السلوكي الصيدلة في الإشراط الكلاسيكي للاستجابة ملحق خرطوم في نحل العسل ( أبيس mellifera)

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعلم وتكوين الذاكرة. في نحل العسل، تتمثل الخطوة الأولى في جمع النحل الطائر بحرية من خليته. بعد ذلك، يتم تثبيت النحل في أنابيب بلاستيكية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إجراء الإشراط الكلاسيكي. ويمكن حقن الأدوية في نقاط زمنية محددة حول عملية الإشراط لدراسة تأثيرها على التعلم وتكوين الذاكرة. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي اختبار استبقاء الذاكرة.

وفي نهاية المطاف، قد تكشف التغيرات في السلوك بعد العلاج الدوائي عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعلم وتكوين الذاكرة في نحل العسل. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التعلم والذاكرة من خلال الكشف عن الآليات الجزيئية لتكوين الذاكرة.

بشكل عام، سيواجه الباحثون الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن توقيت تقديم المحفزات أثناء عملية الإشراط واسترجاع الذاكرة يجب أن يكون دقيقاً. كما أن نظام التغذية أمر بالغ الأهمية. سيتم استعراض الإجراء بواسطة cutting gearing وJohannes faberg لطلاب الدراسات العليا في مختبري. في اليوم الذي يسبق التجربة، يتم جمع النحل بين الساعة 2:00 و4:00 مساءً باستخدام هرم من البلكسي جلاس المنفذ للأشعة فوق البنفسجية UV.

بمجرد العودة إلى المختبر، ضع الهرم على قاعدته وقم بتغطية الجدران بمنشفة مع ترك القمة مكشوفة. افتح القمة وأمسك بقارورة زجاجية فوق الفتحة، مع السماح لنحلة واحدة بالانتقال إلى القارورة قبل إغلاقها مرة أخرى. استمر في هذا الإجراء حتى يتم نقل جميع النحل إلى قارورة زجاجية في فصلي الخريف والشتاء.

عندما لا تطير النحل في الخارج، يتم الاحتفاظ بخلية النحل داخل دفيئة زراعية في شبكة، ويتم صيد النحل الفردي مباشرة من الشبكة. باستخدام قارورة زجاجية واحدة لكل نحلة، قم بتثبيت النحلة عن طريق تبريد القارورة على الثلج لمدة تتراوح من دقيقتين ونصف إلى ثلاث دقائق ونصف. راقب النحلة بعناية وقم بإخراجها من الثلج بمجرد توقفها عن الحركة.

ثبّت النحلة غير المتحركة في أنبوب بلاستيكي صغير باستخدام شريط لاصق. تأكد من أن النحلة قادرة على تحريك بطنها بحرية، ولكن ليس رأسها أو صدرها أو أرجلها. ومن المهم أيضاً عدم الضغط على منطقة الرقبة.

بمجرد تجهيز النحلة، ضع الأنبوب في ثقب مرقم على الحامل، وذلك لتسهيل المناولة والتعريف.

تُعاد الأنابيب دائمًا إلى نفس ثقب الحفر. بعد المناولة، يتم تغذية النحل بين الساعة الرابعة والساعة 6:00 مساءً في موقع منفصل عن موقع التهيئة. يتم استحثاث استجابة تمدد الخرطوم أو PER عن طريق لمس النحل وقرون الاستشعار.

باستخدام محلول سكروز، اسمح للنحلة باستهلاك قطرة واحدة تبلغ حوالي 4 µL من محلول SRAs. تأكد من عدم تلطيخ قرون استشعار النحلة، أو أجزاء ما قبل الصدر (pro bois)، أو الأنبوب البلاستيكي. قم بتغذية كل نحلة حتى تتوقف عن ذلك.

أظهر استجابة انعكاسية (PER) سريعة وموثوقة عند ملامسة قرون الاستشعار للمحلول. وفي الأمسيات التالية من التجربة، قم بتغذية كل نحلة أربع مرات بقطرة واحدة من محلول السكروز. املأ وعاءً بلاستيكيًا بارتفاع يتراوح تقريبًا بين 0.5 إلى 1 cm من ماء الصنبور.

ضع رف النحل المقيد في الوعاء باستخدام أطباق ليزا (lysa plates) كمنصة. غطِّ الوعاء بقطعة من الورق المقوى واحفظه في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. يخضع النحل للتكييف الشمي في حوالي الساعة 10:00 صباحاً في اليوم التالي لعملية الجمع.

قبل 30 دقيقة من بدء التجربة، ضع حامل النحل المربوط بالقرب من موقع التكييف، ولكن بعيداً عن فتحة أنبوب العادم حيث سيتم تدريب النحل. بعد ذلك، قم بتحضير محفز التكييف أثناء العمل داخل غطاء سحب الغازات (hood).

استخدم رأس ماصة مزوداً بمرشح لسحب أربعة 4 µL من زيت القرنفل ووضعها على ورقة ترشيح مستديرة. ضع ورقة الترشيح المعطرة داخل محقنة سعة 20 mL ثم أدخل المكبس. اضبط مشغل الصوت الذي سيصدر إشارة صوتية للمجرب.

يضمن ذلك التوقيت الدقيق للمحفز، وبداية المحفز، ونهايته، ومدته، وموضعه. استعد لتسجيل سلوك النحلة طوال فترة الإشراط. تُمنح درجة موجبة إذا قامت النحلة بمد الـ SSIS بين بداية المحفز الشرطي وتقديم المحفز غير الشرطي.

