وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

تم اقتراح زراعة جزر لانجرهانز كعلاج محتمل لمرض السكري من النوع الأول. ومع ذلك، هناك قيدان رئيسيان يمنعان تحويل هذا الإجراء إلى واقع سريري واسع النطاق. أولاً، هناك حاجة إلى عدد كبير من الجزر لكل متلقٍ.

بما أن الجزر البنكرياسية يتم الحصول عليها من متبرعين بالأعضاء، فإن عدد المتلقين المحتملين محدود للغاية. وتتطلب عملية الزرع الثانية علاجاً مدى الحياة بمثبطات مناعية قوية، مما يعرض المريض، وخاصة في مرحلة الطفولة، لخطر الإصابة بالأورام الخبيثة والعدوى والفشل الكلوي. لذا، يتم إجراء عملية زرع الجزر البنكرياسية تحت محفظة الكلية في الفأر لبحث استراتيجيات تحسين نتائج الزرع السريرية.

عزل الجزر من فئران مانحة سليمة وتوزيعها إلى مجموعات وتجهيزها للزراعة. ثم تُزرع الجزر في الحيز تحت المحفظة للكلية. وفي الفئران المستقبلة المصابة بالسكري، يتم تقييم وظيفة طعم الجزر من خلال مراقبة مستويات جلوكوز الدم، والتي تكشف أن حوالي 250 إلى 350 جزيرة ستعمل على استعادة مستوى السكر الطبيعي في الدم لدى فأر مستقبل يزن 20 gram في غضون 24 ساعة من عملية الزراعة.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية فيما يتعلق بخطوات تَقْنِية القسطرة. فمن الصعب تعلم كيفية قسطرة القناة الصفراوية الشائعة ونقل العروات إلى الحيز تحت الكبسولة الكلوية. تتطلب هذه الخطوات تحديداً دقيقاً للهياكل النسيجية، وثباتاً في اليدين، واستخدام تقنية تقلل من تلف الأنسجة.

ضع فأراً تم القتل الرحيم له في وضعية الاستلقاء الظهري على منشفة ورقية تحت مجهر التشريح، ثم رش البطن بـ 70%ethanol. استخدم المقص لفتح البطن بعمل شق على شكل حرف V من المنطقة العانية وصولاً إلى كلتا الساقين الأماميتين. يظهر الفأر أسفل مجهر التشريح.

ثبته بحيث يكون الرأس موجهاً نحو الفاحص. حدد موقع مدخل القناة الصفراوية المشتركة في الاثني عشر باستخدام ملقط شرياني (hemostat)، وهو فتحة القناة الصفراوية المشتركة في الاثني عشر. يجب وضع الملقط الشرياني بحيث يكون عند ضغطه، موازياً تماماً للحد الفاصل بين البنكرياس والأمعاء.

سيتم هنا توضيح طريقتين لقسطرة القناة الصفراوية: طريقة اليد الحرة وطريقة المساعدة بالملقط لقسطرة القناة الصفراوية. عند استخدام طريقة اليد الحرة، اسحب الملقط الشرياني المثبت على الاثني عشر بعيداً عن رأس الفأر باتجاه الذيل بحيث تصبح القناة الصفراوية المشتركة مشدودة.

يوجد ملتقى في القناة الصفراوية بالقرب من الكبد حيث تجتمع الصفراء المفرغة من المرارة والإنزيمات القادمة من الكبد. قبل الدخول إلى الأمعاء، اسحب القناة الصفراوية بإحكام للكشف عن الجزء الداخلي من موضع حرف V. استخدم إبرة مقوسة قياس 27 gauge متصلة بمحقنة سعة 5 mL بحيث تنزلق الإبرة مباشرة عبر حرف V لعمل قسطرة للجزء السفلي من القناة. أدخل الإبرة عدة مليمترات متجاوزة نهاية الشطب لمنع التدفق العكسي إلى الكبد والمرارة.

بمجرد نجاح عملية القنطرة، قم بتروية البنكرياس عن طريق توزيع 2 mL من إنزيم liase من المحقنة. راقب تمدد البنكرياس فوق المعدة كدلالة على نجاح القنطرة بشكل مثالي. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء القنطرة للقناة الصفراوية.

باستخدام طريقة ملقط الكيس، اسحب الملقط الشرياني C المثبت على الاثني عشر بعيداً عن رأس الفأر باتجاه الذيل بحيث تصبح القناة الصفراوية المشتركة ملتوية. ثم باستخدام إبرة مقوسة عيار 27 متصلة بمحقنة سعة 5 mL، قم بثقب اللفافة الموجودة أسفل القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من الكبد.

