يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

تتم دراسة استجابة الخلايا في الوقت الحقيقي للتحفيز الميكانيكي من خلال تنمية خلايا تعبر عن بروتينات اندماجية GFP أولاً على أطباق ذات قاع زجاجي لمدة 24 ساعة. وتتمثل الخطوة الثانية في طلاء طرف A FM ببروتين الفبرونكتين المبيوتني (biotinylated fibronectin). بعد ذلك، يتم إيصال طرف A FM الوظيفي بسطح الخلية للسماح بتكوين التصاق بؤري قوي حول طرف A FM، مما يتيح التحكم المباشر في الهيكل الخلوي الأكتيني من خلال ارتباط مصفوفة الإنتغرين-أكتين بين الطرف المطلي بالفبرونكتين والخلية.

تتمثل الخطوة النهائية في تحفيز الخلية الحية ميكانيكياً من خلال حركة صعودية محكومة لطرف A FM، بحيث يتم تطبيق القوة العمودية عند نقطة تلامس الخلية دون كسر الالتصاق البؤري القوي. وفي النهاية، أظهرت النتائج أن الخلايا تستجيب للتحفيز الميكانيكي عن طريق تعزيز ارتباطها بالركيزة وتحفيز إعادة تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين، كما تم تسجيله بواسطة التصوير البصري الفلوري في الوقت الحقيقي. مرحباً، أنا أندريا تراك، أستاذ مساعد في قسم بيولوجيا الأنظمة والطب الانتقالي في مركز تكساس A and M للعلوم الصحية.

مرحباً، أنا Sum Lim، زميلة ما بعد الدكتوراه في قسم بيولوجيا الأنظمة والطب translational في مركز Texas A&M للعلوم الصحية. سنعرض لكم اليوم إجراءً لدراسة إعادة تشكيل الخلايا التكيفية استجابةً للتحفيز الميكانيكي.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لاستقصاء إعادة تشكيل الهيكل الخلوي في الوقت الفعلي داخل خلايا العضلات الملساء الوعائية الحية. لذا، دعونا نبدأ. ولإجراء هذه الدراسات، يُستخدم مجهر Olympus IX 81 المقلوب المزود بملحق الفلورة ذات الانعكاس الداخلي الكلي أو TIRF مدمجاً مع رأس مسح CSU 22 Yokogawa.

تم تركيب مجهر القوة الذرية bio scope SZ فوق المجهر الضوئي المقلوب. والنظام بأكمله مثبت على طاولة ضوئية مخصصة للأبحاث، وقد سبق وصفه بالتفصيل. يستخدم هذا المجهر المتكامل كاميرتين من نوع quant EM ذات الجهاز المزدوج شحنة المقترنة بمضاعف إلكتروني أو E-M-C-C-D.

أحدهما مخصص لتصوير العشب والآخر للتصوير البؤري. تتركب وحدة التصوير البؤري، المكونة من ماسح القرص الدوار وعجلة المرشحات الخارجية وكاميرا E-M-C-C-D، على لوحة قاعدة من الألمنيوم موضوعة فوق وسادة سيليكون ضرورية لتخميد الاهتزازات. تتصل وحدة التصوير البؤري بأكملها بالمجهر من خلال شفة ذات طوق ملولب.

وبذلك يمكن فصل وحدة التجميع عن المجهر أثناء إجراء مجهر القوة الذرية أو قياسات FM لتجنب الاهتزازات الناتجة عن ماسح القرص الدوار. ويُستخدم ليزر الأرجون كريبتون كمصدر إثارة لكل من وضعي التصوير turf والتصوير البؤري (confocal). ويمكن ربط الليزر بأي من الألياف الضوئية الاثنين، واللذين ينقلان الليزر إلى ملحق turf أو رأس المسح البؤري.

يتحكم جهازان حاسوبيان في النظام؛ حيث يستخدم أحدهما برنامج slide book للتحكم في التصوير البصري، بينما يستخدم الآخر برنامج nano scope للتحكم في جهاز A FM. قبل 24 ساعة من تجربة التحفيز الميكانيكي، يتم وضع خلايا حية تعبّر عن بنيات GFP مستهدفة لبروتينات محددة في طبق زراعة خلايا ذو قاعدة زجاجية. وفي يوم التجربة، يتم استبدال وسط زراعة الخلايا بوسط خالٍ من الفينول الأحمر (phenol red).

بما أن تجربة a FM حساسة جداً للضوضاء، تجنب التحدث أو لمس الطاولة البصرية أو المجهر أثناء التجربة لتقليل الضوضاء إلى أدنى حد. في قياسات a FM، قم بفصل المجهر متحد البؤر ذي القرص الدوار عن المجهر. تبدأ التجربة بتثبيت طبق زراعة الخلايا على منصة a FM باستخدام طوق مغناطيسي لتثبيت الطبق في منصة المجهر المغناطيسية.

يتم تخصيص العتلة ذات الشكل V في مسبار AFM باستخدام خرزة زجاجية مبيوتنة بحجم ميكرونين. يمكن رؤية العتلة بسهولة باستخدام المجهر. تُثبت الخرزة بالغراء عند الطرف النهائي للعتلة، وهنا يجب وضع محلول الطلاء على شكل قطرات.

