الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

تنتج أعراض مرض باركنسون، بما في ذلك خلل الوظائف الحركية والنطق، عن انخفاض نشاط الخلايا المفرزة للدوبامين في الدماغ. ويُعد الجهاز العصبي المعوي والبصلة الشمية من أكثر البنى العصبية عرضة للتأثر، وأولها تأثراً. وقد تم ربط مرض باركنسون بالتعرض للمبيدات الحشرية.

من أجل تحليل تأثيرات المبيدات الحشرية على الجهاز العصبي المعوي، يتم إعطاء مبيد الروون للفئران عن طريق التغذية القسرية الفموية. ثم يتم إجراء تروية قلبية للفئران باستخدام بارافورمالدهيد بتركيز 4% للدماغ والجهاز العصبي المعوي. بعد ذلك، يتم استخلاص الأنسجة وتحضيرها وإجراء صبغ مناعي لها للكشف عن البروتينات المرتبطة بمرض باركنسون.

تظهر صور بيتا ثلاثة توبولين وألفا سينوكلين التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر البؤري تراكم ألفا سينوكلين داخل عصبونات الجهاز العصبي المعوي في الحيوانات المعرضة للمبيدات الحشرية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الإعطاء الجهازي لـ rotenone، في أنها تضمن حصر تأثير rotenone في الجهاز العصبي المعوي. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية حول مرض باركنسون، مثل مسببات المرض والآليات الكامنة وراء تطوره.

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج وتشخيص مرض باركنسون لأنها ستسمح بتطوير أهداف علاجية وطرق تشخيصية جديدة. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية معمقة في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل دراسة تأثير السموم البيئية الأخرى على الجهاز العصبي المعوي والسمبثاوي والباراسمبثاوي، بالإضافة إلى جدار الأمعاء. وبشكل عام، قد يواجه الأفراد الجدد في هذه الطرق صعوبة لأن إتقان عملية التغذية القسرية (gavage) يستغرق بعض الوقت.

خطرت لي فكرة هذه الطرق لأول مرة عندما قرأت عن الارتباط بين المبيدات الحشرية ومرض باركنسون. كما كان من المفيد حضور مؤتمر CORAs رفيع المستوى في المؤتمر العالمي لمرض باركنسون في برلين عام 2005. ومن الضروري تقديم عرض توضيحي هادئ لهذه الطريقة.

تعتبر طريقة إعطاء ol عن طريق التغذية القسرية صعبة نظراً لأن الفئران تمتلك تشريحاً مختلفاً عن البشر، ومن ناحية أخرى، تم إجراء تحليل الصور بخطوات مخصصة لهذه الصور. ابدأ البروتوكول بوزن الحيوان، ثم احسب الحجم المناسب من rotenone.

يلزم 0.01 milliliters لكل جرام من وزن الحيوان، وهو ما يعادل جرعة 5 milligram لكل kilogram من الـ roone. املأ حقنة سعة 1 milliliter بمحلول roone، ثم املأ حقنة ثانية بمحلول الناقل. أمسك الفأر مع تثبيت ذيله بإحدى اليدين.

قم بشد جلد الرقبة عن طريق سحبه باستخدام الإصبعين الأولين من اليد الأخرى. وبمجرد تثبيت الرأس بين الإصبعين، أسنده إلى راحة اليد وأدره رأساً على عقب. ثم قم بتثبيت الذيل.

باستخدام الإصبعين الرابع والخامس، ومع إبقاء الرأس مائلاً إلى الخلف، اضغط على الحنك لفتح فم الفأر. أدخل أنبوب التغذية القسري (gavage) برفق في الفم. حرك الأنبوب ببطء في اتجاه المعدة حتى يتم إدخاله بكامل طوله.

لتجنب وصول المادة إلى الرئتين، قم بإعطاء محلول الروون أو المادة الناقلة عن طريق الضغط برفق على السدادة. عند الانتهاء، اسحب أنبوب التغذية القسري ببطء، وأعد الحيوان إلى قفص آخر حتى يتم الانتهاء من جميع الحيوانات في القفص الواحد. بعد العلاج، تخضع الفئران لعملية تروية قلبية باستخدام 4%paraform aldehyde.

في محلول PBS، يتم استخراج الأمعاء عن طريق التشريح ثم توضع في محلول sucrose بتركيز 15% طوال الليل. وفي اليوم التالي، تُنقل الأنسجة إلى محلول sucrose بتركيز 30% وتُحضن مرة أخرى طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، توضع الأنسجة في مجمد بدرجة حرارة -80 °C وتُخزن حتى وقت الاستخدام، ثم تُقطع عينات من الأمعاء بسمك 20 micron باستخدام جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat).

