إعداد مستمنع ماوس النخامية للتحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبي

يتميز التهاب النخامية المناعي الذاتي بتضخم الغدة النخامية ونقص في واحد أو أكثر من هرمونات الغدة النخامية. ولا تزال المستضدات الذاتية المسببة لهذا المرض غير معروفة. يتم هنا عرض بروتوكول لتحضير بروتينات الغدة النخامية للفئران لاستخدامها في دراسة هذا المرض.

أولاً، يتم عزل الغدد النخامية من الفئران التي تم قتلها رحيماً. ثم يتم تجنيس الغدد النخامية لتمزيق الخلايا ميكانيكياً وتحرير البروتينات السيتوسولية. يتم تصفية المتجانس عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة، وتقييم كميته باستخدام مقايسة BCA اللونية، وتقييم جودته عن طريق الفصل الكهربائي بهلام بولي أكريلاميد.

أخيرًا، يتم خلط متجانس البروتين المائي مع مادة مضافة زيتية. ثم يُحقن هذا الخليط في الفئران لإنشاء نموذج فأري يشبه التهاب النخامية المناعي الذاتي. وكما هو موضح في الفيديو المصاحب، تم وصف أربع تقنيات لتحفيز التهاب النخامية في الحيوانات التجريبية.

تعتبر التقنية المعروضة في هذا المقال، والمتمثلة في حقن مزيج من بروتينات الغدة النخامية كعامل مساعد للإنفلونزا، هي الأقدم حيث يعود تاريخها إلى الستينيات. وشملت المقاربات الأخرى حقن البروتينات السكرية الذائبة من فيروس الحصبة الألمانية في عام 1992، والحقن بالتوجيه التجسيمي لفيروس غدي مباشرة في الغدة النخامية في عام 2002، وزراعة الغدة النخامية من سلالة جرذان تحت كبسولة الكلى لسلالة أخرى من الجرذان في عام 2010. وتكمن الميزة الرئيسية لمنهج العامل المساعد الخاص بـ Florence في أنه أقل بضعاً في الوقت الحاضر، وأكثر اتساقاً، وقبل كل شيء، أكثر دقة في تحفيز مرض يشبه إلى حد كبير نظيره البشري.

على الرغم من الإبلاغ عنها منذ ستينيات القرن الماضي، إلا أن تقنية المساعد الأجنبي كانت ضعيفة الأداء في تحفيز التهاب النخامية. عندما بدأت عملي في مرحلة الدكتوراه، تمكنت فقط من الحصول على حالات التهاب نخامية محدودة وبدرجة شدة متواضعة باستخدام بروتوكول المساعد الأجنبي المنشور. وتحسنت الأمور بشكل ملحوظ عندما خطرت لي فكرة زيادة كمية بروتينات النخامية الموجودة في مستحلب EM بمقدار عشرة أضعاف.

على الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن توفر رؤى حول مسببات التهاب النخامية المناعي الذاتي، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لدراسة أمراض مناعية ذاتية أخرى لا تزال المستضدات الذاتية المسببة لها غير محددة. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطرق صعوبة أساسية في الخطوة الأخيرة، وهي تحضير الهامش، لأنها تتطلب مهارات يدوية ووقتاً وتفانياً. لذا، فإن العرض المرئي أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية تحضير المستحلب بشكل صحيح.

تمتد تداعيات هذه التقنية إلى ما هو أبعد من مجال المناعة الذاتية. إذ يمكن أيضاً استخدام معرفة كيفية تحضير المستضد للتحصين في إنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو في اختبار اللقاحات الجديدة. سيقوم S Zoo heroic Ura و Mayland al gato من مختبري بشرح هذه التقنية.

الغدة النخامية للفأر هي غدة أسطوانية الشكل تقع في قاعدة الجمجمة ضمن منخفض في العظم الوتدي يسمى السرج التركي. تحاط الغدة جانبياً بالأعصاب ثلاثية التوائم وأمامياً بالتصالب البصري. وتتكون من فص أمامي أكبر، وفصوص وسطى وخلفية أصغر حجماً.

