PBSM. بعد ذلك، خفف الأجسام المضادة الثانوية الموسومة فلورياً إلى 0.125 micromolar في 70 microliters من PBSM. سخن الخليط لمدة ثلاث دقائق عند 85 degrees Celsius.

بعد ذلك، اترك جزيئات ABERS الموصومة لتبرد على الثلج. ولمدة ثلاث دقائق، ضع جزيئات abers في آبار كاسيت المصفوفة الدقيقة (microarray cassette). مرة أخرى، أغلق الكاسيت باستخدام الرقاقة اللاصقة واتركها لتحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

مرة أخرى، وبشكل فردي. اغسل الآبار ثلاث مرات بـ PBSM بعد عملية الغسل. قم بتفكيك الكاسيت وشطف الشريحة بأكملها بـ PBSM.

بعد ذلك، يتم تجفيف الشريحة تماماً عن طريق الطرد المركزي. وأخيراً، يتم مسح الشريحة باستخدام مصفوفة مسح من Packard Biosciences. تم تحديد ارتباط 4,000 XL للأبتامرات الملحقة بـ gamma P 32 A TP عند الطرف الخماسي (5 prime) ببروتين S 100 B، وتم تمثيلها بيانياً مقابل التركيز لتحديد قيمة KD.

تكون قيم Kd التمثيلية بعد حوالي سبع جولات من الاختيار عادةً في نطاق 10⁻⁷ مولار. تم ربط أبتامرات الاستهداف الأولي 5' بصفوف ميكروية من نوع code link، حيث تم ربط بروتين S 100 B المنقى بالأبتامر الأول، ثم تم ربط الأبتامر الثاني المسمى بـ LOR 5 46 بمعقدات S 100 B والأبتامر الأول.

تم قياس الفلورة كمياً باستخدام ماسح مصفوفة المسح. يوضح الصف الأوسط ارتباط الساندوتش الذي يتميز بارتباط تراكمي في مقاييس KD في الصفوف الأعلى والأسفل. لا يوجد ارتباط ساندوتش بالنسبة لـ abers، وقد تم ربط abers الأولى المشتقة من الثيول في الطرف الخماسي بأسلاك الذهب النانوية باستخدام كيمياء الثيول القياسية.

تم ربط الأجسام المضادة الثانية بـ 50 NMO أو جزيئات الذهب النانوية (gold nps) بنفس الطريقة. بعد ذلك، تم ربط بروتين S 100 B المنقى أولاً بالأسلاك النانوية المشتقة، ثم رُبطت أبتامرات 50 نانو مولار من جزيئات الذهب النانوية لاحقاً بمعقدات S 100 B المرتبطة بالأسلاك النانوية للأبتامر الأول. وتم تصور معقدات الساندوتش المرتبطة باستخدام F FE SEM هنا.

يمكن رؤية ضابط سلبي لمقايسة ربط أُجريت باستخدام بروتين HTRA one بدلاً من بروتين S 100 B. حسنًا، أحد أهم الجوانب في هذا الإجراء هو أننا نستخدم نهجًا خالًٍا من البادئات حيث لا توجد تسلسلات ثابتة يمكن أن تتسبب في نتائج إيجابية كاذبة أو سلبية كاذبة بناءً على التسلسلات نفسها التي قد تطغى على المنطقة العشوائية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من تدمير قالب DNA قبل كل تفاعل نسخ عكسي، والحرص على عزل ناتج R-T-P-C-R المحدد بعد كل عملية إعادة تضخيم.

هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.