آغار بلوك عوالم مصغرة لتحليل الأنسجة النباتية الخاضعة للرقابة من قبل الفطريات الهوائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تلقيح فطر هوائي محلل للخشب في نموذج مصغر (microcosm) داخل طبق بتري، حيث يتم التحكم بدقة في رطوبة الخشب والركائز الخارجية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير النماذج المصغرة بأحجام دقيقة من أوساط معروفة. بعد ذلك، يتم تجميع الخشب المراد تحليله وأي ركائز صلبة خارجية فوق شبكة بلاستيكية على سطح الآغار دون السماح بالتلامس بين الركائز.

يتم بعد ذلك تلقيح النظام البيئي المصغر وحضنه مع الفطر المختبر. وبعد انتهاء فترة الحضن، يتم جمع الكتل الخشبية لتحديد الفقد في الكتلة وتجهيز الأنسجة لإجراء التحاليل. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح درجة التحلل الحيوي للخشب ودور مصادر العناصر الخارجية من خلال قياسات الفقد في الكتلة، وملاحظات مورفولوجيا الغزل الفطري، والتحاليل العنصرية المستهدفة مثل مطيافية البلازما المقترنة حثيًا.

مرحباً، اسمي بروك جاكوبسون من مختبر الدكتور جوناثان شيلينج في قسم هندسة المنتجات الحيوية والنظم الحيوية بجامعة مينيسوتا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستخدام أطباق بيتري كبيئات دقيقة لتحلل الأنسجة النباتية بواسطة الفطريات الهوائية. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة آليات تحلل lignocellulose الفطري.

الليغنوسليلوز هو نسيج نباتي يتكون من الليغنين والسليلوز والهيميسليلوز. والنسيج الذي ندرسه في أغلب الأحيان هو الخشب؛ حيث تعد الأخطاء في الجوانب الأقل تقنية لتصميم كتلة المثقاب من أكثر أسباب الفشل شيوعاً والمصادر الرئيسية للتباين بين الدراسات، مما يجعل النشر المرئي لإعدادات كتلة المثقاب الخاصة بنا أمراً مفيداً. ونحن نعلم من خلال الخبرة أن هذا الإجراء يعطي نتائج عالية الجودة ومنخفضة التباين.

دعونا نبدأ. لهذه التجارب، استخدم أطباق بتري تكون أكثر عمقاً بسنتيمتر واحد من أطباق بتري النموذجية لزيادة المساحة الفارغة فوق الكتلة الخشبية في النظام البيئي المصغر.

ابدأ بتحضير البيئة الدقيقة عن طريق تحضير وسط غذائي كافٍ لملء 20 ملليلتر لكل طبق بتري يكون خالياً من الكالسيوم والحديد. أضف الآجار بمقدار 15 جراماً إلى دورق قياسي سعة 500 ملليلتر يحتوي على 400 ملليلتر تقريباً من الماء منزوع الأيونات المضاف إليه المكملات. استخدم المحاليل المخزنة التي تم تحضيرها مسبقاً لإضافة العناصر الغذائية الدقيقة إلى الخليط.

بمجرد إضافة العناصر الغذائية، املأ الدورق الحجمي حتى خط 500 milliliter. بعد ذلك، انقل الوسط الغذائي إلى دورق سعة 1000 milliliter. ثم قم بالتعقيم باستخدام الموصدة (autoclave) عند 121 degrees Celsius و16 PSI لمدة 20 minutes.

احرص على عدم تجاوز حجم 500 milliliters لكل دورق لتجنب تصلب agri قبل توزيع أطباق الاختبار. بعد التعقيم بالبخار، اترك الوسط يبرد حتى يصبح ملمسه بارداً لتقليل التكثيف. يعد تقليل الرطوبة أمراً بالغ الأهمية في هذه التجارب، حيث يتم التعبير عنها بمحتوى الرطوبة أو mc.

سيؤدي تركيز يتجاوز 80% إلى حدوث نقص أكسجة في الأنسجة. قلل من التحلل بواسطة الفطريات الهوائية وزد من التباين مرة واحدة. برد. استخدم مساعد ماصة محمول وماصات بولي ستيرين معقمة سعة 10 milliliter لضمان التعقيم.

انقل الآجار إلى مجموعة من الأطباق المرصوصة عمودياً داخل كابينة السلامة الحيوية. بعد ذلك، قص شبكات بلاستيكية بكمية كافية لتناسب قيعان الأطباق. بعد القص وغسل الشبكات جيداً بالماء والصابون، جهز الشبكات للتجفيف والتعقيم بالـ autoclave من أجل هذا العرض التوضيحي.

يُستخدم الصنوبر الأصفر الجنوبي (SYP) لكونه يمثل مصدراً هاماً للأخشاب. في المساكن السكنية في الولايات المتحدة، استخدم أخشاباً غير معالجة وقم بقطع كتل خالية من العقد بمقاس 19 × 19 مليمتر من قطع طولي واحد على طول اتجاه الألياف. قم بتقطيع هذا الطول إلى مكعبات بمقاس 19 مليمتر مكعب.

