تصنيع الأنسجة الصغيرة باستخدام وحدات من الخلايا التي تحتوي على الكولاجين جل

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أنسجة دقيقة تركيبية يمكن استخدامها في تجارب هندسة الأنسجة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق سحب محلول الكولاجين إلى أنبوب بولي إيثيلين باستخدام حقنة، ثم جعل الكولاجين يتجمد (يتحول إلى هلام). والخطوة الثانية هي قطع أنبوب البولي إيثيلين إلى أطوال تبلغ مليمترين لتشكيل وحدات الأنسجة الدقيقة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في فصل الوحدات عن الأنابيب، وأخيرًا، يتم طلاء الوحدات بالخلايا البطانية. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام الأنسجة الدقيقة الناتجة في المقايسات الخلوية في المختبر (in vitro) لدراسة التفاعل بين الخلايا عبر غرفة مائعية دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن زرع الأنسجة الدقيقة لتوليد أنسجة تهدف إلى دراسة التفاعل وإعادة تشكيل الأنسجة الدقيقة في الجسم الحي (in vivo).

مرحباً، اسمي بريندان لونج من مختبر سيبان هنا في جامعة تورنتو. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية في إنشاء بدائل أنسجة ثلاثية الأبعاد كبيرة في نقص التوعية الدموية السريعة بعد الزرع. في هذا الفيديو، سنوضح لكم كيفية إنشاء أنسجة نمطية مغطاة بخلايا بطانية للمساعدة في التغلب على هذا القصور.

سيقوم تشامبرلين، وهو زميل ما بعد الدكتوراه من مختبر سيبتين، بتوضيح الإجراء. ستعتمد كمية الكولاجين المراد تحييدها على طول أنبوب البولي إيثيلين. في هذا العرض التوضيحي، سنستخدم أنبوب بولي إيثيلين بطول مترين، بقطر داخلي يبلغ 0.76 millimeter وقطر خارجي يبلغ 1.22 millimeter.

لتجهيز الأنابيب، أدخل إبرة مقاس 20 G في أحد طرفي الأنبوب، ثم ضع الأنبوب في كيس تعقيم ذاتي الالتئام لتحويله لغرض التعقيم بالغاز. وبما أن 1 mL من الكولاجين يملأ حوالي مترين من أنابيب البولي إيثيلين، سنقوم بمعادلة 1 mL من الكولاجين. ضع الكولاجين في أنبوب مخروطي سعة 15 mL واحتفظ بالأنبوب على الثلج.

أضف 128 µL من 10 x alpha-MEM لكل ملليلتر من الكولاجين إلى الأنبوب، ثم اخلط المحلول عن طريق السحب والضخ المتكرر باستخدام الماصة. مع الحرص على تقليل تكوّن الفقاعات، يجب أن يتحول لون المحلول إلى الأصفر عند خلط alpha-MEM مع الكولاجين المحمض. بعد ذلك، قم بمعادلة الكولاجين بإضافة بيكربونات الصوديوم بتركيز 0.8 M. وللحصول على تقدير عام للـ pH، أضف بيكربونات الصوديوم حتى يتحول لون محلول الكولاجين الأصفر إلى اللون الوردي الفاتح.

يتطلب الأمر عادةً ما بين 30 إلى 60 µL لكل ملليلتر من الكولاجين للوصول إلى pH 7.4. ولمنع الكولاجين المعاد تعادله من التجلط، يُحفظ على الثلج حتى يحين وقت استخدامه. لبدء إجراء تجليط الكولاجين، يتم نقل الكيس الذي يحتوي على أنابيب البولي إيثيلين المعقمة إلى كابينة السلامة البيولوجية، ثم يُقص الطرف المغلق من الكيس مع إبقاء الأنابيب بداخله.

استخدم ملقطاً معقماً لتوصيل حقنة سعة 3 mL بالإبرة ذات القياس 20 gauge التي تم إدخالها مسبقاً في أحد طرفي الأنبوب. أدخل الطرف الآخر من الأنبوب في الكولاجين المُعادل حتى تصل النهاية إلى قاع الأنبوب المخروطي، والذي يجب حفظه على الثلج. يجب تنفيذ هذه الخطوة التالية ببطء، وإلا ستتسبب في إدخال فقاعات هوائية إلى الكولاجين.