استخدم الإبرة لإزالة اللفافة عن القناة بينما لا تزال الإبرة في مكانها. ضع الملقط الشرياني جانبًا والتقط زوجًا من الملاقط. استخدم أحد طرفي الملقط المفتوح لدعم القناة الصفراوية في الموضع الذي أزالت فيه الإبرة اللفافة، مع سحب القناة والملقط إلى الأمام.

قم بتمرير الإبرة داخل القناة باستخدام الملقط كمسند خلفي. ويستدل على نجاح عملية القسطرة من خلال التمدد المتساوي لمنطقة البنكرياس فوق المعدة. وبمجرد إتمام تروية البنكرياس، قم بإزالة الملقط الشرياني من الاثني عشر.

بعد ذلك، استخدم الملقط لرفع الاثني عشر، واستخدم زوجاً ثانياً من الملاقط لفصل البنكرياس عن الأمعاء. تالياً، اسحب البنكرياس لتحريره من الجزء العلوي من المعدة والطحال. وأخيراً، ارفع البنكرياس خارج تجويف البطن واقطعه لتحريره من بقايا الروابط اللفافية المتصلة بالأمعاء والمعدة والطحال.

ضع البنكرياس في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter وضعه على الثلج. حضن البنكرياس عند 37 degrees Celsius وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق. بعد التحضين، أضف 20 milliliters من الوسط الغذائي إلى الأنابيب وقم بتفكيك النسيج عن طريق رج الأنابيب بقوة 40 مرة خلال 10 seconds.

تعد هذه الخطوة حاسمة لاستعادة البنفسج بشكل مثالي. يتم تدوير الخلايا بسرعة 800 دورة في الدقيقة. أعد تعليق الراسب في 15 milliliters من الوسط الغذائي وقم بتركيز العينات.

صُب المعلق المعاد تعليقه عبر شبكة سلكية بفتحات 0.419 millimeter وقم بتصفيته في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. اشطف الأنبوب الأول بكمية إضافية قدرها 10 milliliters من الوسط الذي يحتوي على 10% fetal bovine serum وصبه عبر الشبكة السلكية. قم بتجميع الخلايا في كريّة عن طريق الطرد المركزي، ثم أعد تعليق الكريّة في خمسة milliliters من Hisopaque 1077 بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بالرج باستخدام جهاز vortext بلطف لعدة ثوانٍ، وأضف خمسة milliliters إضافية من Hisopaque مع التحريك حول الجدار الداخلي للأنبوب لغسل الخلايا العالقة بجدار الأنبوب. اسحب ببطء باستخدام الماصة 10 milliliters من وسط RPMI الخالي من المصل لعمل طبقة فوقية، وذلك بتنزيلها على جانب الأنبوب بمعدل 1 milliliter لكل 10 ثوانٍ.

يجب أن يكون هناك فاصل حاد وواضح. بعد ذلك، يتم تدوير العينات في جهاز طرد مركزي ذي دلاء متأرجحة عند 20 °C وبقوة 900 ×g لمدة 20 دقيقة مع تسارع بطيء جداً وبدون كبح؛ وبعد عملية الطرد المركزي، يتم فصل الجزر عن الخلايا القنوية باستخدام ماصة سيرولوجية Disposable بسعة 10 mL. يتم نقل الجزر من واجهة وسط HistoPaque إلى أنبوب مخروطي نظيف بسعة 50 mL.

يمكن تجميع عدة أنابيب في هذه المرحلة لإزالة بقايا الجزر، حيث تملأ الأنابيب المعتمة بوسط يحتوي على المصل، ثم تُرسب الجزر عن طريق طرد مركزي للأنابيب لمدة دقيقتين بسرعة 800 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، تُعلق الجزر مرة أخرى في وسط طازج. كرر هذه الخطوة مرتين على الأقل.

قم بتعليق الراسبة في خمسة milliliters من الوسط الزرعي. ضع مصفاة خلايا نايلونية بقطر 0.1 millimeter مقلوبة على أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. استخدم الماصة لنقل ملاط الخلايا المعاد تعليقها من خلالها لجمع العيينات (eyelets).

ثم اشطف أنبوب الـ 50 milliliter بستة milliliters إضافية من الوسط ومررها عبر المصفاة. ضع قطرة بحجم ثلاثة milliliter من الوسط في طبق بتري قطر 10 centimeter. اقلب مصفاة الخلايا واغمسها في قطرة الوسط لجمع العيون، ثم اسحب من خمسة إلى سبعة milliliters إضافية من وسط الزرع عبر المصفاة إلى طبق بتري.