قم بشطر المكعبات التي يبلغ حجمها 19 millimeter cubed إلى نصفين على طول اتجاه الألياف باستخدام إزميل ومطرقة بدلاً من المنشار. يهدف ذلك إلى جعل إحدى حواف المكعب الخشنة متجهة للأسفل على الشبكة البلاستيكية في النموذج المصغر للكتلة الزراعية (agri block microcosm)، بينما تظل الحافة العلوية ملساء لغرض وضع العلامات. ضع علامات على الحافة الملساء للمكعبات باستخدام قلم رصاص، وقم بقطع عدد كافٍ من المكعبات لتلبية متطلبات المعاملات، بالإضافة إلى مجموعات الضبط غير الملقحة التي ستعمل كمراقب للتلوث وعينات بيانات أساسية يتم تهيئتها بالتوازي للمواد المجففة في الفرن؛ ثم ضع العينات في أطباق ألومنيوم مخصصة لمصل اللبن وفي فرن حمل حراري عند 100 degrees Celsius لمدة 48 ساعة.

انقل العينات من الفرن إلى المجفف لتبريدها. قم بوزن العينات مسبقاً لتحديد الوزن الأولي للجفاف بالفرن. وأخيراً، جهز العينات بما في ذلك الشبكات البلاستيكية والخشب للتعقيم بالبخار (autoclave) عن طريق لفها بإحكام بورق القصدير لتقليل البلل.

لا يتطلب هذا تغليف كل عينة على حدة، بل يتطلب أن يكون التعرض للبخار منخفضاً ومتسقاً. يتم تعقيم العينات المصنفة في جهاز الأوتوكلاف عند 121 درجة Celsius وضغط 16 PSI لمدة ساعة واحدة. وفي كابينة سلامة بيولوجية معقمة، يتم تجهيز أجهزة AE فارغة، ولوح مصدر للمواد الخارجية لركيزة نبات شبكة اللقاح، وقلم تحديد، وشرائط بارافورم، وملقط، وأدوات نقل.

تتمثل الخطوة التالية من التلقيح في إضافة المكونات إلى أطباق بتري الزراعية لتقليل مخاطر التلوث. قم بتعقيم أدوات النقل والملاقط باستخدام اللهب وكحول الإيثانول 95% عند استخدامها. أولاً، أضف الشبكة البلاستيكية إلى طبق بتري.

ثم أضف ركيزة الخشب هنا. يتم إضافة قطعتين خشبيتين على طول الشبكة بحيث يمكن إقران البيانات من الحصاد المبكر والمتأخر. تُضاف هذه القطع جنباً إلى جنب بحيث تكون الألياف مواجهة لنقطة مصدر اللقاح الفطري.

بعد ذلك، قم بإضافة المواد الخارجية. هنا، يتم اختبار دور الجبس في التحلل الناتج عن فطر خيطي. لذلك، يجب أن يواجه الفطر أقراص الجبس هذه قبل الوصول إلى الخشب.

يتم إضافة قرص واحد من الجبس بين كل كتلة ونقطة تلقيح فوق الشبكة. يجب الحرص على تجنب التلامس بين الأقراص داخل الخشب مع إبقائها متقاربة من بعضها البعض. وبالنسبة للقاح الفطري، استخدم مثقاب فلين مقاس 4 بقطر 7 mm لعمل سدادات من مستنبتات عمرها أسبوعان نمت في 20 mL من الآجار.

يساعد ذلك في التحكم في حجم اللقاح. بالنسبة للمجموعات الضابطة غير الملقحة، يفضل إضافة سدادة من طبق معقم. تجنب حدوث تلامس بين اللقاح وبين الركائز الخارجية أو الخشب، ولكن ضعهم بالقرب من بعضهم البعض.

استخدم سدادة لقاح واحدة لكل كتلة. أغلق الأطباق باستخدام شريط "بارام" (param) مقطوع بشفرة حلاقة، مع الإبقاء على الأطباق في وضع أفقي ولف شريط "بارام" بحركة سلسة ومستمرة. وأخيراً، قم بتدوين البيانات على أغطية الأطباق باستخدام قلم تحديد مقاوم للكحول، مع كتابة أرقام الكتل مباشرة فوق الركائز المقابلة لها.

قم أيضاً برسم دوائر فوق أقراص الجبس. انقل الأطباق بعناية إلى حاضنة بيولوجية لتجنب اهتزاز المحتويات وللحد من التكثف الناتج عن تقلبات درجات الحرارة. الظروف المستخدمة هنا هي 20 degrees Celsius وفي الظلام، وقم بإجراء عمليات الحصاد في سلسلة زمنية بطريقة معقمة باستثناء الحصاد الأخير.

عند نقطة الحصاد في الأسبوع الخامس، قم بإزالة مجموعة المعالجة بأكملها. رش كل جانب سفلي وعلوي بـ 70% ethanol واستخدم ملقطاً معقماً باللهب لإزالة المواد داخل كابينة السلامة البيولوجية. التقط صوراً قبل إتلاف أطباق الزراعة، مع التركيز على أي morph F أو شمام.