تُنقل المقاطع العرضية إلى شرائح روت، ثم تُجرى إجراءات الحجب والصبغ المناعي. بعد ذلك، يتم استخدام أجسام مضادة لـ beta three tubulin و Antifa synuclein. ويُوصى بأن يقوم شخص خارجي بإجراء تحليل أعمى للبيانات.

لبدء التحليل، افتح برنامج Fiji. افتح ملف الصورة المجهرية بؤرية المسافة (confocal). بعد ذلك، قم بفصل القنوات حتى يكون من الممكن العمل على كل قناة بشكل مستقل.

أغلق القنوات التي لن يتم استخدامها، ثم اختر analyze، وset، وscale، واضبط حجم البكسل (pixel size) على واحد. اضبط المسافة المعروفة (known distance) على 0.13 وانقر على global. سيظهر حجم الصورة الآن بالميكرونات.

حدد قناة alpha synuclein ثم اختر العقدة العصبية، مع التأكد من أن التحديد يشمل العقدة العصبية في جميع المقاطع. قم بتكرار الصورة مع تحديد العقدة العصبية فقط، حيث سيتم تكرار صورة بحجم العقدة العصبية.

اضغط على تحرير المسح (edit clear)، وسيصبح جزء الصورة الواقع خارج المنطقة المحددة باللون الأسود. كرر عملية مضاعفة الصورة مرة أخرى لتقييم مدى نجاح الإجراء. لا ينبغي استخدام الصور التي تعاني من انخفاض نسبة الإشارة إلى ضجيج الخلفية في تحليل الصور.

اختر "image adjust threshold"، ثم اختر "max entropy". بعد ذلك، تصفح المقاطع في الصورة المقصوصة والصورة الأصلية للتأكد من إتمام الإجراء بشكل صحيح.

تحدد عتبة الاستجابة (tropic threshold) مستوى إشارة الكثافة بناءً على المدرج التكراري للصورة، حيث سيتم عرض البكسلات التي تزيد كثافتها عن هذه العتبة فقط في عملية اختيار صورة بيضاء فوق خلفية سوداء. بعد ذلك، انقر على "تنعيم" (smooth). تعمل هذه الخطوة على تحويل الحواف المكسرة للبكسلات في الصور إلى حواف ناعمة في عملية الاختيار.

بعد ذلك، انقر على binary واختر Make binary. ستظهر الصورة كصورة سوداء على خلفية بيضاء؛ ولإجراء الخطوة التالية على صورة مكررة، انقر على analyze، ثم analyze particles. بعد ذلك، حدد show outlines وانقر على summarize.

يجب ترك بقية الإعدادات على وضعها الافتراضي. تتعرف هذه الوظيفة على العدد الإجمالي للبكسلات التي تحتوي على إشارة وتلك التي تم تجميعها معاً لتمثيل المساحة الكلية للبكسلات ذات الإشارة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم تقرير عن عدد مجموعات البكسلات ومتوسط الحجم.

قارن واختر الشريحة ذات المساحة الإجمالية الأكبر التي تظهر ضبطاً جيداً، حيث سيتم تحديد هذه الشريحة. انسخ جدول البيانات الذي يحتوي على إجمالي سطح alpha synuclein وعدد الاشتمالات ومتوسط حجم الجسيمات.

قم بلصق البيانات في جدول بيانات Excel أو تدوينها في مكان آخر. عُد إلى برنامج Fiji. حدد الشريحة التي تم اختيارها مسبقاً في قناة beta tubulin وقم بتحديدها.

حدد منطقة العقدة العصبية ثم انقر على "analyze". بعد ذلك، اختر "measure". سيظهر جدول آخر يوضح المساحة الكلية للعقدة العصبية.

استخرج البيانات من الجدول إلى جدول بيانات Excel بالقرب من قياس alpha synuclein أو انسخها إلى مكان آخر باستخدام Excel. قم بقسمة المعاملات المختلفة التي تم الحصول عليها في قياس alpha synuclein على مساحة العقدة العصبية للحصول على إجمالي مساحة alpha-synuclein وعدد الاشتمالات المعياري وفقاً لحجم العقدة العصبية، وذلك من أجل تحليل تأثيرات rotenone التي تعمل محلياً على الجهاز العصبي المعوي؛ حيث تم إعطاء 5 mg/kg من مبيد rotenone عن طريق التغذية القسرية الفموية لفئران C57BL/6 بعمر سنة واحدة. يظهر المخطط الكروماتوغرافي المعروض هنا وجود قمة rotenone بعد ساعة واحدة من الإعطاء، ومجموعة من الفئران الضابطة التي عولجت بـ 20 mg/kg من rotenone و5 mg/kg من rotenone.