عبور خط افتراضي بين الفكوك المفتوحة لبدء تجربة اكتساب، اختر النحلة المراد تدريبها وضعها أمام مخرج الهواء لمدة 10 ثوانٍ. وقبل نهاية هذه الفترة الزمنية البالغة عشر ثوانٍ بوقت قصير، ضع المحقنة التي تحتوي على الرائحة على بُعد ثلاثة سنتيمترات من قرون استشعار النحل. قم بتقديم الرائحة على مدى خمس ثوانٍ عن طريق دفع 20 milliliters من الهواء عبر المحقنة.

بعد ثلاث ثوانٍ، يتم تقديم المثير غير الشرطي عن طريق لمس الجزء البطني من السوط القاصي في كلتا قرني الاستشعار باستخدام عود أسنان مبلل بمحلول السكروز. ومع الحرص على عدم ترسيب المحلول على النحل أو قرون الاستشعار، يُسمح للنحلة بعد ذلك بلعق عود الأسنان. يستمر هذا المثير المركب لمدة أربع ثوانٍ، ثم يتم إخراج النحل من سياق التدريب وإعادته إلى الحامل.

تستمر تجربة تدريبية واحدة لمدة 28 ثانية، وذلك بعد 13 ثانية من تقديم المثير الشرطي. أعد النحلة إلى موقع التدريب بعد فترة فاصلة بين التجارب مدتها 10 دقائق. قم بإجراء التجربة الثانية من أصل ثلاث تجارب كما هو موضح سابقاً، وانتظر 10 دقائق إضافية قبل إجراء الاقتران النهائي.

بعد اكتمال التدريب لهذا اليوم، أعد الرفوف إلى الوعاء. تذكر تغذية كل نحلة أربع مرات بقطرة واحدة بحجم 4 µL من محلول السكروز بين الساعة 4:00 و6:00 مساءً. وكما تم توضيحه سابقاً، يمكن إجراء اختبارات الاستبقاء في أي فاصل زمني يتراوح من دقائق إلى أيام بعد التدريب. استعد لاختبار الذاكرة بوضع رف النحل بالقرب من موقع الإشراط لمدة 30 دقيقة.

ابدأ الاختبار بوضع نحلة أمام مخرج العادم لمدة 10 ثوانٍ. قدّم المثير الشرطي لمدة خمس ثوانٍ وسجل حدوث استجابة PER. بعد اكتمال الاختبار لهذا اليوم، أعد الرفوف إلى الوعاء.

تذكر إطعام كل نحلة أربع مرات باستخدام قطرة واحدة بحجم 4 µL من محلول السكروز بين الساعة 4:00 و6:00 مساءً كما تم توضيحه سابقاً؛ وفي نهاية التجربة بأكملها، تحقق من أن النحلة لا تزال قادرة على بسط خرطومها عن طريق لمس قرن استشعار بمحلول SRAs ليتم إدراجها في التحليل، ويجب أن تنجو النحلات طوال فترة التجربة وأن يكون لديها PER سليم. في بعض الدراسات، تُستخدم الحقن الجهازية لدراسة تأثير التدخلات الدوائية على الذاكرة الشمية، ويمكن إعطاء هذه الحقن في أوقات مختلفة بناءً على تصميم التجربة.

للبدء، اصنع ثقباً صغيراً في القشيرة في الجزء الخلفي من S scootin بالقرب من شق S scootle فوق عضلة الطيران، وذلك باستخدام إبرة تحت الجلد مخصصة للاستخدام مرة واحدة. بعد ذلك، املأ أنبوباً شعرياً زجاجياً بمقدار 1 µL من المحلول المراد اختباره. أدخل الأنبوب الشعري في الثقب الموجود في القشيرة واحقن المحلول في عضلة الطيران.

يستطيع المجربون المدربون حقن B واحدة كل 30 ثانية، مما يسمح بتوقيت دقيق للحقن والاشتراط. يتم عرض تجربتين هنا؛ حيث تبحث التجربة الأولى في تأثير الحقن الجهازي للمحلول الملحي الذي يتم إعطاؤه قبل التدريب على تعلم الذاكرة.

توجد ثلاث مجموعات في هذه الدراسة: المجموعة (أ) التي لم تتلقَ أي علاج، ومجموعة تلقت حقناً جهازياً بحجم 1 µL من المحلول الملحي المُنظم بالفوسفات، ومجموعة وهمية. تم إعطاء هذه العلاجات قبل 30 دقيقة من التدريب الموضح هنا على اليسار. وقد ازدادت نسبة الحيوانات التي أظهرت الاستجابة الشرطية أثناء مرحلة الاكتساب عبر تجارب التدريب الثلاث، مع عدم وجود فروق بين المجموعات.

توضح الرسوم البيانية العمودية على اليمين أن حقن PBS أو الإصابة الوهمية لم تؤثر على استبقاء الذاكرة. بعد 24 ساعة من التدريب في التجربة الثانية، أُعطيت الحقن بعد 40 دقيقة من التدريب، حيث قُسمت النحل إلى مجموعتين، تلقت إحداهما محلولاً ملحيًا وتلقت الأخرى 1 µL من مثبط تخليق البروتين Anisomycin. وتظهر الرسوم البيانية العمودية على اليمين انخفاضاً واضحاً في استبقاء الذاكرة لدى النحل الذي تلقى Anisomycin. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية تخليق البروتين في تكوين الذاكرة الشمية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء تسجيلات كهرومغناطيسية وكهربية حيوية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هو الأساس الفيزيولوجي العصبي للتعلم وتكوين الذاكرة بعد تطورهما؟ وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث التعلم والذاكرة لاستكشاف الآليات الجزيئية والفيزيولوجية العصبية في تكوين الذاكرة لدى نحل العسل.