نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل

تُعد الفيروسات ألفا (Alpha viruses) فيروسات RNA ينقلها البعوض، وتصيب خلايا البعوض القابلة للإصابة بشكل مستمر مع حدوث أدنى قدر من الاعتلال الخلوي. يوضح هذا البروتوكول فائدة أنظمة نقل الفيروسات ألفا المعدية التي تعبر عن مراسلين فلوريين للكشف عن إصابة النواقل وانتقال الفيروس. أولاً، يتم تغذية إناث البعوض بوجبة دم تحتوي على فيروس ألفا المراد دراسته، ثم يتم تحديد كفاءة إصابة البعوض، واختيار البعوض الذي يعبر عن الجين الواسم فقط.

بعد ذلك، يتم جمع اللعاب من البعوض المصاب وإثبات القدرة على الانتقال عن طريق إصابة خلايا البعوض المستنبتة باللعاب الذي تم جمعه. يتم الحصول على النتائج باستخدام المجهر الفلوري. يتم تصور تقرير لبروتين مثل GFP وبذلك يتم تتبع عدوى الناقل وانتقال الفيروس بواسطة أنواع البعوض من فصيلة Aedes أو Culex.

يمكن استخدام أنظمة تعبير فيروسات ألفا (Alpha virus expression systems) أو أنظمة ATS لتقييم التعبير الجيني والبعوض الناقل بسرعة، وذلك في دراسات الفيروسات المنقولة بالمفصليات (arbovirus) وكذلك قبل إجراء تلاعبات أكثر تعقيداً في البعوض، مثل التعديل الوراثي للبعوض (mosquito transgenesis). سيقوم بشرح هذه الإجراءات كل من د. إيرما سانشيز فارغاس، ود. إريك موسيل، وآرون فيليبس من مختبر د. كين أولسون. ومن أجل إنتاج فيروس TS في خلايا Bhk 21، استخدم فيروساً مأشوباً من نوع symbis يعبر عن المراسل GFP بعد عملية النسخ في المختبر (in vitro transcription)، ثم قم بنقل RNA الخاص بنظام تحويل فيروس ألفا الجينومي إلى خلايا bhk 21 عن طريق التثقيب الكهربائي (electro rate).

بعد ذلك، قم باستعادة الفيروس وتكثيره قبل عملية العدوى. هيئ البعوض للتغذية الدموية الفعالة من مغذٍ اصطناعي عن طريق الحرمان من الغذاء؛ حيث يتم إزالة السكر قبل 24 ساعة والماء قبل 12 ساعة من عملية التغذية.

امزج دماً حيوانياً تم الحصول عليه تجارياً ومزال منه التجلط أو مضاف إليه السترات مع معلق فيروس TS المشتق من زراعة الخلايا المعدة مسبقاً، وذلك لضمان عدوى فعالة للمعي المتوسط في البعوض. قم بتحضير عيار فيروسي بتركيز 10⁷ وحدة مكونة للبقع لكل ملليلتر في وجبة الدم لتحفيز البعوض على الامتلاء. أضف TP ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.02 molar.

ضع غشاءً معوياً مسامياً فوق فوهة وحدة التغذية الزجاجية ذات الغلاف المائي. بعد ذلك، قم بتجهيز وحدات التغذية باستخدام مياه جارية بدرجة حرارة 37 degrees Celsius. ثم انقل الوجبة بواسطة الماصة إلى الحجرة وضع وحدات التغذية بإحكام فوق الكرتون.

بعد تغذية البعوض لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة، يتم فرز البعوض المخدر بالتبريد لاختيار العينات الممتلئة بالدم للسماح بتكاثر وانتشار فيروس TS في البعوض المختار. تُحضن الحشرات عند درجة حرارة 28 °C ورطوبة نسبية 75% لمدة تتراوح من ثمانية إلى 10 أيام، وذلك من أجل تثبيت البعوض.

ضع الكرتونة التي تحتوي على الورق في درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة تقريبًا. الآن، انقل من 5 إلى 10 بعوضات إلى طاولة تبريد مهيأة للاستخدام مع مجهر فلوري. افحص البعوضات وصنفها بناءً على وجود أو غياب الفلورية.

أعد البعوض المختار إلى الكرتون الورقي لاستخدامه حسب الرغبة. وفي هذه المرحلة، حدد كفاءة العدوى باستخدام شدة الفلورية كمؤشر. وأخيرًا، قم بتشريح الأنسجة مثل الأمعاء المتوسطة، وغدد SIV، والأجسام الدهنية، وراقب وجود الفلورية.

يمكن تشريح هذه الأعضاء والأنسجة في أوقات أبكر إذا رغبنا في ذلك. احرم البعوض من مصدر السكر لمدة 24 ساعة قبل التغذية. جهز أنبوبًا شعريًا سعة 50 microliter تم تسخينه وسحبه وقصه، مع وضع من ثلاثة إلى خمسة microliters من Cargill.

ضع زيت الغمر من النوع B لضمان عدم هروب البعوض. قم بإزالة أرجلها وأجنحتها. الآن، أدخل الخرطوم في الأنبوب.

راقب بعناية قطرات اللعاب التي تفرز من الخرطوم في زيت الغمر. إذا لزم الأمر، ضع قطرة من pilocarpine بتركيز 1% على صدر البعوضة لزيادة إفراز اللعاب. بعد 60 إلى 90 دقيقة، قم بإزالة البعوض وتخزينه لعزل الفيروسات في المستقبل. والآن لجمع المحلول من الأنبوب الشعري، قم بطرد خليط اللعاب والزيت في أنبوب يحتوي على 500 µL من 20%F-B-S-P-B-S المعقم.

قم بترشيح اللقاح باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.2 micron، ثم استخدم هذا اللقاح لإصابة الخلايا المستزرعة من خلايا البعوض. يتم تقييم كفاءة الإصابة بفيروس five prime DS MRE 16 GFP عن طريق تعبير GFP. وبمرور الوقت، تم إصابة هذه الخلايا بالفيروس بمعدل تعدد إصابة 0.01 multiplicity of infection.

يتيح مجهر الفلورسنت فوق البنفسجي (epi fluorescence microscope) رؤية الجسم بالكامل لبروتين GFP في البعوضة المصابة، وكذلك في أجزاء الجسم المختلفة هنا بعد 10 أيام من الإصابة. ويُعد التعبير الانتقائي لبروتين GFP في أعضاء معينة مؤشراً على انتشار العدوى. وعادةً ما تحتوي الأمعاء المتوسطة على بؤر عدوى متميزة في وقت مبكر بعد تناول وجبة دم تحتوي على الفيروس، والتي تنتشر لاحقاً في جميع أنحاء الجزء الخلفي من الأمعاء المتوسطة في أوقات لاحقة بعد الإصابة.

يتم الإشارة إلى هذه الأحداث بواسطة المراسلين GFP و DS RED. ويشير اختبار الانتقال إلى أن فيروس five prime DS MRE 16 GFP يعبر عن GFP بشكل مستقر طوال فترة الحضانة الخارجية. وفي البعوضة هنا، يتم الكشف عن GFP في لعاب البعوض في وقت مبكر يصل إلى ثمانية أيام بعد الإصابة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداء البعوض فيروس A TS عن طريق الفم، وكيفية التقييم البصري لإصابة البعوض بالفيروس، وكيفية تقييم انتقال الفيروس من البعوض.