ثم قم بإزالة الكتل المراد معالجتها. قم بدحرجة أي فائض من الـ pha، مع الحرص على عدم فقدان أي من المواد المتحللة. جفف الكتل في أطباق من الألومنيوم وحدد مقدار فقدان الكتلة باستخدام الأوزان الطازجة والجافة للعينات الضابطة لمراقبة حدوث أي امتصاص مفرط للسوائل.

تساعد بيانات فقدان الكتلة في تقدير مدى تقدم التحلل وتُعد بيانات مهمة. وإذا كان المطلوب حساب التركيزات العنصرية على أساس الوزن بالجرام، فيجب تطبيع بيانات النسبة المئوية. ولأغراض الإحصاء، قم بتمييز وتتبع أي كتل بنية داكنة، والتي تكون مشبعة بالمياه بشكل واضح.

أخيراً، يتم إتلاف المزارع في أكياس قابلة للتعقيم بالـ autoclave، مع الاحتفاظ بالشبكة البلاستيكية الداعمة وأي مكونات أخرى يمكن إعادة تدويرها لاستخدامها في تجارب مستقبلية. وبالاستعانة بتصميم النموذج المصغر لكتلة الزراعة (agri block microcosm)، تستقر كتل خشب الصنوبر على شبكة بلاستيكية لرفع الكتل فوق نقطة التلامس الزراعي. وقد نمت فطريات Circular Crains بالتلامس المباشر مع أسطح الجبس وداخل الكتل الخشبية.

يمثل هذا الميسليوم رابطاً هاماً بين الخشب ومصادر العناصر الغذائية الخارجية. ويكمن الميزة الرئيسية لتصميم الكتلة الزراعية (agri block) مقارنة بتصميم كتلة التربة في التحكم في مصادر هذه المواد الخارجية في الآجار أو المواد الصلبة؛ حيث يظهر هنا متوسط النسبة المئوية لفقدان الوزن كمقياس لمدى تحلل الخشب بواسطة ser crain's بعد خمسة و15 أسابيع من الحضن مع خشب الصنوبر في نماذج مصغرة من الكتل الزراعية.

لم يتم تطبيق أي معالجات. أضيف كلوريد الكالسيوم بتركيز 5 millimolar إلى الآجار، مع استخدام جبس بنقاء أكبر من 99% أو جبس معدل بـ 1% من الحديد؛ وبالنسبة لكل حصاد، فإن الأشرطة التي تحمل نفس الحرف لا تختلف جوهرياً. ومع تمثيل أشرطة الخطأ للانحراف المعياري، لوحظ فقدان في الوزن بنسبة أكثر من 60% في كتل الصنوبر المتعفنة بنياً (مجموعة الضبط)، وهو ما يحقق الهدف المعياري للجمعية الأمريكية لاختبار المواد المتمثل في تحلل بنسبة أكبر من 50%.

بلغ متوسط معامل الاختلاف في التحلل 0.055 في الأسبوع 16. وبالإضافة إلى انخفاض التباين، لوحظ وجود تأثير للعلاج؛ حيث تم تثبيط التحلل الفطري بإضافات الكالسيوم، سواء تمت إضافته إلى الآجار على هيئة كلوريد الكالسيوم أو على هيئة جبس نقي.

ومن المثير للاهتمام أن معدلات التحلل ترتفع مجددًا مع إضافة الحديد إلى الجبس، مما يشير إلى أن الحديد وليس الكالسيوم هو العامل الحاسم عند ملاحظة المكررات الخمس في الأسبوع 15 من التحلل. وبالمثل، وفي فطر اختبار العفن البني، تكشف الصفائح الدائرية ولون الميسليوم عن المين.

وُجدت اختلافات في الخيوط الفطرية الخارجية بين المعاملات، حيث أُزيلت القطاعات وجُففت. وهو ما أظهر غياب الخيوط في المعاملة الخالية من الكالسيوم، وظهور اللون الأصفر في معاملات الكالسيوم النقي، والمظهر الصدئي في المعاملة المضاف إليها الحديد.

تمثل مجموعة الضبط الكتل غير الملقحة لأغراض المقارنة. ومن المثير للاهتمام أن التأثيرات الرئيسية تتلاشى عند استخدام وسط غذائي غني بالحديد. وبشكل جماعي، يشير ذلك إلى أن هذا الفطر يستخدم الحديد وليس الكالسيوم.

في هذه المواد، عرضنا لكم كيفية استخدام إعداد كتلة المثقاب لاختبار التحلل الحيوي للأنسجة النباتية بواسطة الفطريات الخيطية الهوائية بنجاح. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر منع الركائز من ملامسة بعضها البعض، خاصة الأنسجة النباتية والمثقاب، وتقليل محتوى الرطوبة من المثقاب والصفائح، والتأكد جيداً من عدم تزحزح محتويات كل صفيحة قبل الحضن. من خلال مراعاة هذه المتغيرات، يمكنك التحكم في بيئة التحلل بشكل أفضل بكثير مما يمكنك فعله عند استخدام إعداد كتلة التربة.

يمكنك توليد بيانات بقوة إحصائية كافية للإجابة على أسئلة بحثك. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.