تم تحديد مستويات الروتينون في مستخلصات الدم والدماغ وجذع الدماغ باستخدام تقنية HPLC كما هو موضح هنا. إن إعطاء خمسة مليجرامات لكل كيلوجرام من الروتينون عن طريق التغذية القسرية الفموية لا يؤدي إلى مستويات قابلة للقياس في الدم بعد ساعة أو ساعتين أو ثلاث ساعات من العلاج، وفقاً لما تم تحديده بواسطة HPLC. يوضح هذا الرسم البياني مستويات الروتينون في الدماغ وجذع الدماغ للفئران المعالجة.

بعد ساعة واحدة من إعطاء 10 مليغرام/كجم أو أقل من الروتينون، لا تظهر أي مستويات للروتينون في عينات الدماغ أو جذع الدماغ. وبعد ساعة واحدة من الإعطاء، تم تقييم نشاط المعقد الميتوكوندري الأول في عينات العضلات والدماغ للفئران المعالجة لمدة 1.5 شهر. لا يوجد فرق معنوي بين المجموعات، مما يشير إلى عدم وجود تثبيط للمعقد الميتوكوندري الأول، وهو ما يؤكد عدم وجود روتينون في هذه المناطق.

يتيح تحليل بروتين ألفا-سينوكلين (alpha synuclein)، وهو المكون الأساسي لأجسام ليوي في مرض باركنسون، عقب إعطاء مادة rone، تحديد الكمية الإجمالية لبروتين ألفا-سينوكلين على السطح بشكل موثوق، والتحقق من وجود شوائب ألفا-سينوكلين، ونمط توزيع ألفا-سينوكلين داخل الخلية. يوضح هذا الشكل صبغ anti beta three tubulin، وألفا-سينوكلين، وDAPI في مقاطع من الاثني عشر واللفائفي كما هو موضح هنا. أدى العلاج بمادة roach known لمدة 1.5 شهر إلى زيادة نمط ألفا-سينوكلين النقطي داخل عقد الجهاز العصبي المعوي، مقارنة بمجموعات الضبط لمدة ثلاثة أشهر.

يمكن ملاحظة هذا النمط في كل من اللفائفي والاثني عشر. بعد ثلاثة أشهر من العلاج، يمكن رؤية تكوين شوائب ألفا-سينوكلين أكبر؛ حيث يُظهر الصبغ المناعي الفلوري باستخدام مضادات ألفا-سينوكلين، وtheof، والفلارين، وDPI تجمع تراكمات ألفا-سينوكلين أكبر فقط عند مرور ثلاثة أشهر. تم تحليل هذه التجربة باستخدام طرق التجزئة التلقائية وعتبة التجزئة القائمة على الإنتروبيا.

في الرسم البياني الموجود على اليسار، يمثل كل عمود إجمالي سطح alpha synuclein بالنسبة لسطح العقدة العصبية. وفي الرسم البياني الموجود على اليمين، يمثل كل عمود العدد الإجمالي لشوائب alpha synuclein لكل سطح عقدة عصبية تم أخذه. وتشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن الإعطاء الموضعي لـ rotenone يحفز فسفرة alpha synuclein وتراكمه وتجمعه مع حدوث الدباق في عقد الجهاز العصبي المعوي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في دقيقة واحدة لكل حيوان إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إدخال أنبوب التغذية القسري برفق، وفي حال وجود أي عوائق، يفضل إخراجه ثم إعادة إدخاله باتباع هذه الخطوات. كما يمكن إجراء طرق أخرى مثل HPLC، والصبغ المناعي، وتحليل الصور؛ حيث سيسمح ذلك بتحليل مناطق أخرى، أو دراسة تأثيرات المادة، أو حتى الكشف عن وجود المادة في الدم بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء الأعصاب لدراسة آثار السموم العصبية البيئية على الجهاز العصبي المعوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على تطبيق المقياس بشكل صحيح وتحليل الصور الناتجة عن الكيمياء النسيجية المناعية. لا تنسَ أن العمل مع المواد المتعفنة قد يكون خطيراً للغاية.

لذلك، نوصي باستخدام القفازات والأقنعة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.