التخيل والكمي لالتفاعلات داخل الخلايا النيسرية السحائية والإنسان α - actinin بواسطة التصوير متحد البؤر

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم مستوى التوضع المشترك للبكتيريا الممتصة داخلياً، *R. meningitidis*، مع بروتين الهيكل الخلوي Alpha Actinin. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إصابة خلايا وعائية دقيقة دماغية بشرية مستزرعة بمزرعة بكتيرية نمت طوال الليل لمدة تتراوح من ثلاث إلى ثماني ساعات للسماح للبكتيريا بدخول الخلايا المستهدفة. وكخطوة ثانية، يتم غسل الخلايا التي تحتوي على بكتيريا داخل خلوية، ثم تثبيتها، ثم نفاذها، مما يهيئ المزرعة المصابة للصباغة المناعية للبكتيريا الممتصة داخلياً وبروتين alpha actinin داخل الخلوي.

بعد التصوير المجهري البؤري وتطبيق برنامج تحليل التوضع المشترك، يمكن ملاحظة صور التوضع المشترك داخل الخلايا والحصول على نتائج كمية توضح أن Meninga Croci التي تعبر عن OPC والبروتين الغشائي يمكن أن تتفاعل بشكل محدد مع alpha actinin داخل الخلايا بناءً على التصوير المجهري البؤري ومن خلال تحليل التوضع المشترك الكمي. مرحباً، أنا Isel Maria من مختبر البروفيسور Mata TI في قسم الطب الخلوي والجزيئي بجامعة Bri. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتقدير مستوى نسبة التوضع المشترك للبكتيريا داخل الخلايا مع بروتينات الهيكل الخلوي.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعل بين غشاء المنيجيتس (mycelium meningitis) الذي يعبر عن بروتين الغشاء التلقائي OPC وبروتين الهيكل الخلوي ألفا أكتين (alpha actin). لذا، لنبدأ الآن. يجب تنفيذ هذا العمل في مختبر سلامة مناسب.

قبل يومين من إجراء عملية الصبغ المناعي، قم بتلقيح السلالة البكتيرية المستهدفة في وسط منقوع الدماغ والقلب (brain heart infusion). تُحضن أطباق الآجار المضاف إليها 10% من دم الحصان المسخن طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون في اليوم الذي يسبق الصبغ المناعي. استخدم حلقة تلقيح سعة 10 µL لتحضير معلق من المزرعة البكتيرية التي نمت طوال الليل.

في 2 mL من PBSB، تُترك المعلق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بالتجمعات البكتيرية الكبيرة بالترسب. بعد ذلك، يُنقل 1 mL العلوي من المعلق إلى أنبوب معقم دون تعكير الراسب. يتم إذابة البكتيريا بإضافة 1 mL من 1%SDS و0.1 M من هيدروكسيد الصوديوم إلى أنبوبين يحتوي كل منهما على 20 µL من المعلق البكتيري، ثم يُقلب الأنبوب للمزج. وذلك لتقدير أعداد البكتيريا.

قم بقياس محتوى الحمض النووي عن طريق تحديد امتصاصية المحلول. عند 216 نانو متر، اضبط كثافة المعلق البكتيري المطلوبة في وسط العدوى لإصابة الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري. بالنسبة للخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري أو H-B-M-E-C-A التي تم استزراعها قبل يومين من التلوين المناعي، ضع شرائح زجاجية غطاء مقاس 16 مليمتر في آبار طبق يحتوي على 12 بئراً، واستزرع خلايا HBME بنسبة 50% من التلاقي (Confluence) على الشرائح الغطاء، ثم حضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي.

قم بإصابة الخلايا بالمعلق البكتيري الذي تم تحضيره حديثاً في مختبرنا. يتم استخدام نسبة إصابة تتراوح من 200 إلى 300 وحدة تشكيل مستعمرة لكل خلية مستهدفة بشكل روتيني. تُحضن الخلايا لمدة تتراوح من ثلاث إلى ثماني ساعات عند 37 °C في 5% carbon dioxide في نهاية فترة الإصابة.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بتثبيتها باستخدام 500 µL من para formaldehyde بتركيز 2% لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل para formaldehyde، قم بنفاذية الخلايا المثبتة بـ paraldehyde عن طريق تحضينها في 0.1% Triton X 100 مخفف في PBS لمدة 10 دقائق. وأخيراً، اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS ثم انتقل إلى صبغ المناعة كما هو موضح. بعد ذلك، يمكن إجراء صبغ البكتيريا داخل الخلوية و dfor actinin في وقت واحد.

في أطباق ذات 12 بئراً، قم بحجب شرائح الغطاء التي تحتوي على الخلايا النفاذة باستخدام 500 µL من 3% B-S-A-P-B-S-T لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة، وبعد الغسل باستخدام PBS، انقل كل شريحة غطاء إلى بئر جاف جديد في الطبق ذات الـ 12 بئراً، ثم أضف الأجسام المضادة الأولية ضد البكتيريا و alpha actinin في وقت واحد؛ حيث تكفي كمية تتراوح بين 80 إلى 100 µL من الجسم المضاد لكل شريحة غطاء إذا أضيفت بعناية لتغطية سطح الشريحة، ثم قم بالتحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة التحضين، أضف 200 µL من PBS إلى البئر، ثم ارفع شريحة الغطاء وضعها في بئر جديد يحتوي على 500 µL من PBS. بعد خمس دقائق، قم بإزالة PBS بواسطة الماصة ثم أضف PBS جديداً. كرر العملية مرتين وانقل شرائح الغطاء إلى بئر جاف جديد.

بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة والمقترنة بفلوروكروماوات مختلفة والمخففة في 1%B-S-A-P-B-S-T. تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام، وفي نهاية فترة التحضين تُغسل كما هو موضح سابقاً، ثم يتم صبغ الحمض النووي DNA باستخدام DPI لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وفي نهاية هذه الفترة، تُغسل الشرائح الغطائية في PBS مرة واحدة، ثم تُثبت بقطرة من وسط التثبيت. يجب تخزين الشرائح الغطائية المثبتة في الظلام حتى تصبح جاهزة للفحص. وتحت المجهر، نقوم بفحص والتقاط صور لعيناتنا الموصومة مناعياً باستخدام مجهر مسح ليزري بؤري متصل بمجهر فلوري انقلابي.

لبدء إجراء مجهر المسح الليزري confocal (CLSM)، ابدأ بوضع قطرة غمر على العدسة الشيئية، ثم ضع شريحة العينة وغطاءها على منصة المجهر، واضبط المجهر على الوضع البصري، وحدد المنطقة المراد دراستها باستخدام عدسات المجهر العينية؛ الآن أصبحنا مستعدين لاستخدام برنامج Leica. اختر وضع الحصول على الصور XY zed، ثم اختر تنسيق 512 في 512 لدراسات التوضع المشترك (colocalization).

كلما زادت الدقة، زادت دقة الصورة. ثم اختر وضع X ثنائي الاتجاه، والذي سيعمل على زيادة سرعة المسح والمساعدة في تقليل التبييض الضوئي. قم بضبط إعدادات المسح المتسلسل.

انقر على وظيفة SEC ثم اختر ما بين الخطوط. حدد حزم الليزر وفقاً للفلوروكرومات المرتبطة بالأجسام المضادة الثانوية. 405 nanometers لـ DPI و 488 nanometers لـ Alexa, Fluor 488 و 561 nanometers.

بالنسبة لجهاز trixy، قم بتنشيط أنابيب المضاعف الضوئي واحد واثنين وثلاثة على التوالي. حدد أعلى وأسفل مكدس Z أو السلسلة. بعد ذلك، اضبط حجم خطوة Zed على 0.2 micrometers.

يُعد RIA Mencius ثنائي التجاويف (diplo occus)، وبما أن القطر التقريبي لكل تجويف يبلغ 0.5 micrometers، فإن تعيين حجم خطوة Z قدره 0.2 micrometers يعزز من احتمالية مسح كل تجويف مرتين على الأقل. حدد معاملات المسح النهائية باختيار متوسط الخطوط بمقدار ثلاث مرات لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ثم انقر على بدء (start). يتم الحصول على الصور المصبوغة بصبغتين أو ثلاث صبغات عن طريق المسح المتسلسل عند أطوال موجية مختلفة، وباستخدام وضع "بين الخطوط" (between lines mode) لكل قناة للقضاء على التداخل (crosstalk) بين الكروموفورات المختلفة.

لإثبات التموضع المشترك لصبغتين فلوريتين، اختر وظيفة التراكب (overlay) لدمج القنوات المحددة في صورة واحدة. على سبيل المثال، عند حدوث تموضع مشترك لكل من Alexa 488 و trissy Fluor Chromes، سيظهر اللون الأصفر في الصورة المتراكبة. ولإجراء إعادة بناء ثنائية الأبعاد (2D) مطلوبة لتصور التموضع المشترك المحتمل، قم بتجميع مكدس Z (Z stack) أو سلسلة من الصور باستخدام وظيفة الإسقاط الأقصى (maximum projection). بعد الحصول على مكدس Z أو السلسلة، قم بمعالجة بياناتك للحصول على صورة متعامدة (orthogonal image) لتصور التموضع داخل الخلايا للعناصر المختلفة.

