الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد المعلومات القياسية والتركيبية لبروتين ما. في جميع مجمعات الرباط التي تعبر عن خلايا بيولوجية حية، يتم هندسة خلايا الخميرة وراثياً للتعبير عن البروتينات المستهدفة مرتبطة إما بمسبار فلوري مانح أو مستقبل. يمكن استثارة المسبارات المانحة مباشرة بواسطة الليزر.

بينما لا يمكن استثارة المستقبلات إلا من خلال نقل الطاقة من مانح مثار قريب، تـتعرض الخلايا للضوء المنبعث من ليزر الأشعة تحت الحمراء القريبة النبضي. ويتم فصل الفلورة المنبعثة من المسبارات إلى مكوناتها الطيفية بواسطة محزز حيود إرسالي، ثم تُسقط على سطح مصفوفة CCD مضاعفة للإلكترونات. وبناءً على ذلك، يتم الحصول على أطياف فلورية كاملة من كل رباط على حدة لكل موضع في العينة.

يعتمد المقطع الطيفي للفلورية المكتشفة على التفاعل المحدد للبروتينات قيد الدراسة. وتُحلل البيانات لتحديد الانبعاثات المنفصلة من مجسات المانح والمستقبل لكل بكسل صوري في خلية المسح. كما يتم تحديد كفاءة نقل الطاقة عند كل بكسل صوري، ثم يتم تصنيف البكسلات وفقًا لكفاءة FRET والمخطط التكراري الخاص بها.

تسمح تفسيرات المخطط التكراري بالتحديد الحي (in vivo) للبروتين وحجم المعقد وتشكيله. مرحباً، اسمي مايكل ستونمان من مجموعة ريكو البحثية في جامعة ويسكونسن ميلووكي. اسمي سينغ.

أنا من مختبر ريكوس في ميلووكي، ويسكونسين. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في الحصول على ملفات انبعاث كاملة من مئات المجمعات الرباطية كافة داخل الخلية من خلال مسح كامل واحد للخلية. وعادةً ما تتطلب معظم طرق المجهر الفلوري مسح الخلية المستهدفة عدة مرات لتجميع معلومات طيفية كافية من أجل تحديد كفاءة FRET في مناطق اهتمام مختلفة داخل الخلية.

ومع ذلك، قد تؤدي التفاعلات الكيميائية الحيوية الانتشارية إلى تغيير التركيب الجزيئي لهذه المناطق ذات الأهمية، وبالتالي الحد من المعلومات التي يتم الحصول عليها من مسح الصورة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في دراسة البروتين وتفاعلات البروتين في الخلايا الحية، مثل ما هو حجم الأوليغومرات الضارة؟ وفي أي مرحلة من دورة حياة البروتين تتشكل الأوليغومرات، وما هو دور أوليغومر هذا البروتين في الوظيفة الخلوية؟

يقوم المجهر الفوتوني ذو الدقة الطيفية بتجميع المعلومات الطيفية حول مجمعات olima في خلية الصورة من خلال مسح بؤرة شعاع الاستثارة عبر العينة المستهدفة في عدد من المواقع. وتُستخدم مجموعة من المرايا الماسحة المتعامدة لنقل بؤرة شعاع الليزر عبر العينة في اتجاهين مختلفين. يتم التحكم في حركة المرايا الماسحة بواسطة الكمبيوتر وتتم مزامنتها مع استخراج بيانات شدة الفلورة من كاميرا CCD؛ ومن خلال عمليات المسح الخطي، يمكن إعادة بناء خرائط مكانية لشدة الفلورة المقابلة لطول موجي معين من الضوء.

من أجل إعادة بناء خرائط توزيعات شدة الأشعة السينية الفلورية مكانياً بدقة وحساب الطول الموجي الفعلي المقابل لكل من هذه الخرائط، يجب معايرة بروتوكول المسح الخطي باستخدام محلول الفلوريسين. لبدء إجراء المعايرة، قم بضبط طيف الإثارة عند طول موجي قدره 800 nanometers، وهو ما يعادل ضعف أقصى طول موجي لإثارة الوسم المانح GFP 2. ولضبط طيف الإثارة، قم بتحريك المنشور الموجود داخل تجويف الليزر لتعديل تشتت سرعة المجموعة باستخدام البرنامج الحاسوبي المتصل بالكاميرا. أرسل أمراً إلى شريحة CCD لخفض درجة حرارة شريحة CCD إلى أدنى درجة حرارة يمكن الوصول إليها.