لجمع أي حلقات عينية متبقية من المصفاة تحت عدسة شيئية بقوة تكبير 4x، يتم التقاط الحلقات العينية بشكل فردي باستخدام ماصة P 200 ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. تظهر هذه الصور حلقات عينية تم عزلها من فئران C 57 black six بعمر 12 أسبوعاً. ويمكن تقدير نقاء وجودة الحلقات العينية مجهرياً عند الانتهاء من إجراء عملية العزل.

على سبيل المثال، تظهر الصورتان المعروضتان هنا مجالاً تمثيلياً يحتوي على حطام وتلوث بالخلايا الإفرازية. عند اختيار العوينات (eyelets) لإجراء تجربة ما، تجنب اختيار أي خلايا إفرازية ملوثة أو عوينات تبدو غير صحية. وتعتبر العوينات ذات المراكز النخرية غير صحية كما هو موضح في هذا الشكل الذي تم التقاطه بعد 24 ساعة من العزل، علماً بأن المراكز النخرية لن تكون مرئية مباشرة بعد عملية العزل.

لا يمكن تجنب وجود جزر لانجرهانز التي تسلخ خلاياها، ويمكن استخدامها في زراعة جزر لانجرهانز في هذا الفيديو المسرع لمدة 24 ساعة للجزر. فمباشرة بعد العزل، تتطور مراكز نخرية داخل العديد من الجزر. ويبدو أن هذه المراكز النخرية تُطرد من الجزيرة قرب نهاية التسجيل أثناء عملية التقاط الجزر.

قم بتجميعها بحيث تحتوي كل أنبوبة على توزيع متساوٍ من حيث جودة وحجم العيينات. على سبيل المثال، قد تحتوي كل مجموعة مكونة من 15 عينة على أربع عينات كبيرة الحجم، وست عينات متوسطة، وخمس عينات صغيرة. ضع الأنبوبة على الثلج؛ حيث يمكن استخدام العينات فوراً لعملية الزرع أو معالجتها.

قبل الاستخدام، ضع طرف تحميل هلامي معقم في فتحة أنبوب ميكروي مدمج سعة 1.5 milliliter بحيث يكون هناك انثناء بسيط يشكل حرف U في الطرف الضيق من الرأس. يجب أن تكون كلتا فتحتي الطرف موجهتين مباشرة إلى الأعلى خارج الأنبوب الميكروي المدمج.

أخرج أنبوب العروات (eyelets) برفق من الثلج. تأكد من استقرار جميع العروات في قاع الأنبوب. باستخدام ماصة P 200، اجمع العروات برفق بأقل حجم ممكن من قاع الأنبوب وانقلها إلى الطرف المنحني المجهز.

بعد ترسب الجزر، أزل أكبر قدر ممكن من الوسط من الطرف عن طريق سحب الوسط عبر الفتحة الكبيرة لطرف تحميل الهلام الحامل للجزر، باستخدام طرف تحميل هلام جديد مثبت على ماصة P 200. قم بتوصيل الطرف غير المشطوف من الأنبوب بالفتحة الضيقة لطرف تحميل الهلام الحامل للجزر. ثم قم بتوصيل الطرف بماصة P 200 وادفع الجزر برفق إلى داخل الأنبوب.

بعد ذلك، قم بتوصيل الحافة غير المشطوفة لأنبوب PE 50 بإبرة حقنة هاميلتون سعة 25 microliter. مع سحب المكبس، اضغط على مكبس الحقنة حتى تصبح العيينات على بُعد 0.5 centimeters تقريبًا من الفتحة المشطوفة. ضع الحقنة جانبًا لكي تستقر العينات في كتلة واحدة بالقرب من الفتحة المشطوفة للأنبوب أثناء تحضير الكلية لاستقبال العينات.

قم بتجهيز موقع الجراحة عن طريق قص الشعر وفرك الجلد بـ Betadine بالتناوب مع الكحول الإيزوبروبيلي بتركيز 70% ثلاث مرات. ابدأ إجراء transplantation للعينات عن طريق قرص إصبع القدم للتأكد من تخدير الفأر المستقبِل. ضع ساق قضيب زجاجي مباشرة تحت الفأر وأسفل الكلية بشكل عمودي على الحبل الشوكي.