يتم إجراء التحديد الكمي للتوضع المشترك باستخدام برنامج Vol City المقدم من IMP. للبدء، أنشئ مكتبة تحتوي على صور CLSM، ثم اختر "التركيز الممتد" (extended focus) من الصورة في الشريط العلوي. ستقوم هذه الأداة بدمج الصور في صورة ثنائية الأبعاد (2D) ليتم تحليلها.

الآن قم باختيار أداة COLOCALIZATION. يجب أن يكون للقناتين المراد تحليلهما نفس عمق اللون. حدد المنطقة التي سيتم قياسها كمياً.

قم بضبط العتبة (threshold) لإزالة أي خلفية. ثم أنشئ مخرجات التوضع المشترك عن طريق اختيار "توليد التوضع المشترك" (generate colocalization). سيتم توليد إحصائيات التوضع المشترك للمناطق ذات الأهمية التي تم تحديدها مسبقاً.

بعد ذلك، اختر معاملات ماندار R و ny. وأخيراً، قم بتصدير قيم الإحصائيات إلى مستند Excel لعرض البيانات؛ تظهر هنا نتائج تصوير بؤري ممثلة لخلايا بطانية في الدماغ البشري مصابة بـ meninga cockeye لمدة ثماني ساعات. ويظهر موقع البكتيريا باللون الأحمر.

بينما يظهر موقع alpha actinin باللون الأخضر، تشير الأسهم إلى المناطق التي يبدو أنها حدث فيها تراكم بدرجة عالية من alpha actinin حول البكتيريا. وفي صورة التراكب هذه، توجد عدة مناطق يظهر فيها اللون الأصفر البرتقالي، مما يشير إلى وجود تموضع مشترك بين meninga occi و alpha actinin. وفي الصورة التالية، يشير التشريح البصري لطبقة أحادية من H-B-M-E-C مصابة إلى تموضع مشترك حول البكتيريا داخل الخلوية الموجودة في قاعدة الخلية.

عند معالجة الصور ثلاثية الأبعاد لطبقات أحادية من خلايا H-B-M-E-C المصابة، يُظهر العرض المائل للسطح القمي بكتيريا Durant مصبوغة باللون الأحمر يشار إليها بالسهم الأحمر، بينما تقع عدة بكتيريا باتجاه الأسطح القاعدية للخلايا البطانية كما يشار إليها بالسهم الأصفر. ويمكن رؤية الموقع القاعدي ذو اللون البرتقالي والأصفر بوضوح أكبر في هذا المقطع العرضي XZ. وعلى عكس تجارب actinin البعيدة، فإن وسم البكتيريا التي تم استيعابها داخلياً مع menton أو actin أظهر تموضعاً مشتركاً عرضياً مع actin، ولكن تموضعاً مشتركاً نادراً مع fermenting في خلايا H-B-M-E-C.

كما لوحظ في التجارب السابقة، تركز Retin حول عدة بكتيريا مستinternalized أشارت إليها الأسهم البيضاء. كما تم تحليل البيانات للحصول على التداخل النسبي. معامل R، والذي يمثل وفقاً لـ Manda الدرجة الحقيقية للتوضع المشترك IE، أي عدد البكسلات التي تتوضع بشكل مشترك مقارنة بالعدد الإجمالي للبكسلات وقيم NY لـ alpha actinin و menting و actin بشكل عام في H-B-M-E-C المصابة بـ OPC التي تعبر عن meningococci، تم الحصول على تداخل لـ rein في meningococci بنسبة أكبر من 25%.

يمثل المعامل Y مقياساً لتكرار ظهور إشارة الـ rein الأكثر وفرة في كل مرة تظهر فيها إشارة الـ meninga cocoa الأقل وفرة. ويظهر هذا المقياس مستوى ملحوظاً من تواجد alpha actinin في محيط الـ meninga cockeye الممتصة داخلياً. سنوضح لكم الآن كيفية تصور وقياس تداخل البكتيريا الممتصة داخلياً مع عناصر الهيكل الخلوي ضمن هذه التجربة.

من المهم تذكر اتباع بروتوكولات التثبيت والصبغ المناعي بدقة للحفاظ على سلامة البنى وتجنب ارتفاع مستوى الخلفية. هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.