اسحب مكبس المحقنة ببطء لسحب الكولاجين إلى أنبوب البولي إيثيلين. وعندما يتم سحب الكولاجين عبر الأنبوب، اسحب الإبرة ذات القياس 20 gauge وأعد كلا طرفي الأنبوب إلى الكيس. بعد إغلاق الكيس بإحكام باستخدام الشريط اللاصق، يتم التحضين عند 37 درجة Celsius لمدة 60 دقيقة.

سيتم استخدام جهاز قطع مجمع مسبقاً لقطع الأنابيب. لبدء هذا الإجراء، ضع الأنابيب في صينية معقمة أمام جهاز القطع، ثم قم بتحميل الأنابيب في جهاز القطع عند مخرج الجهاز، وجهز أنبوباً مخروطياً سعة 50 milliliter يحتوي على 25 milliliters من وسط زراعة الخلايا البطانية. ولجمع الوحدات المقطوعة، اضبط جهاز القطع لقطع الأنابيب بأطوال تبلغ 2 millimeter، ثم ابدأ بقطع الأنابيب.

يتم تحضين الوحدات المقطوعة في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter عند درجة حرارة 37 °C لمدة 60 دقيقة. ولإزالة وحدات الكولاجين من الأنابيب، يتم رج الأنبوب المخروطي سعة 50 liter الذي يحتوي على الوحدات باستخدام جهاز vortex بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوانٍ، ثم تُترك الوحدة لتترسب في قاع الأنبوب، وهي عملية تستغرق حوالي خمس دقائق.

ستتشكل كتلة مفككة من الوحدات في قاع الأنبوب، بينما ستشكل الأنابيب طبقة فوق الوسط. بعد استقرار الوحدات، استخدم ماصة سيرولوجية ذات فوهة واسعة سعة 10 milliliter لنقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. قم برج الأنبوب المخروطي سعة 15 milliliter باستخدام جهاز الـ Vortex، ثم اترك الوحدات لتستقر مرتين إضافيتين.

تُنقل الوحدات المستقرة من الدوامة الثانية والثالثة أيضاً إلى أنبوب سعة 15 ميليلتر. بعد إزالة جميع الوحدات من الأنابيب وتجميعها، يتم استكمال حجم الوسط في الأنبوب ليصل إلى خمسة ميليلتر. أصبحت الوحدات الآن جاهزة للطلاء بالخلايا البطانية، وهو ما سيتم عرضه تالياً لتحضير الخلايا البطانية لطلاء الوحدات.

أولاً، قم بإزالة الوسط الغذائي من الخلايا واغسلها باستخدام PBS. بعد إزالة PBS، أضف ثلاثة ملليلتر من trypsin EDTA واحضنها لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الخلايا في سبعة ملليلتر من الوسط الغذائي وانقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر.

قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، حيث ستحتاج إلى 5 × 10⁶ من الخلايا البطانية لكل ملليلتر من الوحدات المكدسة في قاع الأنبوب المخروطي. قم بترسيب الخلايا عند 300 G لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة في 5 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا البطانية.

أضف الآن خمسة مليلترات من الوسط الذي يحتوي على الخلايا البطانية إلى الوحدات. تُحضن الوحدات مع الخلايا البطانية، بنظامين: السكون والحركة؛ فبالنسبة للتحضين الساكن، تُخلط الوحدات مع الخلايا البطانية عن طريق القلب، ثم توضع الأنبوبة في وضع عمودي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، اقلب الأنبوبة مرة أخرى وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إضافية.

لتحضين الوحدات مع الخلايا البطانية ديناميكياً، قم برج أنبوب الـ 15 milliliter بلطف عند درجة حرارة 37 °C لمدة 60 دقيقة. وبمجرد اكتمال التحضين مع الخلايا البطانية، انقل الوحدات إلى طبق غير معالج لزراعة الأنسجة وحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C. وفي اليوم التالي، ضع الوحدات في طبق جديد غير معالج لزراعة الأنسجة مع وسط غذائي جديد لإزالة الخلايا البطانية غير الملتصقة. حضن الوحدات المغطاة بالخلايا البطانية عند درجة حرارة 37 °C حتى تغطي الخلايا 100% من سطح الوحدات.