لعزل الغدة النخامية، استخدم مقصاً لقطع رأس الفأر الذي تم قتله رحيمًا، ثم قم بإجراء شقوق متوازية من الجزء الخلفي إلى الجزء الأمامي من الجمجمة. ارفع الدماغ واقلبه للخلف للكشف عن الغدة النخامية، والتي تظهر على شكل أسطوانة ضمن سياق مثلث متساوي الساقين، حيث تمثل الغدة النخامية القاعدة، والأعصاب الثلاثي التوأم الجانبين، والتصالب البصري الرأس.

قم بتحديد الغدة عن طريق تدوير طرفي ملقط مغلق لتمزيق السحايا المحيطة بها. بعد ذلك، وباستخدام ملقط دقيق، اسحب الغدة النخامية من السرج التركي (sella turcica) وضعها في أنبوب بلاستيكي فوق الثلج الجاف. اجمع 300 غدة نخامية من الفئران لكل تحضيرة واحدة.

يتطلب هذا الجمع ما يقرب من تسع ساعات عمل لشخص واحد. بمجرد اكتمال عملية الجمع، تُخزن الغدد النخامية عند درجة حرارة 80- °C حتى وقت الحاجة إليها. ضع أنبوب Falcon سعة 15 mL في حمام ثلجي.

أضف 250 µL من محلول التجانُس المنظم إلى الأنبوب. لكل 100 غدة نخامية تم جمعها قبيل عملية التجانس، أضف الغدد النخامية للفأر إلى المحلول المنظم. بعد ذلك، ضع طرف مجانس polytron، وهو مولد بقطر 5 mm، في قاع أنبوب Falcon الذي يحتوي على الغدد النخامية للفأر والمحلول المنظم، ثم قم بالتجانس بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية.

حرك الأنبوب بلطف للأعلى والأسفل مع إبقائه على الثلج. بعد ذلك، اترك المتجانس على الثلج لمدة دقيقة واحدة. كرر خطوات التجنيس والتبريد مرتين إضافيتين.

يجب أن تؤدي هذه العملية اللطيفة من التجانس إلى تحطيم الخلايا وتحرير البروتينات دون تكسير النوى. يتم إجراء الطرد المركزي للمجانس بسرعة منخفضة، حوالي 1000 G لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لترسيب النوى، والأنسجة غير المتحللة، والمواد غير القابلة للذوبان مثل النسيج الضام ومعقدات البروتين المتحللة، مع الحرص على عدم تعكير الراسب.

انقل السائل فوق النووي (SNA)، والذي يسمى الآن الحالة ما بعد النووية (PNS)، إلى أنبوب Falcon جديد للتخزين. مع وضع الـ PNS على الثلج، أعد تعليق الراسب باستخدام نفس الحجم من محلول التجانُس المستخدم سابقاً، ثم قم بالتجانُس والطرد المركزي كما في الخطوات السابقة. بعد تجميع عينتي الـ PNS، وزع المحلول في عدة أنابيب طرد مركزي دقيقة.

تُحفظ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت استخدامها. هذا التحضير البروتيني مستقر عند درجة حرارة -80 °C، إلا أنه يفقد فاعليته تدريجياً؛ لذا، يُوصى باستخدامه في غضون ستة أشهر من تاريخ التحضير.

احتفظ بجزء صغير من الـ PNS لتحديد كمية البروتين وتركيزه باستخدام مقايسة حمض البيوريك. ثم حدد جودة البروتين عن طريق الفصل الكهربائي للهلام من 300 غدة نخامية للفئران، والتي يبلغ متوسط وزنها الإجمالي حوالي 570 milligrams. توقع الحصول على عائد قدره 60 milligrams من بروتينات الغدة النخامية أو 1 milligram من البروتين لكل 10 milligrams من النسيج.

عادةً ما يكون تركيز البروتين حوالي 40 mg/mL. المثال الموضح هنا مخصص لتحصين 10 فئران. يتم التخطيط لحقن كل فأر بـ 100 µL من المستحلب الذي يحتوي على 1 mg من بروتين النخامية، ومع السماح بفأرين إضافيين لتعويض الفاقد من المواد أثناء التحضير، يتم تحضير 12 mg من مستحلب البروتين.