بعد ذلك، حدد موقع الكلية من خلال الجلد وضع غطاءً جراحياً معقماً. وبمجرد تحديد موقع الكلية، استخدم مقصات McFerson banis لإجراء شق بطول سنتيمترين عبر الأدمة مباشرة فوقها وبشكل عمودي على الحبل الشوكي. سيكشف هذا الشق عن جدار الصفاق باستخدام المقصات.

أجرِ شقاً بطول 1 cm عبر الجدار البريتوني في نفس اتجاه الشق الذي أُجري في الطبقة الجلدية، مع استخدام ساق القضيب الزجاجي كدعامة خلفية، ثم ادفع الكلية عبر الفتحة البريتونية عن طريق الضغط على السطح المجاور. قم بترطيب سطح الكلية المكشوفة باستخدام محلول PBS معقم ومبرد بالثلج بواسطة مسحة قطنية مبللة. كرر هذه الخطوة كل بضع دقائق حسب الحاجة لمنع جفاف محفظة الكلية.

باستخدام إبرة مقاس 27، اصنع شقاً بطول 0.2 سنتيمتر عبر كبسولة الكلية عبر السطح الأمامي للكلية. وبتحريك اليد من الجانب الجانبي الأيسر نحو الجانب الجانبي الأيمن، أدخل أنبوباً شعرياً زجاجياً مسحوباً باللهب. قم بالجس عبر الشق الذي تم عمله سابقاً وحركه في اتجاه خلفي على طول السطح الجانبي الظهري للكلية.

لإنشاء جيب بين محفظة الكلية ونسيج الكلية الحشوي، قم بتحريك الحلقات في سرنجة Hamilton سعة 25 milliliter المُجهزة إلى الحافة القصوى للفتحة المائلة للأنبوب المرن. ثم أدخل الحافة المائلة بحيث تكون متجهة للأعلى داخل الجيب تحت المحفظة. تكون الحافة الطويلة ملامسة لنسيج الكلية الحشوي.

انقل الأنبوب إلى الطرف الخلفي من المحفظة. بعد ذلك، قم بنقل الحلقات ببطء من أنبوب PE 50 إلى الجيب تحت المحفظة عن طريق الضغط على مكبس المحقنة. ومع امتلاء الجيب بالحلقات، اسحب الأنبوب المرن للخلف ببطء لإفساح المزيد من المساحة.

بعد إخراج الأنبوب من الكيس، مرر المسبار الزجاجي على طول السطح الخارجي للكلية من الأمام إلى الخلف لضغط العروات برفق في الطرف القريب من الكيس. وباستخدام ملاقط ذات ذراع منحنية، ارفع بطانة الصفاق المجاورة للفتحة التي أُحدثت من أجل الكلية. ثم استخدم مسحة قطنية مبللة بـ PBS لدفع الكلية برفق مرة أخرى إلى تجويف الصفاق.

أغلق جرح الفأر عن طريق وضع غرز جراحية في جدار الصفاق ومشابك جروح في الطبقة الجلدية. أعِد الفأر إلى قفصه وراقبه. ولأجل التعافي، يجب توفير مياه تحتوي على aceto meine للفأر.

عُزلت حلقات العين من فئران C. وباستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو، تم زرع جرعة علاجية في فئران C 57 black six خيفية. وتمت مراقبة مستويات جلوكوز الدم في حالة عدم الصيام بدءاً من اليوم الأول بعد الجراحة.

يُلاحظ حدوث الرفض في اليوم 17 تقريبًا في الفئران المستقبلة التي تزن 20 جرامًا والتي تلقت 300 حلقة من متبرع خيفيّ هنا. وقد تمت مراقبة التعافي في الفئران التي تلقت إما 150 حلقة أو 300 حلقة من متبرعين متماثلي الجينات. ولم يُلاحظ أي رفض في هذه الزرعات لأن الحلقات مأخوذة من متبرعين متماثلي الجينات.

تقيس جرعة جزر لنجرهانز المُعطاة الوظيفة الأساسية للجزر مباشرة بعد الزرع. بينما لوحظ تعافٍ هامشي عند زرع 150 جزيرة، لوحظ تعافٍ كامل عند زرع 300 جزيرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ الخطوات الحرجة المطلوبة لعزل جزر لنجرهانز من الفأر وزرع تلك الجزر تحت الحيز تحت المحفظي للكلية.

مع التدريب، ستكتسب القدرة على إجراء القسطرة للقناة الصفراوية المشتركة بسرعة، وهي الخطوة الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول.