الحفاظ على الولبخية في الخلية خالية متوسطة

اسمي كورتني ستون. أعمل في كلية بلومبرج للصحة العامة بجامعة جونز هوبكنز في مختبر الدكتور جيسون راسكون. سنقوم اليوم بتنقية البكتيريا من خلايا حشرية مستزرعة.

إنها في الواقع إجراء بسيط للغاية. نبدأ بحصد الخلايا، ثم نقوم بتفكيك أغشية خلايا العائل حقيقية النواة ميكانيكيًا باستخدام التحلل بالخرز الزجاجي. وبعد ذلك، نستخدم الطرد المركزي التفاضلي لفصل البكتيريا عن حطام خلايا العائل.

وبعد ذلك، نستخدم سلسلة من خطوات الترشيح لإزالة المزيد من جزيئات الخلايا المضيفة، بحيث يتبقى لنا في النهاية الراسب البكتيري المنقى فقط. وهذا في الواقع أحد المتطلبات الرئيسية. هذه خزانة تدفق صفائحي لزراعة الخلايا، وتُستخدم للحفاظ على تعقيم كل شيء لأن زراعة الخلايا عرضة للتلوث بسهولة شديدة.

نحتاج أيضاً إلى أوساط زراعة خلوية، والخلايا نفسها، والتي نقوم بتنميتها في دوارق بلاستيكية. كما نحتاج إلى خرز تكسير بقطر 3 mm، وأنابيب مخروطية سعة 50 ml، وجهاز طرد مركزي قادر على إجراء طرد مركزي عالي السرعة، بنحو 18,000 G لترسيب البكتيريا، وأيضاً قادر على الدوران بسرعة 3000 G أو 2,500 G لترسيب الخلايا المضيفة. لذا، فإن أول خطوة سنقوم بها هي البدء بخلايانا المستزرعة.

لقد تم استنباتها، أليس كذلك؟ هذه دوارق T 75، وهي تحتوي على 15 mls من الوسط الزرعي بالإضافة إلى خلايانا.

لذا، فإن أول شيء سنقوم به هو البدء بتفكيك طبقة الخلايا وجمعها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ml. وكل ما عليك فعله هو تقريباً سحب وكشط طبقة الخلايا للأعلى وللأسفل، مما يؤدي إلى إزاحة جميع الخلايا في الوسط الغذائي. وبمجرد وجود الخلايا في الوسط، نقوم ببساطة بنقلها باستخدام الماصة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ml.

الآن، سنضيف إلى معلّقتي الخلايا خرزات زجاجية بحجم 3 mm. وقد تم تعقيم هذه الخرزات بالبخار (autoclaved) ويمكن في الواقع إعادة استخدامها؛ حيث يمكن غسلها ونقعها في مبيض الكلور، ثم تعقيمها بالبخار مرة أخرى قبل استخدامها مجدداً.

قم بالصب مع الحرص على عدم ملامسة فوهة الوعاء الزجاجي B لفوهة أنبوب الطرد المركزي. ونضع كمية من الخرز الزجاجي تعادل تقريباً علامة حجم 5 mL في كل أنبوب طرد مركزي. الخطوة التالية التي سنقوم بها هي التفكيك الفيزيائي لخلايا eary لتحرير البكتيريا في المعلق.

لذا نستخدم جهاز الرج الميكانيكي (vortex)، ونضبطه على أعلى درجة من درجات الاهتزاز، ثم نقوم بالرج لمدة خمس دقائق. وبذلك، نقوم برج الخلايا باستخدام خرزات زجاجية بحجم 3 mm لمدة خمس دقائق، ثم نسحب الطافي باستخدام ماصة نظيفة وننقله إلى أنبوب طرد مركزي معقم ونظيف سعة 50 mL. سنقوم بتجميع المعلق الذي تم إنشاؤه حديثاً، ويتكون هذا المعلق من البكتيريا المتحررة والمحلول بالإضافة إلى حطام الخلايا الكاملة.

تتمثل الخطوة التالية في إجراء عملية طرد مركزي بسرعة منخفضة لترسيب المواد الخلوية الكلية وإبقاء البكتيريا عالقة في السائل. سنستخدم جهاز الطرد المركزي عند 2,500 ×g لمدة 10 دقائق. كما سنقوم بعملية الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C للمساعدة في تجميع الراسب في القاع.

وبذلك نقوم بوضعه هنا، ونتأكد من اتزانه، ثم نغلقه، ونقوم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق. لقد قمت الآن بإجراء الطرد المركزي للسائل الطافي الذي يحتوي على حطام الخلايا المضيفة بالإضافة إلى البكتيريا المنقاة. وقد تم ذلك عند 2,500 G لمدة 10 دقائق.

وكما ترون، لدي راسب في قاع الأنبوب يتكون من حطام الخلايا. لا تزال البكتيريا التي تم تحريرها حديثاً موجودة في الطافي لأن قوة الطرد المركزي لم تكن كافية لترسيبها أيضاً. لذا، فإن الخطوة التالية التي سأقوم بها هي إزالة الطافي وترشيحه عبر مرشح بمسامية 5 micron.

هذا مرشح بمسامية 5 micron وهو يتوافق مع أي نوع من المحاقن. سأستخدم محقنة سعة 30 ml، حيث يتم سحب المكبس للأعلى، ثم دون لمس المرشح، وتحديداً الجزء السفلي منه، لضمان بقائه معقماً، نقوم بتوصيل المحقنة بالمرشح عن طريق تدويرها لربطها، ثم نضغط المكبس بلطف ليمر الـ sup natan من خلاله وإلى الأنبوب الخاص بنا.

تجنب الضغط بقوة زائدة لأن ذلك قد يؤدي إلى كسر المرشح وبالتالي توقفه عن العمل. وإذا وصلت إلى مرحلة تضطر فيها إلى تطبيق ضغط كبير، فعليك إزالة المرشح واستبداله لأن ذلك يعني أنه مسدود بالكثير من حطام الخلايا. وفي هذه المرحلة، وبناءً على الحجم لدينا وكطريقة إضافية للحصول على مزرعة بكتيرية عالية النقاوة، نقوم عادةً بإضافة محلول سكروز بتركيز 250 millimolar معقم بالترشيح إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي عالي السرعة.

املأ الزجاجة بنسبة 80% على الأقل. وعادة ما نقوم بملئها وصولاً إلى العنق. يجب أن تكون هذه الأنابيب ممتلئة بهذا القدر حتى لا تنفجر داخلياً عند وضعها في جهاز الطرد المركزي عالي السرعة.

حسنًا، سنقوم الآن بطرد السائل الطافي مركزيًا للحصول على البكتيريا المنقاة عند 18,000 ×g في جهاز الطرد المركزي عالي السرعة هذا. لذا، نحرص على وضع الأنابيب بشكل متوازن بالطبع، ثم نغلقه. سنقوم بضبط الوقت لمدة 10 دقائق.

ونفضل القيام بذلك عند درجة حرارة 10 °C أو أقل، والتي تم ضبط درجة الحرارة لدينا عليها هنا. أما السرعة الزاوية لهذا الدوار المحدد في جهاز الطرد المركزي فهي 12.5 دورة في الدقيقة. لدينا مخطط تحويل، لذا سيدور الجهاز بسرعة تبلغ تقريبًا 18,670 ×g. الآن قد أجرينا عملية الطرد المركزي عالية السرعة لترسيب البكتيريا المنقاة لدينا.

كما تلاحظون الآن، لدينا راسب بكتيري جيد في قاع أنبوب الطرد المركزي عالي السرعة. لذا، سنقوم الآن بإزالة كل السائل الطافي ونقله إلى حاوية النفايات السائلة. ما نحتاج إلى القيام به في هذه المرحلة هو إعادة تعليق البكتيريا.

سأقوم بإعادة تعليقها في 2 mL من وسط الزرع الخاص بنا، وهو وسط شنايدر للحشرات (Schneider's insect medium)، المدعم بـ 10% من مصل جنين البقر المعطل حرارياً. وسأقوم ببساطة بإعادة تعليق الراسب عن طريق السحب والضخ بالمصاصة حتى تعود جميع البكتيريا إلى المحلول. والآن بعد أن عادت البكتيريا إلى حالة التعليق، سنقوم بخطوة تنقية إضافية للتخلص من أي بقايا محتملة للخلايا المضيفة.

