التصوير الفرق البنيات البيولوجية مع المضاعفة - الرنانة نثر المضادة للستوكس المتماسك رامان (سيارات)

يوضح هذا الفيديو إجراءً لإجراء التصوير التفاضلي لرنينين من رنين رامان المرتبطين بهياكل بيولوجية ذات إشارات تشتت رامان متماسكة. أولاً، يتم دمج ثلاثة ليزرات ذات نبضات قصيرة متزامنة في الزمان والمكان. ثم تُرسل النبضات المدمجة إلى مجهر مقلوب قياسي، مما يسمح بتوليد إشارات رامان متماسكة من الأجسام المجهرية.

يتم تحويل الإشارات إلى صور باستخدام برنامج تجاري من أجل مقارنة إشارات رامان المختلفة الناتجة. وتشير النتائج إلى أن الفرق بين الصور التي تم الحصول عليها من إشارات رامان ذات الرنين المزدوج والأحادي يوفر حساسية معززة لإشارات رامان الضعيفة. مرحباً، أنا تايلر ويكس من مركز الفوتونيات الحيوية في جامعة كاليفورنيا ديفيس.

أنا توماس إي آر من مركز البيوفوتونيات وقسم الطب الباطني بجامعة كاليفورنيا ديفيس. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستخدام تشتت رامان المترابط مضاد ستوكس مزدوج الرنين لإنتاج صور ذات خصوصية كيميائية للخلايا. نحن نستخدم هذا الإجراء للكشف عن الإشارات الصادرة من الجزيئات التي تكون ضعيفة جداً لدرجة لا يمكن معها اكتشافها مباشرة بواسطة مطيافية رامان المترابطة مضادة ستوكس وحدها.

لنبدأ الآن؛ من أجل توليد إشارات CARS و Dr-CARS في آن واحد، يتطلب الأمر ثلاثة مصادر ليزر نبضية قصيرة قابلة للضبط ومتزامنة. وللحصول على هذه النبضات المتزامنة، نبدأ بليزر نبضي قصير واحد بقدرة خرج تبلغ 10 watts، وطول موجي ثابت قدره 1064 nanometers، وطول نبضة ثابت يبلغ سبع picoseconds، ومعدل تكرار ثابت قدره 76 megahertz.

يتم تقسيم الشعاع إلى ثلاثة أجزاء باستخدام سلسلة من الصفائح نصف الموجية ومكعبات مقسم الأشعة المستقطبة. وتسمح الصفيحة نصف الموجية مدمجة مع مكعب مقسم الأشعة المستقطب بضبط مقدار الطاقة في كل مكون من مكونات الشعاع دون تغيير اتجاهه. وعادةً ما يتم ضبط شعاعين ليكون كل منهما حوالي 4.5 watts، بينما يحتوي الشعاع الثالث على الواط الواحد المتبقي.

يتم بعد ذلك توجيه الشعاعين عاليي الطاقة إلى مذبذبين بارامتريين بصريين مستقلين أو ما يعرف بـ OPOs. تستخدم الـ OPOs توليد ترددات مختلفة لتحويل فوتون عالي الطاقة إلى فوتونين أقل طاقة وبأطوال موجية مختلفة. ومن خلال التحكم في درجة حرارة البلورة المستخدمة لتحقيق هذا التأثير، يمكن التحكم في الأطوال الموجية للفوتونات الناتجة بدقة تصل إلى 0.1 nanometers.

من خلال مضاعفة تردد هذه الإشارات، يمكن الآن تحويل ليزر ذي طول موجي ثابت يبلغ 1064 nanometers إلى شعاع ليزر يمكن ضبطه في أي مكان بين 780 nanometers و910 nanometers عن طريق ضخ اثنين من المذبذبات البارامترية البصرية (OPOs) المنفصلة باستخدام نفس مصدر الـ 1064 nanometer. وبذلك يتم الحصول على مصدرين ليزر يمكن ضبطهما بشكل مستقل ومزامنتهما تلقائياً مع ليزر الضخ الأصلي. أما الشعاع الثالث الناتج عن ليزر الضخ 1064 nanometer فيتم توجيهه حول الـ OPOs بواسطة مجموعة من المرايا العازلة (dielectric mirrors) بحيث يمكن إعادة دمج الأشعة الثلاثة جميعها لاحقاً.