تستغرق هذه العملية عادةً حوالي سبعة أيام. ستظهر الوحدات بشكل أسطواني عند إخراجها من الأنبوب لأول مرة. وإذا كانت مغلفة بالخلايا البطانية، فقد تتقلص بنسبة تصل إلى 50% من حجمها وتتخذ شكلاً بيضاوياً، كما تصبح أكثر كثافة وعتمة عند فحصها بالمجهر الضوئي.

في هذه الصور، يُشار إلى قطر وطول الوحدات بـ d و l على التوالي. وتوضح الصورة التالية خلايا Hep G two مدمجة وموزعة بشكل متجانس داخل الوحدات في وقت التصنيع. وقد احتفظت الخلايا بحيوية عالية كما يتضح من اللون الأخضر للخلايا الحية.

ستظهر الخلايا الميتة باللون الأحمر عندما تكون الخلايا البطانية متلاصقة. وعلى سطح الوحدات، يتشكل روابط محكمة، والتي يمكن رؤيتها عن طريق التألق المناعي. وقد أظهر تحليل انتقال الكتلة لصبغة VE cadherin أن الوحدات قادرة على دعم كثافات خلوية عالية دون تكوين لب نخرِي بسبب عدم كفاية نقل الأكسجين، وهو أمر غالباً ما يمثل مشكلة في الأنسجة الأكبر حجماً.

في هذا المثال، يُظهر صبغ تريكرو (Tri chrome) لكتل من النماذج الصغيرة النموذجية أن هذه النماذج احتفظت بتوزيع منتظم وعالٍ من الخلايا الحية بعد سبعة أيام من التصنيع. وفي المقابل، تشكل عدد كبير من الخلايا الميتة داخل قلب النماذج الكبيرة، مما ترك فقط حافة رقيقة من الخلايا الحية. كما تم إنتاج نماذج باستخدام مزيج من الكولاجين وبوليمر دقيق أو تحتوي على كرات مجهرية مفرزة للدواء.

هنا، عندما يتم وضع خلايا h hm EC على وحدات كولاجين بالين، تحتفظ الوحدات بشكلها الأسطواني وتكون خصائص التصاق الخلايا محدودة مقارنةً بالوحدات المكونة من الكولاجين فقط. تظهر هنا صورة مجهر ضوئي لوحدة كولاجين تحتوي على كرات مجهرية قابلة للتحلل الحيوي قائمة على PLGA. وقد ثبت أن العديد من المقايسات المخبرية متوافقة مع هذه الوحدات.

على سبيل المثال، في مقايسة تكوين الأوعية الدموية، يمكن بسهولة رصد وقياس التكوينات الشبيهة بالشعيرات الدموية على وحدة مستقرة فيها خلايا بطانية بعد خمسة أيام من الحضانة مع خلايا جذعية مشتقة من الأنسجة الدهنية. وفي مثال آخر، تظهر صور المجهر البؤري لـ "مقايسة الخلايا الحية والميتة" على الوحدات الخلايا الحية مصبوغة باللون الأخضر والخلايا الميتة مصبوغة باللون الأحمر. وأخيراً، استُخدمت الوحدات أيضاً في غرف الموائع الدقيقة وزُرعت في الفئران والجرذان لدراسة التفاعل بين أنواع الخلايا المختلفة وكيفية إعادة تشكيل الأنسجة الدقيقة بواسطة استجابة المضيف.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استزراع الوحدات في طبق بتري أو أوعية أخرى مثل المفاعل الحيوي أو جهاز ميكروفلويديك. كما يمكن تطويع هذه الطريقة لإنشاء أنسجة مختلفة باستخدام مجموعات متنوعة من أنواع الخلايا أو استخدام أنابيب ذات أقطار مختلفة. شكراً للمشاهدة.