من أجل تقليل الضوضاء المظلمة، يتم سحب 10 µL من محلول الفلوريسين ووضعها على شريحة مجهرية، ثم تُغطى بغطاء الشريحة بحيث تتوزع طبقة رقيقة من العينة بشكل منتظم في المنطقة الواقعة بين غطاء الشريحة والشريحة المجهرية، وتوضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على سطح غطاء الشريحة. بعد ذلك، يتم تثبيت الشريحة المجهرية في منصة الإزاحة XY و Z، وإزاحة الشريحة والمنصة في اتجاه المحور البصري. ومن خلال ضبط المشغل الخطي يدويًا، يتم إزاحة الشريحة حتى يلامس عدسة المجهر الشيئية قطرة زيت الغمر، ثم يتم تحويل الكاميرا إلى وضع الفيديو لاكتساب البيانات بحيث يظهر الضوء الساقط على مصفوفة CCD على شاشة الكمبيوتر في الوقت الفعلي.

أطفئ جميع أضواء الغرفة المحيطة لتقليل الضوضاء الخلفية التي يتم رصدها في مصفوفة CCD. قم بضبط الميكرومتر الذي يتحكم في منصة النقل ببطء في اتجاه المحور البصري لجلب العينة إلى بقعة التركيز الخاصة بشعاع الليزر. عندما تصبح عينة الفلوريسين في بؤرة التركيز، سيظهر الانبعاث كخط حاد على مصفوفة CCD.

قم بتنزيل قراءات كثافة البكسلات من مصفوفة CCD إلى الكمبيوتر. قم بقياس كثافة البكسل كدالة في الموضع على مصفوفة CCD عن طريق فتح مصفوفة قيم الكثافة التي تم تنزيلها في برنامج Image J ورسم خط عبر المنطقة الفلورية. استخدم أمر image day.

قم بتحليل مخطط الملف الشخصي لإنشاء مخطط يوضح طيف الانبعاث لعينة الفلوريسين. اضبط معامل الزيادة للمرآة، الذي يتحكم في حركة الليزر. قم بالتركيز في اتجاه Y، بحيث تؤدي المواضع المتجاورة في اتجاه y داخل العينة إلى تحريك ذروة الأطياف الفلورية بمقدار بكسل واحد بالضبط على طول البعد الطيفي في مصفوفة CCD.

لمراقبة ذلك، قم بتنزيل شدة أطياف الفلوريسين لموضعي Y مختلفين في العينة. ثم افتح صور الشدة باستخدام برنامج Image J وحدد موضع ذروة البكسل لكل من الأطياف الفلورية. وباستخدام مؤشر Image J، ومع ترك غالق الـ CCD مفتوحاً، قم بمسح بؤرة الليزر عبر العينة في اتجاه X.

يجب أن يسقط الضوء المنبعث من كل فوكسل (voxel) على طول خط المسح على مصفوفة CCD في نهاية كل مسح خطي؛ يتم تخزين البيانات التي تم الحصول عليها من مصفوفة CCD لهذا المسح الخطي، ثم يتم مسح بكسلات مصفوفة CCD. حرك موضع الليزر. قم بالتركيز في اتجاه Y بالمقدار الذي تم تحديده مسبقاً.

بعد ذلك، قم بمسح شعاع الليزر في الاتجاه X عبر العينة. ومرة أخرى، اترك غالق الـ CCD مفتوحاً وقم بتخزين البيانات. كرر إجراء المسح الخطي هذا حتى يتم إضاءة منطقة مادية تزيد بنسبة 50% تقريباً عن أبعاد خلية بيولوجية واحدة بضوء الليزر.

يجب استخدام العلاقة بين رقم الصف لصورة مسح خطي معينة والطول الموجي لإعادة بناء الصور بهدف الحصول على خرائط وجهية متعددة لشدة الفلورة عند أطوال موجية مختلفة. وللحصول على صورة انبعاث فلوري لطول موجي معين، ابحث عن رقم الصف في الصورة التي تم الحصول عليها من المسح الخطي الأول والتي تقابل هذا الطول الموجي. بعد ذلك، يقابل الصف المجاور في صورة المسح الخطي التالية الصف التالي في صورة الانبعاث الفلوري.

بالنسبة لهذا المكدس الموجي المحدد، قم بتجميع كافة صفوف الصور التي تتوافق مع هذا الطول الموجي للحصول على الخرائط المكانية لشدة الفلورة XY للعينة عند ذلك الطول الموجي. كرر هذا الإجراء لجميع الأطوال الموجية الأخرى القابلة للقياس لجمع البيانات الخاصة بعيناتك. أولاً، أخرج من الحاضنة الأطباق التي تحتوي على مستعمرات الخميرة المحولة.

يجب أن يكون هناك ثلاثة أنواع على الأقل من الخلايا المحولة: خلايا تعبر عن البروتينات المستهدفة الموسومة بكلا النوعين من المجسات الفلورية، وخلايا تعبر فقط عن البروتينات الموسومة بمجسات الفلورية المانحة، وخلايا تعبر فقط عن البروتينات الموسومة بمجسات الفلورية المستقبلة.

