التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين

من أجل تنقية بروتين الغشاء Mex B، يتم أولاً التعبير عن Mex B في بكتيريا e coli باستخدام طرق الحمض النووي المؤتلف. ثم تُعزل الأغشية وتُذاب بروتينات الغشاء باستخدام منظف خفيف. يتم تنقية بروتين الغشاء المذاب عن طريق تقنية iMac، ثم تُجرى تنقية إضافية للبروتين باستخدام كروماطوغرافيا الترشيح الهلامي.

يتم تحديد مستوى تنقية البروتين باستخدام الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد بنظام SDS. ورغم أن هذا الإجراء يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة حول ناقلات الغشاء الخلوية المقاومة للأدوية المتعددة، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضاً على بروتينات غشائية أخرى. سيقوم طالب دراسات عليا من مختبري بتنفيذ الإجراءات اليوم. لهذا الإجراء، سيتم استنساخ Mex B من Pseudomonas aeruginosa في ناقل التعبير PET 30 B plus بحيث يتم التعبير عن Mex B مع علامة HEXA histamine في الطرف الكربوني C terminal. ابدأ في المساء بتلقيح أربع مزارع من وسط lb can mycin بحجم 3 mL باستخدام محولات حديثة أو استخدام مخزون مجمد، ثم قم بتنمية المزارع على جهاز تدوير عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل حتى الصباح.

استخدم المزارع الليلية لتلقيح 150 ملليلتر من وسط LB الذي يحتوي على 30 ميكروغرام/ملليلتر من الكانامايسين (Kan Mycin)، ثم قم بنموا المزرعة عند 37 درجة مئوية على هزاز في فترة بعد الظهر. استخدم هذه المزرعة الصغيرة لتلقيح ست مرات من وسط XYT بحجم لتر واحد، حيث يحتوي كل منها على 30 ميكروغرام/ملليلتر.

أضف المايسين في دوارقات تربية السرخس. استخدم 25 milliliters لكل مستنبت لتحقيق تخفيف بنسبة 1 إلى 40. قم بتنمية المستنبتات عند 37 درجة Celsius حتى تصل إلى كثافة ضوئية.

600 تتراوح بين 0.4 و 0.6، لمدة 1.5 ساعة تقريباً. وعندما تصل المزارع إلى الكثافة المناسبة، يتم تحفيز التعبير البروتيني بإضافة 0.5 milliliters من IPTG بتركيز one molar. ثم تُعاد جميع الدوارق إلى الهزاز ويستمر نموها عند 30 °C طوال الليل حتى يتم حصاد البكتيريا في صباح اليوم التالي.

أخرج المزارع من الهزاز وقم بتبريدها. بعد ذلك، ولحصد الخلايا، انقل المزارع إلى أنابيب طرد مركزي وقم بإجراء الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة وبسرعة 5,000 rotations per minute في جهاز طرد مركزي واسع النطاق. وأثناء عملية الطرد المركزي للخلايا، قم بإضافة مثبطات DNAs protease والليزوزيم إلى 100 milliliters من محلول إعادة تعليق الخلايا.

قم أيضاً بتدعيم حصتين من منظم تعليق إعادة تعليق الغشاء (membrane Resus suspension Buffer) بمثبطات البروتياز كما هو موضح في هذا الجدول. احتفظ بالمحاليل الثلاثة جميعاً على الثلج عند اكتمال عملية الطرد المركزي. أعد تعليق كتل الخلايا المترسبة في 100 milliliters من منظم تعليق إعادة تعليق الخلايا (cell resus suspension Buffer).

بعد ذلك، يتم استخلاص الخلايا. يتم تحميل معلق الخلايا في خلية الضغط من نوع French، ثم توضع الخلية على المكبس الفرنسي (French press). يُطبق الضغط حتى يصل إلى 12,000 pounds per square inch.

يتم فتح الصمام بكمية صغيرة جداً بحيث تتدفق الخلايا المحطمة ببطء. ومن المهم عدم فتح الصمام بشكل مفرط مما يؤدي إلى اندفاع الخلايا، لأنها في هذه الحالة ستتحرر بضغط منخفض جداً ولن يتم تحطيمها بكفاءة. اجمع مستخلص الخلايا في زجاجة، مع الحفاظ عليها باردة فوق الثلج.

مرر محلول الخلايا عبر خلية الضغط الفرنسية (French pressure cell) مرة أخرى عند 12, 000 pounds per square inch. انقل ناتج تحلل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي من نوع SS 34 وقم بإجراء الطرد المركزي لإزالة حطام الخلايا عند 10, 000 rotations per minute لمدة 30 minutes عند درجة حرارة four degrees Celsius باستخدام دوّار SS 34. الخطوة التالية هي الحصول على ناتج التحلل المصفى.