لذا، سنستخدم في هذه الخطوة مرشحاً بحجم 2.7 micron. ما أفضل القيام به هو استخدام الغطاء البلاستيكي الخاص بمرشح الـ five micron كحامل. وبذلك، يمكننا سحب المحلول، ثم ربط المحقنة بالمرشح ذو الـ 2.7 micron، والآن سنقوم بالترشيح داخل أنبوب تخزين طويل الأمد.

تماماً كما في المرشح الآخر، تضغط على المكبس بلطف. وهكذا أصبح لدينا الآن محلول من البكتيريا المنقاة. والخطوة التالية التي سأوضحها لكم هي كيفية إجراء فحص الحيوية.

نستخدم مجموعة اختبار حيوية البكتيريا (backlight live dead bacterial viability kit) من شركة Molecular Probes. تتضمن هذه المجموعة صبغتين، وهما يوديد البروبيديوم (propidium iodide) وSyto 9. يفلور يوديد البروبيديوم باللون الأحمر، وهو يصبغ فقط البكتيريا التي لا يكون غشاؤها البكتيري سليمًا تمامًا، بينما يصبغ Syto 9 جميع البكتيريا.

لذا، عندما تنظر إلى هذه البكتيريا تحت المجهر المجهز ببصريات فلورية، ستتألق جميع البكتيريا باللون الأخضر، بينما تتألق مجموعة فرعية منها، وهي البكتيريا الميتة، باللون الأحمر. سنأخذ كمية صغيرة من عينتنا المنقاة، وفي هذه الحالة سآخذ 10 µL فقط، وهي كمية كافية لتحضير شريحة واحدة. وسأقوم بتوزيعها في أنبوبين آخرين.

ومن ثم سأضيف الصبغتين الأخريين، مجرد 1 µL من خليط propidium iodide و cyto nine إلى المعلق البكتيري. بعد ذلك، يمكنك ترك هذا المزيج ليحتضن في الظلام لمدة 15 دقيقة. ومع ذلك، فقد وجدنا أنه يمكنك المضي قدماً في تثبيته وفحصه فوراً تقريباً ورؤية نتائجك.

حسناً، سأقوم الآن بفحص الشريحة التي تحتوي على البكتيريا المصبوغة بصبغة الحياة والموت ذات الإضاءة الخلفية تحت المجهر. سأقوم بوضع الصبغة على الشريحة، ثم أضع غطاء الشريحة وأبدأ الفحص. سأستخدم المرشح المختلط الأحمر والأخضر لكي أتمكن من تقييم حيوية البكتيريا.

لذا، عندما أفتح الغالق، أرى البكتيريا، وهي تبدو مجرد نقاط صغيرة تقريباً. لكنني ألاحظ هنا أن ما يقرب من 90 إلى 95% من البكتيريا خضراء اللون، بينما هناك ما يقرب من 5% فقط حمراء اللون. وبناءً على ذلك، فإن لدينا معدل حيوية مرتفع جداً، أليس كذلك؟

لقد استعرضت معكم للتو عملية تنقية بكتيريا Akia الحية من خلايا حشرية مستنبتة. تضمن هذا البروتوكول التفكيك الفيزيائي للخلايا المضيفة حقيقية النواة، ثم استخدام الطرد المركزي التفاضلي لعزل البكتيريا المنقاة، بالإضافة إلى سلسلة من خطوات الترشيح لضمان جودة البكتيريا المنقاة وتنقيحها تمامًا من جميع مكونات الخلية المضيفة. وبعد ذلك، استعرضنا مقايسة الحيوية (live dead assay) باستخدام الإضاءة الخلفية، والتي تعتمد على صبغتين لتقييم حيوية البكتيريا لديكم.

ويمكنك الآن استخدام البكتيريا المنقاة في مجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك إصابة أنظمة خلوية مستنبتة أخرى لزيادة معدل إصابة نظام محدد. كما يمكنك أيضاً إجراء دراسات أيضية أو العديد من الدراسات الأخرى باستخدام البكتيريا الحية المنقاة.