من أجل إنتاج فوتونات إشارة رامان متماسكة بكفاءة، يجب أن تتداخل النبضات المعاد دمجها زمنياً ومكانياً؛ نظراً لأن المذبذبات البارامترية البصرية (OPOs) تحتوي على تجاويف حلقية تسمح لكل نبضة ليزر بالمرور عبر البلورة عدة مرات، فإن الشعاع المرسل عبر الـ OPOs يقطع مسافة إضافية تؤدي إلى تأخير ملحوظ بالنسبة لشعاع الضخ الأصلي. يجب تعويض هذه المسافة باستخدام شعاع ثالث من خلال إدخال مرايا إضافية تجبر هذا الشعاع على قطع المسافة نفسها التي قطعها الشعاعان الآخران قبل إعادة دمجهما باستخدام مرايا ثنائية اللون، وذلك لتوفير ضبط دقيق لطول المسار. يتم إرسال كل شعاع عبر مراحل تأخير قابلة للتعديل، مما يسمح بضبط التداخل الزمني لنبضات الليزر المختلفة.

تُضاف مجموعة أخرى من الصفائح نصف الموجية ومكعبات تقسيم الحزمة المستقطبة إلى كل حزمة للسماح بضبط قدرة الليزر لكل حزمة بشكل مستقل. تُستخدم المرايا ثنائية اللون لدمج الحزم القادمة من جهازي OPO أولاً، ثم دمج حزمة 1064 nanometer؛ ويجب توخي الحذر لضمان تداخل الحزم بدقة في الفضاء. يمكن التحقق من ذلك من خلال مقارنة تداخل الحزم على بعد سنتيمترات قليلة من المرآة ثنائية اللون مع تداخلها على بعد متر واحد تقريباً من المرآة ثنائية اللون.

نظرًا لأن التعرض لحزم الليزر ذات متوسط القدرة العالي يمكن أن يتلف العينة، يتم إرسال الحزم الثلاث المدمجة عبر مُعدل بصري كهربائي يعمل كمنتقٍ للنبضات (pulse picker)، مما يسمح بضبط معدل تكرار النبضات التي تصل إلى العينة، وبالتالي التحكم في متوسط القدرة. ثم يتم إقتران حزم الليزر المدمجة بمجهر مقلوب مزود بعدسة شيئية ذات فتحة عددية (numerical aperture) عالية أو na. ويسمح التركيز الدقيق الناتج عن العدسة الشيئية ذات الـ NA العالية بتوليد إشارات رامان (ramen) متماسكة بأكبر كفاءة ممكنة على مقاييس طول مجهرية.

تثبت العدسة الشيئية للمجهر على منصة بيزو (pizo stage) ذات محاور X وY وZ، مما يتيح الحصول على الصور عن طريق المسح النقطي (raster scanning) للحزم عبر العينة، بشكل مشابه للمجاهر البؤرية (confocal microscopes) التجارية التي تعمل بمسح الحزم. لنرى الآن كيفية توليد إشارات CARS وDRFM؛ حيث يؤدي تفاعل ثلاث حزم ليزر ذات نبضات قصيرة عند العينة إلى توليد عدة إشارات لمزج الموجات الرباعي، مثل CARS الناتجة عن التوليفات المختلفة لليزرين، بالإضافة إلى إشارات CARS ثلاثية الألوان وإشارات DR CARS الناتجة عن توليفة الليزرات الثلاثة جميعاً. وعندما تكون الإشارات متقاربة نسبياً في الطول الموجي، فقد يكون من الصعب فصلها لتحليلها.

لهذا السبب، يتم تمرير الإشارات إلى مطياف تصوير يعمل أيضاً كموحد لون أو مرشح تمرير نطاق لفصل الإشارات مكانياً عند أطوال موجية مختلفة. وتقوم مرآة قلابة يتم تفعيلها إلكترونياً داخل المطياف، عندما تكون في الوضع المنخفض، بإرسال الإشارة إلى كاميرا ذات جهاز اقتران شحني (CCD) بنضوب عميق وإضاءة خلفية، والتي توفر معلومات طيفية عبر نطاق الإشارة بأكمله، وتسمح لنا بتحديد وتحسين إشارات robin المترابطة المختلفة لاختيار الإشارة المراد تصويرها. ما عليك سوى تدوير محزز الحيود داخل المطياف باستخدام برنامج التحكم واكتساب البيانات المورد من الشركة المصنعة لتركيز الذروة المطلوبة في منتصف كاميرا CCD.