تُستخدم لتحضير الجزء الغشائي. انقل الطافي بعناية إلى أنابيب طرد مركزي فائق من نوع ti. 6 4, 7 0.5، ثم قم بالطرد المركزي باستخدام دوار TI 6 4 7 0.5 بسرعة 40,000 دورة في الدقيقة لمدة 50 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

تخلص من السائل الطافي. استخدم ماصة لإعادة تعليق الراسب الذي يحتوي على أغشية الخلايا بلطف في حوالي 25 milliliters من محلول منظم تعليق الأغشية (membrane Resus suspension buffer)، ثم انقل معلق الأغشية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وقم بإجراء عملية الطرد المركزي مرة أخرى باستخدام دوار TI I 6 4 7 0.5 بسرعة 40,000 دورة في الدقيقة لمدة 50 minutes عند درجة حرارة 4 degrees Celsius، ثم أعد تعليق راسب الأغشية المغسول في 25 milliliters من محلول منظم تعليق الأغشية. بعد ذلك، قم بإذابة بروتينات الغشاء من الأغشية المعاد تعليقها في حوالي 25 milliliters.

أضف ستة ملليلتر من 10%DDM بحيث يكون التركيز النهائي للمنظف 2%DDM، ثم قم بهز الخليط عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد فترة الحضانة التي استمرت لساعتين في وجود DDM، قم بطرد الخليط مركزيًا بسرعة 40,000 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية باستخدام الدوار TI I 6 4 7 0.5، وذلك لفصل معقدات البروتين المنحلة مع المنظف عن البروتينات غير المنحلة. احتفظ بالطافي الذي يحتوي على معقدات بروتين Mex B والمنظف لاستخدامه في عملية التنقية. اخلط الطافي الذي يحتوي على معقدات بروتين Mex B والمنظف مع ملليلترين من خرزات تقارب الأيونات المعدنية التي تمت موازنتها في محلول Buffer Resus، ثم قم بالتحضين لمدة ساعة واحدة على أسطوانة دوارة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية بعد ارتباط البروتينات بالراتنج.

صُب الملاط في جسم عمود التدفق بالجاذبية وتخلص من السائل المتدفق. اغسل العمود بـ 20 milliliters أو ما يعادل 10 أحجام للعمود من منظم ربط وغسل iMac، وذلك عند اكتمال غسل العمود. استخلص البروتينات المرتبطة باستخدام 10 milliliters من منظم استخلاص iMac.

خذ عينات بحجم 10 µL من كل جزء من أجزاء الاستخلاص (elution fraction). اخلطها مع 10 µL من منظم عينة SDS بتركيز ضعفين، ثم قم بالتحليل باستخدام هلام SDS بولي أكريلاميد بتركيز 10%.

قم بتقدير كمية ونقاء بروتين mex B في كل جزء. اسحب الأجزاء التي تحتوي على معقدات بروتين Mex B مع المنظفات وقم بتركيزها باستخدام جهاز تركيز طرد مركزي (spin concentrator) عند درجة حرارة 4 °C. توخَّ الحذر لضمان عدم ترسب البروتين في هذه الخطوة.

استخدم عدة دورات طرد مركزي قصيرة وراقب حدوث الترسيب. بعد كل دورة، ابدأ بتنقية الكسور المجمعة باستخدام عمود ترشيح هلامي. قم بموازنة عمود super rose 12 HL 30 over 10 مسبقاً باستخدام 24 milliliters من محلول التخزين المنظم (running buffer) وانتظر حتى يستقر خط الأساس.

بعد ذلك، اشطف حلقة تحميل نظام التفعيل (actor system) باستخدام محلول منظم جاري. وقبل تطبيق البروتين على العمود، قم بترشيح محلول البروتين باستخدام مرشح حقنة. ثم حمّل ما يصل إلى 240 µL من محلول البروتين على العمود، بتركيز بروتيني يصل إلى 5 mg/mL.

قم بتمرير 1.5 حجم عمود من المحلول المنظم واجمع أجزاءً بحجم 0.25 milliliter. وتخرج معقدات بروتين XB المنظفة على شكل قمة عند حجم شطف يتراوح ما بين 10 إلى 15 milliliters. خذ عينات بحجم خمس microliter من أجزاء القمة.

اخلط كل عينة بنسبة واحد إلى واحد مع محلول SDS المنظم للعينات بتركيز ضعفين. قم بتحليل العينات باستخدام هلام البولي أكريلاميد بتركيز 10% لتقدير كمية ونقاوة Mex B في كل جزء، ثم اسحب الأجزاء التي تحتوي على ME B نقي. تم تحميل هلام البولي أكريلاميد هذا بالأجزاء التي تم سحبها من عمود iMac والأجزاء الفردية من عمود الترشيح الهلامي. بعد عمود الترشيح الهلامي، يظهر البروتين نقيًا على هلام البولي أكريلاميد المصبوغ بـ kumasi.

يُظهر تتبع لعمود الترشيح الهلامي الذروة الرئيسية لمعقد البروتين والمنظف وهو يخرج من العمود. يبلغ متوسط عائد بروتين mxb حوالي اثنين ملليغرام لكل ستة لترات من مستنبت XYT. بمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن إنجازه في ثماني ساعات إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية التعبير عن بروتين غشائي وإذابته وتنقيته.