الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية للجيل الثقافات متعلق بالخلايا العصبية التخصيب

مرحباً، اسمي آلان وأنا من مختبر الدكتور Horney Lu في جامعة كاليفورنيا إيرفاين بقسم البيولوجيا العصبية والسلوك. وأنا بوب. اليوم، سيقوم الدكتور Haro بعرض بروتوكول سريع وفعال وموثوق للحفظ بالتجميد الروتيني لكتل الأنسجة القشرية من أجل الاشتقاق اللاحق لمزارع عصبية أولية عالية الجودة.

لنبداً الآن. يتم وضع الأنسجة المنظفة والمقطعة في أنابيب تجميد تحتوي على وسط تجميد TMSO بنسبة 10%.

تُوضع الأنابيب المبردة (Cryo vials) في حاوية تجميد وتُحفظ عند درجة حرارة 80- درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد ذلك، تُنقل الأنابيب المبردة المجمدة إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد. ولغرض الاستزراع، يتم إذابة الأنبوب المبرد في حمام مائي دافئ ويُشطف بمحلول HBSS دافئ لإزالة ما تبقى من DMSO.

يتم إضافة محلول HBSS طازج مع التريبسين من أجل التفكيك، وبعد ذلك يتم إضافة وسط DMM مع 10% EBS. ولإيقاف النشاط الإنزيمي التفكيكي، يتم تدوير الخلايا بالطرد المركزي، ثم يُعاد تعليق الراسب في محلول DMM طازج مضاف إليه 10% EBS وتُزرع الخلايا في أطباق مطلية مسبقاً بالبولي ليسين. وبعد مرور 24 ساعة، يتم استبدال وسط DMM بوسط neuro basal مكمل، وتُترك الخلايا لتنمو لمدة 10 أيام.

يستخدم هذا البروتوكول شفرة حلاقة فولاذية لتقطيع النسيج القشري قبل الاستخدام. يجب تعقيم الشفرة في ethanol بتركيز 70% لمدة ساعتين على الأقل. يتم تحضير محلول ملحي منظم من هانك (HBSS) بتركيز 1x عن طريق تخفيف محلول مركز بتركيز 10x في ماء معقم، ثم يُحفظ محلول 1x HBSS إما على الثلج أو في درجة حرارة 4 °C حتى البدء في معالجة الأنسجة.

يُستخدم ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو DMSO كمادة واقية من التجميد في أوساط التجميد. يستخدم هذا البروتوكول تخفيفاً من DMSO بنسبة 10% حجماً إلى حجم في 1X-H-B-S-S-D-M-S-O، ويجب خلطه تماماً قبل تخزينه عند درجة حرارة 4 °C. وتُستخدم حاوية تجميد من نوع Nalgene للتحكم في معدل تجميد العينات.

يتم تحميل حاوية التجميد بأنابيب تجميد سعة 2.5 milliliter تم وضع الملصقات التعريفية عليها مسبقاً. كما يُنصح بوضع ملصقات تعريفية على حاويات التجميد نفسها إذا كان لديك أكثر من واحدة، مع تدوين الحاوية المقابلة على العينة. يتم نقل وسط التجميد المكون من 10% DMSO المبرد مسبقاً، بالإضافة إلى حاوية التجميد، إلى كابينة سلامة بيولوجية معقمة.

هنا يتم إضافة واحد milliliter من وسط التجميد ببطء إلى كل أنبوب من أنابيب الحفظ بالتجميد. بعد التأكد من إحكام إغلاق الأغطية، توضع حاوية التجميد التي تحتوي على الأنابيب في درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين على الأقل قبل البدء مباشرة في معالجة الأنسجة. يجب شطف شفرة الحلاقة المعقمة مسبقاً بشكل جيد، وذلك من خلال ثلاث غسلات، مدة كل منها ثلاث دقائق.

يجب أن يكون استخدام الماء المعقم كافياً لإزالة أي بقايا من الإيثانول. ينبغي أن تكون عملية الغسل هذه سريعة لأن الشفرة عرضة للأكسدة نتيجة الغمر المطول في الماء المعقم. قبل التنظيف، يجب وضع النسيج على عبوة ثلج.

اشطف قليلاً بمحلول X-H-B-S-S البارد لإزالة أي شوائب عائمة. تُستخدم إبر معقمة لتنظيف قطع الأنسجة من أي أغشية أو أوعية دموية متبقية. يجب توخي الحذر للحفاظ على السلامة البنيوية للأنسجة أثناء التنظيف.

ومع زيادة هذا الأمر، ستكون كفاءة تقطيع الأنسجة المنظفة مختلفة بشكل ملحوظ عن الأنسجة الخام، ويجب إزالة معظم الأغشية أو الأوعية الدموية منها. وبمجرد تنظيف النسيج وشطفه، يمكن البدء في عملية التقطيع. ومن المهم إجراء قطوع نظيفة للنسيج لإنشاء مكعبات يبلغ حجمها حوالي 1 mm³.

تؤدي الكتل الكبيرة جداً إلى خفض إنتاجية الخلايا عند الإذابة. ومع ذلك، يجب تجنب الإفراط في المعالجة عند استخدام الكتل الأصغر. يمكن جمع الأنسجة المقطعة باستخدام ماصة أوتوماتيكية مع إضافة بعض من cool one X-H-B-S-S.

تأكد من شطف الطبق بمحلول HBSS لاستعادة جميع الأنسجة التي تم جمعها. ثم تضاف الأنسجة إلى حجم كبير من محلول 1X HBSS وتترك لتترسب في القاع، مما يؤدي إلى تكوين كريّة رخوة. تعمل هذه العملية على تنظيف أي بقايا قد تكون موجودة؛ وبينما تترسب الأنسجة في محلول HBSS، استخرج حاوية التجميد والأنابيب المبردة (cryo vials) التي تم تبريدها مسبقاً قبل البدء في توزيع الأنسجة.

تأكد من فتح أغطية جميع القوارير لتسريع عملية ملء الأنسجة. يجب ألا يتجاوز وقت تعريض الأنسجة لـ DMSO في درجة حرارة الغرفة 10 دقائق. ويُفضل العمل على حاوية تجميد واحدة في كل مرة حتى يتم استخدام جميع الأنسجة.

ابدأ في سحب السائل الطافي من أنسجة مفككة، وكرات الذرة بالقرب من الراسب قدر الإمكان دون تحريكه. بعد ذلك، قم بتركيب طرف ماصة بفتحة واسعة سعة 200 microliter. لا تستخدم طرفاً بفتحة أصغر لأن ذلك سيؤثر سلباً على بنية الكتل المتجهة إلى قاع راسب كتلة الأنسجة.

اجمع 200 µL من النسيج ببطء. أضف هذا النسيج إلى أنبوبة حفظ بالتبريد واستمر في العملية مع الأنابيب التالية حتى يتم ملؤها جميعاً. قد يتطلب الأمر تطبيق قاعدة الـ 10 دقائق.

ضع حاوية التجميد التي تحتوي على الأنابيب المبردة (cryo vials) بسرعة في مجمد درجة حرارته 80- درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل أو طوال الليل إذا كان الوقت محدوداً. بعد مرور الوقت الكافي، أخرج حاوية التجميد من المجمد وانقل الأنابيب المبردة إلى صندوق تبريد (cryo box) بأسرع ما يمكن. ضع صندوق التبريد في رف صندوق النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.

أخرج أنبوب الحفظ بالتجميد من النيتروجين السائل بأسرع ما يمكن، مع تقليل تعريض صناديق الحفظ بالتجميد لدرجة حرارة الغرفة. قم بإذابة العينة سريعاً عن طريق غمرها في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، مع الحرص دائماً على إبقاء الغطاء فوق مستوى الماء. افحص العينة بشكل متكرر واستمر في عملية الإذابة حتى تلاحظ وجود بلورة ثلج صغيرة.

قبل إدخال الأنبوب إلى كابينة السلامة، قم بتعقيم أنبوب الحفظ بالتجميد باستخدام ethanol بتركيز 70%. ابدأ بإضافة الأنسجة المذابة إلى حجم كبير من HBSS بتركيز 1X دافئ إذا ظلت الأنسجة ملتصقة بجدران أنبوب الحفظ بالتجميد. اجمع الأنسجة برفق باستخدام HBSS.

بمجرد جمع كافة الأنسجة، اقلب الأنبوب من ثلاث إلى أربع مرات واترك الأنسجة تترسب في القاع. تضمن هذه الخطوة تخفيف DMSO بشكل كافٍ.

بمجرد استقرار النسيج، قم بشفط أكبر قدر ممكن من السائل الطافي. ثم أضف 10 milliliters من محلول one X-H-B-S-S الطازج والدافئ إلى ذلك. أضف 300 microliters من 0.25%trypsin و 50 microliters من DNAs.

تابع تفكيك النسيج عن طريق الرج اللطيف، مما يؤدي إلى تكوين معلق خلوي عكر بعد تفكك النسيج. أوقف النشاط الإنزيمي بإضافة DMEM دافئ مضاف إليه 10% bovine serum، ثم قم بطرد مركزي لمعلقات الخلايا عند 1200 G لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كتلة الخلايا في DMEM طازج مضاف إليه 10% EBS وزعها على أطباق مطلية بالبولي ليسين.

اترك الخلايا تلتصق بالأطباق لمدة 30 دقيقة. ثم استبدل الوسط بوسط DM طازج مضاف إليه 10% EBS. وبعد مرور 24 ساعة، استبدل الوسط الذي يحتوي على DM بوسط neuro basal مكمل بـ N two وB 27 واتركها تنمو لمدة 10 أيام.

لقد شرحنا للتو بروتوكولاً شاملاً وفعالاً وموثوقاً للحفظ بالتجميد الروتيني لكتل الأنسجة القشرية. نتمنى لكم التوفيق.