ابدأ بإذابة حصص البروتين المجمدة سريعاً عن طريق تدفئتها بين يديك. اضبط تركيز البروتين ليصبح 20 mg/mL باستخدام PBS. بعد ذلك، اسحب 600 µL من مستخلص بروتين الغدة النخامية بما يعادل 12 mg باستخدام حقنة Gas Tite Hamilton سعة 2.5 mL، ثم أعد تعليقها في المادة المساعدة الكاملة FRONS أو CFA التي تحتوي على 5 mg/mL من mycobacterium tuberculosis المقتولة حرارياً عن طريق الرج يدوياً.

بعد ذلك، اسحب 600 µL من CFA إلى محقنة Hamilton أخرى سعة 2.5 mL. قم بتركيب وتثبيت إبرة استحلاب دقيقة عيار 22 في المحقنة المملوءة بـ CFA. اضغط المكبس ببطء بحيث تمتلئ الإبرة بـ CFA.

ثم قم بتوصيل وتثبيت الطرف الآخر من الإبرة بالسرنجة الأخرى المملوءة بمستخلص بروتين الغدة النخامية. تجنب حبس فقاعات الهواء داخل السرنجات. ادفع مكبس سرنجة CFA ببطء لدفع المكون الزيتي إلى مستخلص الغدة النخامية المائي بحيث يتم خلط كمية صغيرة فقط.

بعد ذلك، ادفع مكبس محقنة مستخلص الغدة النخامية إلى داخل محقنة CFA. كرر هذه العملية لزيادة كمية المواد المخلوطة تدريجياً حتى يتم خلط المحتويات بالكامل. تمثل هذه المادة البيضاء والموزعة بالتساوي مستحلب الماء والزيت.

بمجرد تكوّن المستحلب، كرر دورة الدفع والسحب الكاملة 500 مرة على الأقل؛ بعد الدورة النهائية، ستحتوي المحاقن على مستحلب من الماء والزيت بنسبة واحد إلى واحد، حيث يصبح تركيز بروتين الغدة النخامية الآن 10 mg/mL. يصبح المستحلب جاهزاً للاستخدام. لاختبار جودة المستحلب، ضع قطرة منه في دورق يحتوي على الماء؛ فإذا تم تحضير المستحلب بشكل صحيح، ستظل القطرة متماسكة ومترابطة على السطح.

إذا كانت جودة المستحلب رديئة، فإنه سينتشر وينقسم إلى قطرات أصغر. يُحقن المستحلب في نفس يوم تحضيره في فئران SJL لتحفيز التهاب النخامية المناعي الذاتي التجريبي. هذا البروتوكول مفصل في فيديو jo of vertical المصاحب.

بمجرد جمع الغدة النخامية وإتقان التقنيات، يمكن إجراء استخلاص البروتين في غضون ساعة واحدة، مع التذكر بضرورة العمل بسرعة وعلى الثلج. خلال هذه الخطوة، يستغرق تحضير المحلول حوالي ساعة واحدة. تذكر أن تعمل ببطء وصبر في مرحلة الخلط الأولية بعد تحضيره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الذاتية لاستكشاف الآليات التي تتعرف من خلالها الخلايا اللمفاوية ذات التفاعل المناعي الذاتي على العضو المستهدف وتخترقه. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مستخلص بروتيني من الغدة النخامية للفأر وكيفية خلطه مع مستحلب كروهن المساعد (Crohn's adjuvants) لتحضير مستحلب جاهز للاستخدام كمستضد. لا تنسَ أن العمل بالسرنجات ومستحلبات كروهن الكاملة، التي تحتوي على بكتيريا متفطرة سلية (microbacterial tuberculosis) خاملة ومجففة، قد يكون خطيراً في حال وخزت نفسك عن طريق الخطأ.

لذا، استخدم دائمًا القفازات وتخلص من الإبر بشكل صحيح أثناء تنفيذ هذا الإجراء.