بعد ذلك، قم بتغيير موضع المرآة القلابة لإعادة توجيه الإشارة إلى منفذ خروج ثانٍ متصل بصمام ثنائي ضوئي انهياري (APD) لحساب الفوتونات المفردة أو كاشف ضوئي (PD). قم بإجراء مسح نقطي (Raster scan) للعدسة الشيئية، ثم استخدم الإشارات المسجلة على الـ APD لتوليد صورة من خلال عرض معدل عد الفوتونات لكل بكسل باستخدام برنامج الحصول على البيانات. كرر إجراء التصوير هذا لكل إشارة رامان متماسكة مطلوبة بحيث يمكن مقارنة الإشارات أثناء مرحلة المعالجة اللاحقة.

لنلقِ نظرة الآن على كيفية تحضير العينة بشكل صحيح من أجل الحصول على صور واضحة وقابلة للتكرار. يجب توخي بعض الحذر عند تحضير العينات، حيث يتم تحضير العينات عادةً على شرائح غطاء زجاجية يبلغ سمكها 150 micron تقريباً.

تعد هذه الأغطية الزجاجية رقيقة بما يكفي للسماح بالتصوير عالي الدقة باستخدام عدسات شيئية غمرية مائية أو زيتية ذات فتحة عددية (NA) عالية، والتي تُستخدم في هذه التجارب. ولتوضيح كيفية تحضير عينة نموذجية، نقوم بتحضير مقاطع من نسيج عضلة الفأر بسمك 20 micron تقريبًا ومثبتة على شريحة مجهرية. ثم تضاف قطرة بحجم 20 µL من محلول جلوكوز مُدَيتَر بتركيز 5 molar إلى العينة.

يوفر محلول الجلوكوز المديترن بصمة خلفية قوية وفريدة لرامان. توضع شريحة تغطية زجاجية فوق العينة وتُثبت في مكانها باستخدام طلاء الأظافر للخلايا والمزارع الخلوية. كما يمكن استخدام أطباق زراعة ذات قاع زجاجي تتيح التصوير دون الحاجة إلى فصل الخلايا عن أطباق نمو المزارع الخلوية الخاصة بها.

دعونا نرى الآن كيفية تحديد نطاقات وقمم رامان المناسبة لـ Dr cars. من أجل الاستفادة بشكل صحيح من تأثير التعزيز الرنيني المزدوج، يجب معرفة أطياف رامان لكل من المواد الرنينية؛ وعادةً ما تكون هذه القيم 2,845 cm⁻¹ المرتبطة بالليبيدات و 2,121 cm⁻¹ لوضع تمدد CD المرتبط بالجلوكوز المديترن.

يتحقق تشتت رامان المتماسك عندما يتطابق فرق التردد بين ليزرين مع تردد الاهتزاز الجزيئي. ومن خلال ضبط أحد المذبذبات البارامترية الضوئية (OPO) على 817 نانومتر، فإنه سيقوم بفحص نمط C عند 2,845 سم⁻¹ عند دمجه مع شعاع ليزر 1064 نانومتر، وبضبط المذبذب البارامتري الضوئي الآخر على 868 نانومتر، فإنه سيفحص التردد 2,121 سم⁻¹ عند دمجه مع شعاع 1064 نانومتر. وفي وضع التحليل الطيفي، يتيح لنا مجهر CAR رصد ثلاث إشارات رامان متماسكة ذات أهمية: إشارة CAR تفحص اهتزاز تمدد CH، وإشارة CAR تفحص نمط تمدد CD، وإشارة DR CAR تفحص كليهما؛ وفي المخطط الموضح هنا، تشير الأسهم المتقطعة إلى الفوتونات القادمة من الليزر في المذبذبات البارامترية الضوئية، بينما تشير الأسهم المتصلة إلى الإشارة الناتجة.

تشير الخطوط الأفقية المتصلة إلى طاقة اهتزاز رامان، وتقدم تمثيلاً مرئيًا يوضح أن خلط الفوتونات الثلاثة نفسها في DR cars يقوم بسبر اهتزازين مختلفين لرامان في آن واحد. وسيتطلب الأمر تحسين قوة الإشارة لكل قمة من خلال الضبط بخطوات دقيقة حول مواقع هذه القمم. هنا نقوم بتحديد كل قمة والتقاط صور لديدان sea elgan في محلول من derated glucose، وتتطلب استخلاص معلومات إضافية بناءً على هذه الصور الثلاث التي تم الحصول عليها بشكل فردي بعض عمليات معالجة الصور البسيطة للغاية.

أولاً، يجب تسوية الصور. تعتمد طريقة عملية للتسوية على حقيقة أن الدهون كارهة للماء. وهذا يعني أنه في المناطق ذات الكثافة العالية للدهто، فإن رنين CD الناتج عن الجلوكوز يجب أن يساهم بقدر ضئيل جداً في إشارة الرنين المزدوج.

وعلى العكس من ذلك، في مناطق محلول الجلوكوز النقي، يجب أن تساهم رنينات CH من الدهون بقدر ضئيل جداً أيضاً. ومع وضع ذلك في الاعتبار، قم بمعايرة صورة DR car وصورة car التي تم الحصول عليها عند رنين CD لمحلول الجلوكوز المديترن إلى منطقة تقع خارج نطاق دودة CL egan تماماً والتي يجب ألا تظهر أي رنين CH. بعد ذلك، حدد منطقة داخل الدودة في صورة car ذات رنين CH تكون غنية بالدهون، وقم بمعايرتها بالنسبة للمنطقة المقابلة لها ضمن صورة DR car المعايرة.

لكي تعمل هذه الطريقة بشكل صحيح، نفترض عدم وجود جلوكوز مُدّتَر (deuterated glucose) في عمق هذه المنطقة. وهذا افتراض آمن لأن الدهون كارهة للماء ولن تختلط بالمحلول. الآن، ومن خلال طرح صورة رنين CH الموحدة من صورة رنين DR الموحدة، تتبقى فقط إشارة رنين CD المُضخمة، وبالمثل يتم ذلك عن طريق طرح صورة رنين CD الموحدة من صورة Dr.FWM الموحدة.

يظهر هنا فقط إشارة رنين CH المضخمة؛ هذا هو طيف رامان لحمض أوليك معدل يتضمن تعديلاً ألكينياً، حيث أن رنينات CH القوية عند 2,845 cm⁻¹ ورنين الألكين عند 2,121 cm⁻¹ كلاهما معزول بشكل جيد عن منطقة بصمة الإصبع، وهي المنطقة ذات القمم المتراصة بكثافة، مما يجعلهما علامات مثالية لتصوير رامان المترابط. هذا طيف نموذجي لإشارات رامان المترابطة الناتجة عند تداخل ثلاثة ليزرات ذات نبضات قصيرة داخل العينة. تشير الأسهم إلى العمليات المسؤولة عن كل إشارة كما هي ممثلة في مخططات الطاقة.

هذه نتائج نموذجية لتصوير ديدان C Elgin باستخدام DR cars وcars. استخدم الصف العلوي الإشارات الثلاث التي عُرضت للتو لتصوير دودة في محلول من الجلوكوز المخفف. وفي الصف الثاني، تم توحيد الصور بشكل مناسب، بينما في الصف الثالث تم إنتاج صور الفرق عن طريق طرح كل من صور car من صورة DR car. لقد عرضنا لكم الآن كيفية إجراء تصوير فرق رامان بناءً على مجهرية مضاد رامان المتسقة ذات الرنين المزدوج.

عند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر أنه من المهم التأكد من تداخل الحزم ومزامنتها بشكل صحيح. كما يجب عند التبديل بين الإشارات المتماسكة المختلفة الحرص على عدم صدم العينة أو تحريكها، لأن ذلك سيؤثر على التحليل. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.