أضف 100 µL من كلوريد البوتاسيوم بتركيز 100 mM إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. ثم باستخدام رأس ماصة دقيقة، اكشط من ثلاث إلى خمس مستعمرات خميرة من طبق الخلايا التي تعبر عن بروتينات موسومة بكل من المجسات الفلورية المانحة والمستقبلة، وقم بتلقيحها في كلوريد البوتاسيوم بتركيز 100 mM. ومن هذه الخلايا، اسحب 10 µL من معلق الخلايا وضعها على شريحة مجهرية جديدة.

قم بتغطية القطرة بشريحة غطاء، ثم ضع قطرة من الزيت على سطح شريحة الغطاء. بعد ذلك، أغلق الغالق يدوياً في مسار شعاع الليزر لمنع ضوء الليزر من الوصول إلى عدسة المجهر الشيئية. ثبّت شريحة المجهر على منصة الإزاحة XY و Z، وحرك منصة الشريحة في اتجاه المحور البصري حتى تلامس عدسة المجهر الشيئية قطرة زيت الغمر.

الآن قم بتشغيل إضاءة المجال الواسع وانتقل إلى الكاميرا. اختر وضع الفيديو لجمع البيانات. ستكون صورة المجال الواسع للعينة مشوشة للغاية بسبب وجود محزز النقل في مسار الانبعاث.

وبناءً على ذلك، ضع مرشح تمرير نطاق (band pass filter) ذا عرض كامل عند منتصف القيمة القصوى صغير في المسار الضوئي الذي يسبق محزز النقل. حرك منصة الإزاحة ببطء في اتجاه المحور الضوئي أثناء مراقبة صورة الخلايا على شاشة الكاميرا حتى تصبح الخلايا في بؤرة التركيز. ثم حرك المنصة في اتجاه X أو Y من أجل وضع خلية واحدة في موقع بؤرة شعاع الليزر.

أوقف تشغيل مصدر إضاءة المجال الواسع (widefield illumination) وأزل مرشح مسار النطاق من مسار الانبعاث. قم بفتح حجب شعاع الليزر لفترة قصيرة مع مراقبة الإشارة المستقبلة في مصفوفة CCD في آن واحد. إذا تم اكتشاف إشارة فلورية في مصفوفة CCD أثناء سقوط شعاع الليزر على الخلية، فقم بإجراء مسح كامل لاكتساب البيانات الفلورية لهذه الخلية.

من الضروري استخدام معاملات المسح نفسها، وتحديداً عدد الخطوط وزيادة Y كما تم تحديدها في إجراء المعايرة الموضح سابقاً. كرر عملية تحديد موقع الخلايا والحصول على بيانات الفلورة لعدد كبير من الخلايا التي تعبر عن بروتينات مرتبطة بكل من علامات المانح وعلامات المستقبل. بعد تجميع عدد كافٍ من صور الفلورة للخلايا التي تعبر عن بروتينات موسومة بكلا المستقبلين، كرر العملية بأكملها لكل من الخلايا التي تعبر فقط عن بروتينات موسومة بمجسات الفلورة المانحة والخلايا التي تعبر فقط عن بروتينات موسومة بمجسات الفلورة المستقبلة.

وأخيراً، أعد بناء جميع عمليات المسح للحصول على خرائط مكانية لكثافة الفلورة XY ذات دقة طيفية لكل مجموعة من البيانات باستخدام الإجراء الموصوف سابقاً؛ وتوضح هذه الأشكال الثلاثة الخرائط المكانية الناتجة التي تم حسابها من قياسات مجهرية ثنائية الفوتون ذات دقة طيفية أجريت على خلية خميرة تعبر عن مستقبل عامل ستيريل تو ألفا (sterile to alpha factor receptor). كما تم الحصول على خرائط ثنائية الأبعاد لإشارات المانح والمستقبل من خلال تحليل ملفات الانبعاث الطيفي التي تم الحصول عليها من كل موقع في الخلية.

يتم تعيين ألوان زائفة لشدات الفلورسنت وفقًا لقيمها، ويظهر المقياس كإطار داخلي. ثم تم حساب خريطة ثنائية الأبعاد لكفاءات FRET الظاهرية باستخدام صور KDA وKAD بالاعتماد على القيم المستخرجة من خريطة كفاءات FRET الظاهرية للخلية الموضحة للتو، كما تم إعداد مخطط توزيع تكراري. وتم تمثيل قيم EAPP المقاسة للخلية بواسطة دوائر.

يمثل الخط الأحمر المتصل أفضل مطابقة للبيانات المقاسة باستخدام مجموع وظائف الكالسيوم الفردية الممثلة بخطوط خضراء متصلة. ويؤكد تحليل المخطط التكراري، الموصوف في نص البروتوكول، أن معقد الربيطة لمستقبل عامل ألفا الثنائي العقيم يتخذ شكل رباعي القسيمات (tetramer) على شكل RBA في الجسم الحي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 12 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء إجراء هذه التجربة، من المهم الحفاظ على قدرة مصدر الإثارة منخفضة. ومن الضروري تجنب الإثارة المتعددة للمانح بواسطة نبضة واحدة.