لتحضير مسبار FM من أجل التجربة، قم أولاً بتركيب الرأس في الحامل الزجاجي، ثم ضع الحامل الزجاجي على قاعدة الطاولة لطلاء الرأس. اغسل الرأس عن طريق تقطير 10 µL من المحلول الملحي الموقوت بالفوسفات (DPBS) بعناية عند الطرف النهائي للرأس، ثم استخدم منديلاً من نوع kim wipe لتجفيف الرأس. كرر هذه العملية خمس مرات بعد الغسل باستخدام DPBS بتركيز 1 mg/mL.

أضف Avidin في المحلول. أضفه قطرة تلو الأخرى فوق الطرف. اترك الطرف ليحتضن لمدة خمس دقائق بعد طلاء avadon.

اغسل الطرف خمس مرات إضافية باستخدام DPBS. بعد ذلك، قم بربط fibronectin المبيوتني (biotinylated fibronectin) تساهمياً على avadon عن طريق إضافة محلول بتركيز 1 mg/mL قطرة بقطرة على الطرف والتحضين لمدة خمس دقائق.

أخيراً، اغسل السن مرة أخرى خمس مرات باستخدام DPBS مع ترك القطرة الأخيرة على السن. وبمجرد تجهيز السن، قم بتركيبه على ماسح FM. بعد تركيب سن FM، ضع غطاءً واقياً من السيليكون حول الحامل.

بعد ذلك، قم بإعداد المجهر للعرض المرئي. ثم، قم بمحاذاة طرف FM في مركز مجال الرؤية. واضبط الرافعة البصرية عن طريق وضع شعاع الليزر عند الطرف النهائي للعتلة.

ثم قم بتغيير العدسة الشيئية إلى العدسة ذات التكبير العالي المناسبة لتصوير الخلية المفردة. بعد ذلك، قم بجلب الخلية التي سيتم تحفيزها ميكانيكيًا إلى مجال الرؤية، واختر الموقع الذي يجب أن يستقر فيه رأس مجهر القوة الذرية (AFM) على سطح الخلية. وأخيرًا، اخفض رأس مجهر القوة الذرية (AFM) حتى يلامس تلك الخلية المحددة.

بعد ملامسة السن للخلية، انتظر لمدة 20 دقيقة تقريبًا. يسمح ذلك بتكوين التصاق بؤري قوي عند نقطة تلامس مجهر القوة الذرية (FM) على سطح الخلية. وبعد انقضاء فترة الانتظار، يمكن البدء في إجراء التحفيز الميكانيكي تحضيراً لتجربة التحفيز الميكانيكي.

انتقل من كاميرا الفيديو إلى كاميرا E-M-C-C-D للسماح بمعاينة الخلايا الفلورية من أجل التصوير. بعد ذلك، قم بالتقاط صورة أولية للخلية في حالة الراحة. استخدم مجهر القرص الدوار والمجهر البؤري لتصوير هيكل الأكتين الخلوي في جميع أنحاء جسم الخلية.

وعلى العكس من ذلك، استخدم Turf لتصور الالتصاقات البؤرية لتحفيز الخلية. استخدم الكابول (cantilever) لتطبيق حركة صعودية محكومة في خطوات منفصلة كل ثلاث إلى خمس دقائق. وأثناء الحصول على بيانات A FM، من المهم أن يقوم المشغل بمراقبة جهد موضع Z piso باستمرار لتحديد التوقيت المناسب للقطب الرأسي.

بالتزامن مع تسجيل بيانات مجهر القوة الذرية (AFM)، قم بالتقاط صورة بؤرية (confocal) أو صورة turf للخلية بعد كل عملية سحب عمودية باستخدام برنامج slide book. وأخيراً، اسحب رأس مجهر القوة الذرية (AFM) من الخلية عند اكتمال تجربة التحفيز. خلية عضلة ملساء وعائية منقولة جينياً بـ actin MRFP و vcul.

تم تصوير GFP باستخدام مجهر الفلورسنت (FM) عند السطح القمي للخلية. وصُوِّرت الخلية نفسها باستخدام turf عند السطح القاعدي للخلية. وهنا تظهر الصورتان متداخلتين.

تم أيضاً الحصول على صورة للخلية نفسها باستخدام المجهر البؤري ذي القرص الدوار (spinning disc confocal) عبر جسم الخلية بالكامل، وتظهر هنا كإسقاط أقصى (maximum projection) لمجموعة صور ثلاثية الأبعاد (3D stack). ويظهر تداخل جيد بين صور الـ A FM وصور المجهر البؤري ذي القرص الدوار. تم تحفيز خلية العضلات الملساء الوعائية التي تم نقل جين actin MRFP إليها ميكانيكياً بواسطة الـ A FM وتصويرها باستخدام المجهر البؤري ذي القرص الدوار.

تشير هذه الأخطاء إلى ألياف الأكتين التي تظهر إعادة هيكلة ملحوظة عند التحفيز بواسطة FM. حيث تتبلمر بعض ألياف الأكتين بينما تفقد بلمرتها ألياف أخرى نتيجة للتحفيز الميكانيكي، بينما تتجمع ألياف أكتين أخرى في حزم. وبسبب إعادة هيكلة الأكتين، لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحفيز مزرعة خلايا حية ميكانيكياً باستخدام EFM مع تسجيل إعادة ترتيب CY في الوقت ذاته باستخدام طرق التصوير الضوئي.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن تجربة FM تكون مشوشة للغاية وحساسة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في قياساتكم.